Cellule étiquetage et l'injection dans le développement embryonnaires coeurs de souris

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer l’injection de cellules mortes ou d’ADN dans des cœurs de souris embryonnaires. Afin d’étudier la graisse cellulaire ou de manipuler localement l’expression des gènes, cela est accompli en disséquant d’abord les embryons d’une souris enceinte et en exposant le cœur embryonnaire. Ensuite, un colorant ou des cellules d’ADN sont injectés dans la région d’intérêt ciblée dans le cœur.

Ensuite, après l’incubation de l’embryon, le cœur est retiré et placé en culture. Enfin, le devenir des cellules injectées ou marquées est déterminé par microscopie. En fin de compte, le devenir des cellules injectées, marquées ou génétiquement modifiées est surveillé par microscopie confocale ou microscopie à lumière et à épifluorescence, révélant l’importance fonctionnelle de gènes et de cellules spécifiques au cours du développement cardiaque.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la transgenèse chez la souris, est que nous pouvons injecter localement et précisément des cellules de laboratoire ou modifier génétiquement des cellules in vivo. Cela permet d’étudier ces cellules dans l’environnement approprié. La démonstration de cette procédure sera faite par moi-même et Emily aar, une doctorante d’un laboratoire.

Après avoir préparé l’équipement, les réactifs et les solutions, conformément au protocole textuel, prélever des embryons E 9.5 et E 10.5 d’une souris enceinte euthanasiée en utilisant d’abord de l’éthanol à 70 % pour stériliser la poitrine, faire une incision ventrale médiane pour ouvrir l’abdomen et récupérer la corne utérine avant de la transférer dans du PBS à température ambiante. Après deux lavages supplémentaires dans du PBS, transférez-le dans une boîte de Pétri remplie de silicone. Avec le milieu M 16, utilisez des épingles à insectes pour épingler la corne utérine à la couche de silicone de sorte que le côté vascularisé de l’utérus se trouve en dessous.

Ensuite, utilisez des pinces fines pour couper la surface de l’utérus et coiffez les feuillus à un millimètre sous la surface. Étalez les parois de la décidua et récupérez doucement l’embryon dans le sac vitellin. Conservez-le dans un milieu M 16 à 37 degrés Celsius avant l’injection cellulaire pour effectuer les injections.

Tout d’abord, utilisez une seringue Hamilton pour remplir une pipette en verre par l’arrière avec de l’ADN ou des cellules, et secouez la pipette pour éliminer les bulles. Au niveau de la pointe, placez la pipette sur le support de micro-injection et réglez l’injecteur selon les paramètres suivants. Ensuite, épinglez l’embryon au fond en silicone à travers le sac vitellin sans toucher l’embryon proprement dit.

Identifiez ensuite la région du cœur et ouvrez le sac juste au-dessus de cette région. Ajoutez quatre broches autour de l’embryon pour éviter tout mouvement lors de l’injection de cellules. À l’aide du micromanipulateur réglé sur manuel, positionnez lentement la pointe de la pipette à un angle de 45 degrés au-dessus du péricarde, juste au-dessus de la région du cœur à injecter.

Déplacez la pipette dans la zone d’intérêt, déclenchez l’injection et retirez la pipette le plus rapidement possible. Assurez-vous que le cœur bat correctement après l’injection d’ADN ou de cellule En utilisant le protocole d’injection décrit dans cette vidéo pour étudier la transition épithéliale à mésenchyme, et E 9.5 Un explan VC a été injecté avec un S-H-R-N-A qui régule à la baisse une protéine nécessaire à la transition mésenchymateuse endothéliale des cellules endocardiques. De même, des cellules endothéliales prévalvulaires dérivées de cellules HUES exprimant la GFP sous le contrôle du promoteur SOX neuf ont été injectées dans le VC A à E 10,5, suivies de 48 heures de culture cardiaque explantée.

Ces cellules acquièrent des marqueurs de l’EMT, tels que la périostine, similaires aux cellules endocardiques endogènes. Les approches ex vivo démontrées ici sont relativement faciles, mais limitées à un suivi maximal à court terme de 48 à 72 heures. Cependant, la procédure d’injection guidée par échographie décrite dans le protocole textuel offre une approche techniquement plus difficile, mais avec la possibilité d’un suivi in utero postnatal long, voire postnatal.

L’injection in utero de colorants ou de vecteurs viraux pour marquer des cellules dans des régions cardiaques spécifiques est présentée ici. Avec cette méthode, un marquage spécifique des cellules épicardiques peut être réalisé avec des colorants fluorescents ou des virus, et la méthode peut être étendue avec des cellules ou des injectables alternatifs. Suivre cette procédure a une méthode comme la culture bryo peut être effectuée afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’effet à long terme d’un gène, d’une molécule ou d’une lecture de longue liste, telle que la morphogenèse tissulaire après son développement.

Cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la biologie du développement cardiaque et de la génétique. Il nous permet d’explorer le monde de nouveaux gènes ainsi que d’étudier le destin des cellules humaines dans le contexte embryonnaire approprié. Ceci est très utile lorsqu’une lignée de souris transgénique n’est pas disponible.