Analyse du développement des cardiomyocytes par immunofluorescence dans le Coeur embryonnaires de souris

L’objectif général de cette procédure est d’évaluer la maturation myomyocytaire et cardiomyocytaire dans le cœur embryonnaire de souris en développement. Ceci est accompli en orientant et en congelant d’abord le cœur embryonnaire dans un milieu de coupe. Ensuite, le cœur est cryosectionné dans la bonne orientation.

Ensuite, les coupes cardiaques subissent un marquage immunofluorescent des protéines d’intérêt. Enfin, une microscopie confocale de coupes cardiaques par immunocoloration est réalisée. En fin de compte, des analyses d’images bidimensionnelles et tridimensionnelles sont utilisées pour montrer le développement de MyFi et d’autres structures cardiomyocytaires.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement cardiaque, telles que la façon dont les mutations et les gènes cardiaques affectent l’assemblage de MyFi et l’émergence de structures spécifiques telles que les disques interactifs et les clients. Pour congeler en claquement les cœurs embryonnaires, utilisez une température de coupe optimale ou un milieu OCT pour remplir une boîte de Pétri de 3,5 centimètres dans une hotte chimique. Refroidir. Deux méthylbutane dans de l’azote liquide.

Après avoir isolé les cœurs embryonnaires de souris selon le protocole de texte, placez les cœurs dans l’OCT et laissez-les s’équilibrer pendant plusieurs secondes avant de les transférer dans un moule de sept millimètres contenant de l’OCT. Orientez la paroi intérieure du cœur vers le bas du moule. Placez délicatement le moule dans les deux méthylbutane refroidis à l’azote liquide.

Veillez à ne pas laisser les deux liquides de méthylbutane toucher l’OCT ou le cœur geler jusqu’à ce que l’OCT soit blanc solide. Transférez ensuite le moule dans un seau à glace contenant de la glace sèche. Une fois que tous les cœurs sont congelés, enveloppez les moules cryogéniques dans du papier d’aluminium et stockez-le à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt pour la cryosection.

Pour fixer les cœurs embryonnaires, utilisez 4 % de PFA dans du PBS pour remplir les puits d’une plaque de culture de 12 feuilles. Après avoir disséqué les cœurs embryonnaires conformément au protocole de texte, placez chaque cœur dans un puits de PFA et fixez-le à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Pour cryoprotéger les cœurs à l’aide d’une pipette de transfert en plastique, déplacez chaque cœur dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre contenant 1,5 millilitre de 15 % de saccharose dans du PBS et agitez doucement à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que le cœur coule au fond du tube. Transférez chaque cœur à 30 % de saccharose dans PBS et agitez doucement à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que le cœur coule au fond du tube.

Congelez les embryons dans l’OCT comme démontré plus tôt dans cette vidéo. Après avoir placé les moules cryogéniques dans la chambre du cryostat et égalé à moins 17 degrés Celsius, inversez le moule cryogénique et utilisez une légère pression pour expulser le bloc cardiaque du moule. Orientez la paroi antérieure du cœur vers le haut du bloc de tissu moulé.

Placez une grosse goutte d’OCT sur le mandrin et montez le bloc de cœur sur la goutte OCT. Maintenir l’orientation de telle sorte que la paroi antérieure du cœur soit la plus éloignée du mandrin. Laissez le cœur geler sur le mandrin.

Chargez le mandrin et le bloc cardiaque monté sur le support d’objet du cryostat. Ajustez de manière à ce que l’angle de la lame soit de trois à cinq degrés par rapport à l’échantillon. Collectez des coupes de 10 micromètres sur des lames de microscope qui ont été prétraitées avec un revêtement chargé positivement.

Laissez les échantillons sécher complètement avant de les stocker à moins 80 degrés Celsius pour effectuer l’immunofluorescence. Après avoir fixé et/ou retiré l’OCT des sections, utilisez un tampon de blocage dilué dans du PBS pour bloquer pendant 45 minutes en secouant doucement. Si vous utilisez un anticorps primaire généré chez la souris, ajoutez un fragment de FAB monovalent IgG H plus L d’âne ou de chèvre dilué un à 100 dans du PBS 0,1 % entre 20 et incubez à température ambiante pendant 45 minutes en secouant doucement.

Ajouter l’anticorps primaire ou les anticorps dilués dans un tampon de blocage et incuber pendant deux heures à température ambiante ou à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Après l’incubation, utilisez un XPBS pour laver les sections trois fois pendant 10 minutes. À température ambiante, l’anticorps secondaire conjugué de l’addor est dilué de un à 500 dans un tampon de blocage pour les échantillons et incubé à l’abri de la lumière pendant deux heures.

À température ambiante, utilisez un XPBS pour laver les sections à température ambiante trois fois pendant 10 minutes à l’abri de la lumière. Montez les diapositives sur un support anti-décoloration en plaçant deux gouttes de support à chaque extrémité de la diapositive et utilisez une lamelle pour couvrir. Utilisez du vernis à ongles pour sceller les lamelles.

