Analyse du développement des cardiomyocytes par immunofluorescence dans le Coeur embryonnaires de souris

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer la maturation des fibres musculaires et des cardiomyocytes dans le cœur embryonnaire de souris en développement. Cela est réalisé en orientant d'abord le cœur embryonnaire et en le congelant dans un milieu d'inclusion. Ensuite, le cœur est coupé en sections par cryomicrotomie dans l'orientation appropriée.

Ensuite, les sections cardiaques subissent un marquage immunofluorescent des protéines d'intérêt. Enfin, une microscopie confocale des sections cardiaques immunomarquées est réalisée. En définitive, des analyses d'images bidimensionnelles et tridimensionnelles sont utilisées pour illustrer le développement des MyFi et d'autres structures des cardiomyocytes.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement cardiaque, comme la manière dont les mutations et les gènes cardiaques influencent l'assemblage des myofibrilles et l'apparition de structures spécifiques telles que les disques intercalés et les striations. Pour congeler rapidement des cœurs embryonnaires, utilisez du milieu OCT (optimal cutting temperature) afin de remplir une boîte de Pétri de 3,5 centimètres dans une hotte chimique. Refroidissez du 2-méthylbutane dans de l'azote liquide.

Après avoir isolé les cœurs embryonnaires de souris selon le protocole décrit dans le texte, placez les cœurs dans du OCT et laissez-les équilibrer pendant plusieurs secondes avant de les transférer dans un moule de sept millimètres contenant du OCT. Orientez la paroi interne du cœur vers le fond du moule. Placez délicatement le moule dans le deux méthylbutane refroidi à l'azote liquide.

Veiller à ne pas laisser le liquide de méthyle de butane entrer en contact avec le OCT ou le cœur avant que le OCT ne devienne blanc et solide. Transférer ensuite le moule dans un seau à glace contenant de la glace sèche. Une fois tous les cœurs congelés, envelopper les moules cryogéniques dans du papier d’aluminium et les conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu’au moment de la cryocoupe.

Pour fixer les cœurs embryonnaires, utiliser du PFA à 4 % dans du PBS pour remplir les puits d'une plaque de culture de 12 puits. Après avoir disséqué les cœurs embryonnaires conformément au protocole décrit, placer chaque cœur dans un puits contenant du PFA et fixer à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Pour protéger les cœurs par congélation, transférer à l’aide d’une pipette plastique chaque cœur dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre contenant 1,5 millilitre de saccharose à 15 % dans du PBS, puis agiter doucement à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que le cœur coule au fond du tube. Transférer ensuite chaque cœur dans du saccharose à 30 % dans du PBS et agiter doucement à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’il coule au fond du tube.

Congelez les embryons dans l’OCT comme démontré précédemment dans cette vidéo. Après avoir placé les moules cryogéniques dans la chambre du cryostat et attendu l’équilibre à moins 17 degrés Celsius, retournez le moule cryogénique et appliquez une pression douce pour extraire le bloc cardiaque du moule. Orientez la paroi antérieure du cœur vers le haut du bloc tissulaire moulé.

Déposer une grande goutte d’OCT sur le mandrin et y fixer le bloc cardiaque en plaçant la goutte d’OCT. Veiller à ce que l’orientation soit telle que la paroi antérieure du cœur soit la plus éloignée du mandrin. Laisser le cœur geler sur le mandrin.

Placer le mandrin et le bloc cardiaque monté sur le porte-objet du cryostat. Régler de manière à ce que l'angle de la lame soit de trois à cinq degrés par rapport à l'échantillon. Récolter des sections de 10 micromètres sur des lames de microscope prétraitées avec un revêtement chargé positivement.

Laisser les échantillons sécher complètement avant de les stocker à moins 80 degrés Celsius afin de réaliser l'immunofluorescence. Après fixation et/ou élimination de l'OCT sur les sections, utiliser un tampon de blocage 1 x dilué dans du PBS pour bloquer pendant 45 minutes sous agitation douce. Si l'on utilise un anticorps primaire produit chez la souris, ajouter un fragment monovalent FAB de IgG H + L anti-souris provenant de l'âne ou de la chèvre, dilué au 1/100 dans du PBS contenant 0,1 % de Tween 20, et incuber à température ambiante pendant 45 minutes sous agitation douce.

Ajouter l'anticorps primaire ou les anticorps dilués dans un tampon de blocage 1 x et incuber deux heures à température ambiante ou à quatre degrés Celsius toute la nuit. Après l'incubation, utiliser un PBS 1 x pour laver les sections trois fois pendant 10 minutes. À température ambiante, ajouter l'anticorps secondaire marqué ou non, dilué au 1/500 dans le tampon de blocage, aux échantillons et incuber à l'abri de la lumière pendant deux heures.

À température ambiante, utilisez un XPBS pour laver les sections trois fois pendant 10 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. Montez les lames dans un milieu anti-décoloration en déposant deux gouttes de milieu à chaque extrémité de la lame, puis recouvrez avec une lamelle. Scellez les lamelles avec du vernis à ongles.

