Bio-couche interférométrie pour Cinétique des interactions protéine-protéine et allostériques Effets ligand mesure

L’objectif général de l’expérience suivante est de mesurer la cinétique des protéines, les interactions protéiques et les effets allostériques de petits ligands sur ces interactions à l’aide de l’interférométrie de biocouche, BLI. Ceci est réalisé en préparant l’une des protéines avec de la biotine spécifique et en l’immobilisant à la surface du streptocoque. Biocapteurs revêtus d’Aden en parallèle.

Dans un deuxième temps, la protéine liée au capteur est exposée à un tampon contenant son partenaire de liaison, et la liaison est mesurée en temps réel par son effet sur les interférences optiques à la surface du capteur. Ensuite, chaque capteur est transféré dans un tampon sans le partenaire de liaison afin de mesurer en temps réel la dissociation de la protéine. Complexes protéiques.

Les résultats obtenus permettent de déterminer les constantes de vitesse cinétique de liaison et de dissociation des protéines en interaction et donc leur affinité de liaison. D’autres résultats montrent que BLI peut détecter les effets de petits ligands sur le taux de dissociation du complexe protéique. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la résonance plasma de surface, est que le BLI n’est pas trop sensible aux changements d’indice de réfraction.

Ainsi, les étapes de liaison et d’association peuvent inclure des modifications dans de petits ligands pour tester leurs effets sur les interactions protéine-protéine en temps réel, bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la cinétique de l’interaction protéine-protéine. Il peut également être appliqué à différentes combinaisons telles que la liaison de protéines à de l’ADN ou de l’ARN immobilisés ou la liaison de liposomes à une protéine immobilisée. Commencez cette expérience en configurant l’instrument BLI comme décrit dans le protocole texte.

Ensuite, configurez le plan expérimental dans le logiciel d’acquisition de données. Sélectionnez une nouvelle expérience cinétique dans l’onglet de l’assistant d’expérience. Cela présente un menu à onglets avec toutes les étapes qui doivent être définies sur le premier onglet.

Définissez les colonnes à utiliser. Sur la plaque d’échantillonnage de 96 puits. Attribuez des colonnes pour contenir le tampon, la protéine à immobiliser ou le partenaire de liaison.

Pour chaque association, entrez bien la concentration de partenaire de liaison à utiliser. Dans l’onglet deux, définissez toutes les étapes nécessaires au test. Il s’agit notamment de la charge de base, de l’association et de la dissociation du partenaire de liaison.

Les différentes étapes d’analyse sont reliées par des colonnes de puits sur la plaque d’échantillonnage en sélectionnant l’étape d’analyse, puis en double-cliquant sur la colonne correspondante. Cela programme les capteurs pour qu’ils soient déplacés d’une colonne de puits à l’autre. Au cours de l’analyse, commencer par une brève étape de référence liée à la première colonne de puits avec tampon d’analyse pour établir les signaux BLI initiaux dans la plaque de 96 puits.

Reliez ensuite l’étape de chargement aux puits qui contiendront la protéine biotinylée. Utilisez la fonction de seuil pour atteindre un niveau de liaison prédéterminé. Réglez l’option de seuil de sorte que tous les capteurs soient déplacés vers la colonne de puits suivante.

Lorsque l’un des capteurs atteint le seuil, incluez une autre étape de référence dans le tampon pour éliminer les protéines biotinylées non immobilisées des capteurs et établissez de nouveaux signaux de base stables pour les tests de base afin de déterminer les constantes de taux de liaison et de dissociation globales, incluez une étape de référence supplémentaire avec des capteurs dans une nouvelle colonne de puits tampons avant l’association. Étape suivante, liez l’association. Approchez-vous de la colonne de puits qui contiennent des concentrations variables du partenaire de liaison.

Ajustez le temps de pas de manière à ce qu’au moins une concentration saturante du partenaire de liaison atteigne le signal de liaison d’équilibre. Pour l’étape de dissociation, désignez les capteurs pour qu’ils retournent à la colonne quatre, les mêmes puits tampons que ceux utilisés pour la ligne de base supplémentaire avant l’association. Les temps des étapes d’association et de dissociation peuvent être ajustés au cours de l’expérience si les cadences sont plus lentes ou plus rapides que prévu.

Sur l’onglet trois, indiquez les emplacements dans le plateau de capteurs qui contiendront des capteurs pré-mouillés pour le test. L’onglet quatre permet d’examiner graphiquement le programme. Sur l’onglet cinq, entrez les détails nécessaires, y compris l’emplacement des fichiers de données et la température souhaitée.

Pour l’expérience. Mouillez au préalable les capteurs recouverts de streptavidine pendant au moins 10 minutes. Pour retirer leur revêtement protecteur en saccharose, retirez le support contenant le capteur du plateau de capteur et insérez une plaque à 96 puits au fond du plateau en glissant un coin de la plaque dans l’encoche d’orientation du plateau.

Pour la colonne de capteurs à utiliser, ajoutez 200 microlitres de tampon de dosage par puits. Dans cette colonne de la plaque à 96 puits, renvoyez le rack de capteurs dans le plateau dans l’orientation correcte qui vous a été assignée. Pendant la programmation, remplissez les puits de la plaque d’échantillon avec le tampon de dosage ou les dilutions protéiques appropriées. Évitez d’introduire des bulles car elles peuvent provoquer du bruit dans le signal optique.

