Microinjection-based System for In Vivo l’Implantation des Cardiomyocytes embryonnaires chez l’embryon aviaire

Ce protocole nous aide à déterminer comment les altérations de la biomécanique locale, de l’architecture tissulaire, des environnements paracrines et des interactions juxtacrines influencent le phénotype cellulaire. Cette technique nous permet d’explorer les paradigmes classiques et l’embryologie expérimentale sans causer les insultes tissulaires à grande échelle qui apparaissent normalement dans les expériences graphiques traditionnelles. Pour trouver la bonne pression pour l’injection, il est utile de commencer à une pression d’injection plus faible et d’augmenter progressivement jusqu’à ce qu’un flux régulier de cellules soit atteint.

La visualisation de cette technique permet de comprendre directement comment l’équipement d’injection doit être positionné par rapport au tissu cible. Deux membres de mon laboratoire, Trevor Henley et Kandace Thomas, démontreront la procédure. 24 heures avant l’implantation, tirez les capillaires en verre sur un puller de micropipette selon les protocoles standard et trempez les capillaires dans l’agent siliconizing pour enduire les surfaces externes des aiguilles.

Ensuite, chargez 5 à 10 microlitres d’agent siliconizing dans une pointe de pipette de microinjection et placez la pointe dans l’extrémité large d’un capillaire en verre tiré extérieurement enduit. Placez la pointe de la pipette aussi près que possible de la pointe de l’aiguille en verre et éjectez l’agent siliconant tout en rétractant lentement la pipette de chargement pour minimiser les bulles d’air à l’intérieur de l’aiguille. Laissez l’agent siliconizing dans l’aiguille en verre pendant 10 minutes avant d’utiliser une nouvelle pipette de chargement pour aspirer la solution.

Ensuite, séchez les aiguilles dans une hotte de fumée pendant la nuit. Pour la préparation de l’embryon hôte, incuber des œufs de poulet fertiles dans une orientation horizontale dans un incubateur humidifié à 38 degrés Celsius et utiliser des forceps inclinés pour faire une ponction de plus d’un millimètre de diamètre dans le fond de l’extrémité plate de chaque œuf le long de l’équateur d’oeufs. Insérez une aiguille de calibre 18 fixée à une seringue de 10 millilitres dans la perforation pour enlever environ cinq millilitres d’albumen.

Et appliquer du ruban transparent sur le dessus de la coquille d’œuf. Marquer la région enregistrée le long du dessus de l’œuf avec des forceps inclinés et utiliser des ciseaux à ténotomie incurvée pour couper une fenêtre d’environ 2,5 centimètres dans la section scotchée de l’œuf. Inspecter et mettre en scène l’embryon en fonction des critères établis par Hamburger et Hamilton et utiliser une seringue d’un millimètre munie d’une aiguille de calibre 32 pour injecter environ 200 microlitres d’une dilution d’une à cinq de l’encre de Chine dans le HBSS sous l’embryon.

Sceller ensuite la ponction avec du ruban transparent et ajouter un millilitre de HBSS drop-wise sur le disque embryonnaire avant de sceller la coquille vitrée avec du film de paraffine pour le placement de l’œuf dans l’incubateur humidifié. Lorsque les embryons atteignent le stade 19 de Hamburger et hamilton, rincer les capillaires en verre enduit de silicone avec de l’eau déionisée et laisser sécher les capillaires pendant trois à quatre heures à température ambiante. Entre-temps, transférer un embryon d’un œuf dans une boîte petri de 100 x 15 millimètres contenant du HBSS stérile à température ambiante et placer le plat au microscope stéréo.

À l’aide de forceps, de ciseaux de ténotomie et d’une micro spatule, isoler tout le cœur embryonnaire de l’embryon et isoler les atriés du cœur. Placer le tissu auriculaire dans un tube stérile de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre contenant un millilitre de HBSS sur la glace. Lorsque tout le tissu donneur a été recueilli, pelleter les tissus par centrifugation dans une microcentrifugeuse à angle fixe.

Pour la digestion des tissus donneurs, suspendre à nouveau les granulés dans un millilitre de trypsine EDTA préchauffé à 05 % pendant une incubation de 15 minutes dans un bloc thermique secouant à 300 rotations par minute. À la fin de l’incubation, pipette la solution de digestion à plusieurs reprises pour briser tout tissu restant et pelleter le lysate cardiaque par centrifugation. Suspendre à nouveau la pastille dans un millilitre de solution neutralisante de trypsine pour une autre centrifugation suivie d’une nouvelle suspension dans 400 microlitres de solution de colorant fluorescent rouge.

Après 20 minutes à 37 degrés Celsius, pelleter les cellules par centrifugation pour un à trois lavages dans un millilitre de HBSS par lavage. Puis re-suspendre les cellules étiquetées à cinq fois dix à la quatrième cellule par concentration de microlitre dans hbss frais. Pour l’injection in vivo des cellules donneuses, rechargez la suspension cellulaire dans une pipette capillaire en verre sèche traitée au silicone telle que démontrée et montez la pipette dans l’appareil de microinjecteur de pression.

Transférer chaque embryon hôte à injecter de l’incubateur humidifié dans un porte-ovules sous un microscope à dissection stéréo fluorescente. Et utilisez des forceps fins stériles pour ouvrir la membrane vitelline. Faire une incision de 5 à un millimètre dans le péricarde et positionner le microinjecteur de telle sorte que la pointe de l’aiguille de microinjection pénètre dans le tissu cible.

Réglez le microinjecteur pour appliquer des impulsions simples de 5 secondes de durée et allant de 100 à 400 hectopascals en pression. Et injectez la pression dans les cellules. Il est essentiel de vérifier une implantation cellulaire réussie en imagerie du signal fluorescent avant de réédager l’œuf.

L’embryon peut également être photographié pour documenter cette procédure. Lorsque toutes les cellules ont été injectées, retirez l’appareil de microinjecteur et retirez l’œuf du support. Ajouter ensuite un millilitre de hbss chaud drop-wise sur l’embryon.

Sceller l’œuf avec du ruban adhésif transparent et remettre l’œuf dans l’incubateur humidifié pendant 24 heures après l’implantation. Ici, le coeur et le tissu environnant d’un coeur embryonnaire d’hôte après implantation atriale de myocyte de donateur est montré. Dans cette expérience représentative, les cellules donneuses ont été microinjectées dans le proepicardium d’un embryon hôte d’un stade similaire.

La sectionnement optique utilisant un microscope confocal a indiqué que les seules cellules positives de marqueur cardiaque de muscle dans le proepicardium étaient les globules positifs rouges fluorescents focalement implantés. Prenez soin de ne pas trop manipuler l’embryon receveur car les ruptures dans le cœur et la vascularisation locale causée par l’aiguille d’injection peuvent entraîner une réduction de la viabilité. Après cette procédure, une variété d’analyses en aval peuvent être effectuées, y compris l’immunohistochimie, l’hybridation in situ et le tri cellulaire.

L’agent silicium est extrêmement inflammable et extrêmement toxique. Il doit toujours être manipulé avec soin et équipement de protection individuelle approprié à l’intérieur d’un capot de fumée.