Conserver à quatre degrés Celsius, à l'abri de la lumière, jusqu'au moment de l'acquisition d'image. À l'aide d'un objectif 4 x et de la fluorescence laser, localiser l'échantillon et la zone d'intérêt. Acquérir l'image afin de l'utiliser comme carte.

Lors de l’imagerie en fort grossissement, retirez la lame en effectuant des réglages minimaux du porte-lame. Puis passez à un objectif à immersion huile 60 x.

Placez une petite goutte d'huile sur l'objectif et remettez la lame sur la platine porte-lame. Ensuite, retrouvez l'échantillon, puis réglez la puissance du laser, le temps d'exposition et le binning aux niveaux souhaités pour chaque canal. Une fois les paramètres optimaux déterminés conformément aux directives du protocole écrit, utilisez ces réglages pour tous les échantillons de tissu dans l'expérience.

Utilisez l'histogramme d'intensité pour noter la plage d'intensité optimale de chaque canal, qui sera utilisée pour l'analyse. Générez un Zack à l'aide de la fonction d'acquisition en sélectionnant les canaux laser appropriés. Ensuite, choisissez les limites supérieure et inférieure de la pile Z.

Choisissez une taille de pas Zack qui correspond à la moitié de la valeur de l'épaisseur optique de coupe fournie par le logiciel. Cliquez sur exécuter pour acquérir les images à l'aide de Fiji ou d'un programme comparable pour l'analyse d'images. Ouvrez le fichier Zack avec une option de mode de couleur personnalisée et séparez les canaux en fenêtres distinctes.

Dans le menu déroulant image, ouvrez l'outil de réglage de la luminosité et du contraste, puis définissez pour chaque canal la plage d'intensité optimale de l'histogramme. Appliquez, comme déterminé précédemment, ces plages de canal à tous les Zacks analysés. Ensuite, dans le menu déroulant couleur de l'image, fusionnez les canaux individuels en une seule image composite.

À l’aide du menu Projections Z des piles d’images, créez une pile Z aplatie à partir de l’image composite. Étant donné que cette image sera nettement plus lumineuse que l’image 3D, ajustez la plage d’intensité de l’histogramme pour l’échantillon témoin afin d’éviter la surcharge, puis appliquez les mêmes paramètres à la pile Z aplatie expérimentale. Pour générer une image 3D, sélectionnez d’abord le menu Projection 3D des piles d’images. Choisissez l’axe de rotation, soit l’axe x, soit l’axe y.

Réglez l'espacement des tranches sur le même nombre de micromètres que la taille du pas de la pile Z. Choisissez la rotation totale souhaitée et réglez l'incrément d'angle de rotation à un. Ensuite, ouvrez le visualiseur 3D d'ImageJ à partir du menu déroulant des modules complémentaires.

Choisissez l'affichage de l'image composite générée en tant que volume et réglez le facteur de rééchantillonnage à un ou deux. Ces images montrent des résultats typiques de coloration par immunofluorescence de différentes protéines dans un cœur congelé à la volée et fixé à l'acétone : l'anticorps dirigé contre l'alpha-actinine S marque de façon reproductible les disques Z ainsi que les disques intercalés avec une grande spécificité et un fond minimal. L'anticorps dirigé contre la protéine des jonctions d'adhérence bêta-caténine se fixe à la membrane des cardiomyocytes et des cellules non cardiomyocytes, et une colocalisation avec l'alpha-actinine S se produit dans les disques intercalés présumés à E 16,5. L'immunofluorescence de l'intégrine bêta 1 dans le cœur embryonnaire est particulièrement difficile, mais la coloration de l'intégrine bêta 1 dans ces études a révélé un signal présentant la même périodicité que les disques Z marqués par l'alpha-actinine S, reflétant peut-être la formation de costamères naissantes à E 16,5.

À E 12,5, le motif de coloration de l'α-actinine et de la tropomyosine présentait une périodicité régulière dans les cardiomyocytes trabéculaires, compatible avec des myofibrilles matures dans la zone compacte externe ; l'α-actinine était plus ponctuée que linéaire et le signal de la tropomyosine était diffus plutôt que linéaire. La coloration adhérente de la NCA et les cardiomyocytes trabéculaires dans les cœurs à E 12,5 co-localisaient avec des zones de coloration intense de l'α-actinine, éventuellement représentatives des disques intercalés. On observe ici un cœur embryonnaire fixé au PFA à E 12,5, marqué pour l'α-actinine et l'actine filamentaire, provenant d'une souris transgénique Life Act RFP Ruby. Le rapport signal sur bruit de l'α-actine était réduit par rapport aux sections de cœurs congelés instantanément.

La reconstruction d'images en trois dimensions a révélé que les myofibrilles (MyFi) au sein d'un cardiomyocyte étaient approximativement parallèles les unes aux autres, mais que les cardiomyocytes individuels étaient orientés selon des angles variables les uns par rapport aux autres. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'orienter correctement les cœurs embryonnaires, de réaliser des coupes cryogéniques, ainsi que d'effectuer des immunomarquages, de la microscopie confocale et des analyses d'images afin d'évaluer la maturation des myofibrilles (MyFi) et des cardiomyocytes au cours du développement cardiaque chez la souris.