Inclure un ou plusieurs puits de référence qui omettent la protéine biotinylée ou le partenaire de liaison. Ouvrez la porte de l’instrument et notez le flux lumineux du bras du capteur. Insérez le plateau du capteur sur la platine avec les languettes des plateaux insérées dans les fentes de la platine.

Insérez la plaque d’échantillonnage dans le support de plaque. Assurez-vous que la plaque est bien à plat et dans le bon sens comme indiqué sur le support de plaque. Fermez la porte et lancez le test à partir du programme d’acquisition de données.

Si les capteurs nécessitent toujours un prémouillage, sélectionnez l’option permettant de retarder le démarrage de l’expérience. Enfin, une fois que toute la préparation de l’échantillon est terminée et que la plaque d’échantillon et le plateau du capteur sont chargés dans l’instrument, cliquez sur le bouton Aller pour exécuter le test. Une fois le test exécuté, ouvrez le logiciel d’analyse de données et chargez le dossier contenant les données.

Cliquez sur l’onglet Traitement pour afficher un menu de traitement par étapes et les données cinétiques brutes, chaque capteur se voyant attribuer une couleur différente sous la sélection des données. Cliquez sur le bouton de sélection du capteur sur la carte de la plaque d’échantillonnage. Désignez les puits d’un ou deux capteurs de contrôle comme puits de référence dans le menu de traitement.

Cochez la case Soustraction et sélectionnez Puits de référence pour soustraire le signal de référence de tous les autres signaux de capteurs. Alignez toutes les traces sur Y égale zéro à l’aide de l’étape d’alignement de l’axe y. Sélectionnez ensuite la ligne de base comme étape d’alignement pour la plage horaire.

Entrez les 10 dernières secondes de cette ligne de base. En cliquant à l’intérieur de cette étape de référence, vous afficherez l’alignement. Ensuite, cochez la case de correction inter-pas pour minimiser les décalages de signal entre les étapes d’association et de dissociation.

Sélectionnez une ligne de base ou de dissociation. Dans la plupart des cas, sélectionnez la fonction de filtrage KY gole et cliquez sur Données de processus pour procéder à l’inspection visuelle des données de processus finales dans le panneau inférieur droit. Pour analyser les données, cliquez sur l’onglet d’analyse dans l’analyse des données pour l’étape d’analyse, choisissez association et dissociation.

Pour le modèle, sélectionnez un à un pour l’ajustement Choisissez global. Pour le groupe par couleur de sélection, sélectionnez r max non lié par le capteur pour permettre un ajustement indépendant de la réponse maximale du signal lors de la liaison saturante du partenaire à la protéine immobilisée. Enfin, cliquez sur ajuster les courbes pour lancer l’analyse de régression non linéaire.

Examinez les résultats d’ajustement, qui incluent la superposition de courbes de régression avec des traces de données de capteur, des tracés de résidus d’ajustement et un tableau avec des valeurs de paramètres et des statistiques déterminées. La cinétique BLI de liaison et de dissociation en temps réel est illustrée ici. Cette expérience a commencé avec une étape de référence de 10 minutes puisque les capteurs avaient été pré-mouillés, seulement brièvement, puis l’epsilon biotinylé a été chargé sur les capteurs.

Aucune dissociation détectable de l’epsilon ne s’est produite au cours des étapes restantes, comme le montre la courbe de référence, qui n’avait pas de partenaire de liaison ajouté. Un deuxième capteur de référence était dépourvu d’une protéine mobilisée et a montré une faible liaison non spécifique du partenaire de liaison. Diverses concentrations de F1 moins epsilon ont été utilisées dans l’étape d’association pour les capteurs A à F afin d’ajuster les résultats globalement et d’obtenir les meilleures valeurs pour la constante de taux d’association à constante de taux d’association et les résultats de la constante de dissociation d’équilibre KD ont été traités, produisant les traces de données bleues.

Dans ce cas, la trace du capteur de référence a été soustraite des traces de l’échantillon pour corriger la liaison non spécifique du partenaire de liaison et la dérive du signal du système. Lors de l’étape d’analyse des données, toutes les courbes ont été ajustées globalement à l’aide d’un modèle un à un, un à un. L’ajustement global suppose une dissociation complète du partenaire de liaison.

Une expérience différente est présentée ici dans laquelle l’enzyme a été liée à un capteur epsilon immobilisé en présence d’une millimolaire, A-T-P-A-D-T-A. Cela prédispose la plupart des complexes epsilon F1 à supposer la confirmation non inhibitrice, qui se dissocie facilement, les capteurs ont ensuite été déplacés vers des puits de dissociation contenant un tampon de test avec différents ligands. Cela démontre les effets de différents ligands sur la confirmation de l’epsilon.

Par exemple, l’exposition au magnésium A GP et au phosphate a considérablement ralenti la dissociation nette, indiquant que l’epsilon a déplacé la confirmation vers l’état inhibiteur étroitement lié. Lors de la mise en place initiale de tests BLI, il est important d’inclure des contrôles pour tester la liaison non spécifique des protéines aux capteurs et si la liaison non spécifique varie considérablement avec les concentrations de protéines à utiliser. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de concevoir, programmer et analyser des tests BLI pour mesurer la cinétique des interactions protéine-protéine et l’apprécier et l’apprécier.

BLI permet de tester directement les effets de petits ligands sur les interactions protéine-protéine.