Conservez-le à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière jusqu’au moment de prendre des images. À l’aide d’un objectif quatre x et d’une fluorescence laser, trouvez l’échantillon et la zone d’intérêt. Capturez l’image à utiliser comme carte.

Lors de l’imagerie à fort grossissement. Retirez la diapositive en effectuant des ajustements minimaux sur la platine de la diapositive. Passez ensuite à un objectif d’immersion dans l’huile 60x.

Placez une petite goutte d’huile sur l’objectif et replacez la glissière sur la platine de la diapositive. Ensuite, trouvez à nouveau l’échantillon, réglez le temps d’exposition à la puissance laser et le binning aux niveaux souhaités pour chaque canal. Une fois que les paramètres optimaux sont déterminés conformément aux directives du protocole textuel, utilisez les paramètres d’échantillon pour toutes les coupes de tissus de l’expérience.

Utilisez l’histogramme d’intensité pour noter la plage d’intensité optimale pour chaque canal, qui sera utilisée pour l’analyse. Générez un Zack à l’aide de la fonction d’acquisition en sélectionnant les canaux laser appropriés. Choisissez ensuite les limites supérieure et inférieure de la pile Z.

Choisissez une taille de pas Zack qui correspond à la moitié de la valeur de l’épaisseur de la tranche optique fournie par le logiciel. Cliquez sur Exécuter pour collecter les images à l’aide de Fidji ou d’un programme comparable pour l’analyse d’images. Ouvrez le fichier Zack avec une option de mode colorimétrique personnalisé et les canaux sont divisés en fenêtres distinctes.

Dans le menu déroulant de l’image, ouvrez l’outil Ajuster le contraste de luminosité et, dans chaque canal, définissez la plage d’intensité optimale de l’histogramme. Comme déterminé précédemment, appliquez ces plages de canaux à tous les Zacks analysés. Ensuite, à partir de la couleur de l’image, menu déroulant, fusionnez les canaux individuels en une seule image composite.

À l’aide du menu du projet Piles Z d’image, créez une pile Z aplatie à partir de l’image composite. Étant donné que cette image sera nettement plus lumineuse que l’image 3D, ajustez la plage d’intensité de l’histogramme pour l’échantillon de contrôle afin d’éviter la sursaturation et appliquez les mêmes paramètres à l’aplati expérimental Zack Pour générer une image 3D, choisissez d’abord le menu du projet 3D des piles d’images. Choisissez l’axe x ou l’axe Y de rotation.

Définissez l’espacement des tranches sur le même nombre de microns que la taille de l’étape de la pile Z. Choisissez la rotation totale souhaitée et réglez l’incrément de l’angle de rotation sur un. Ouvrez ensuite la visionneuse 3D d’image J à partir du menu déroulant des plugins.

Choisissez l’affichage de l’image composite générée en tant que volume et définissez le facteur de rééchantillonnage sur un ou deux. Ces figures montrent des résultats typiques pour la co-coloration de différentes protéines dans un cœur congelé, un cœur fixé à l’acétone, l’anticorps contre les disques Z marqués de manière reproductible de l’actinine S alpha, et dans les disques internés avec une spécificité élevée et un fond minimal. L’anticorps contre la protéine de jonction d’adhérence bêta-caténine a lié la membrane des cellules cardiomyocytes et non cardiomyocytes et la colocalisation avec l’actinine SFA s’est produite dans les disques interés présumés à E 16.5 bêta une immunofluorescence de l’intégrine dans le cœur embryonnaire est particulièrement difficile, mais la coloration de l’intégrine bêta un dans ces études a révélé un signal avec la même périodicité que les disques Z marqués à l’actinine SFA, reflétant peut-être la formation d’une clientèle naissante à E 16,5.

À E 12,5, le profil de coloration de l’actinine SFA et de la mycine tropo a montré une périodicité régulière dans les cardiomyocytes trabéculaires compatibles avec les myofibrilles matures dans la zone compacte externe L’actinine SFA était plus ponctuée que linéaire et le signal de la myosine tropo était diffus plutôt que linéaire. On voit ici un cœur embryonnaire fixé PFA E 12.5 marqué pour l’actinine SFA et l’acton filamenteux d’une souris transgénique RFP Ruby d’acte de vie. Le rapport entre l’actine et le bruit de l’AFS a diminué par rapport aux sections de cœur congelées instantanées.

La reconstruction d’images tridimensionnelles a révélé que les MyFi à l’intérieur d’un cardiomyocytes étaient à peu près parallèles les uns aux autres, mais que les cardiomyocytes individuels étaient orientés à des angles variables les uns par rapport aux autres. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’orienter et de cryosectionner correctement les cœurs embryonnaires, ainsi que d’effectuer l’immuno-marquage, la microscopie confocale et l’analyse d’images pour évaluer la maturation de MyFi et de cardiomyocytes pendant le développement du cœur de souris. Admettre.