Technologie d’interférométrie de biocouche pour détecter les interactions entre le ligand et l’analyte

Pour détecter les interactions ligand-analyte à l’aide de l’interférométrie de biocouche, il suffit de commencer par un biocapteur à fibre optique hydraté fixé sur une monture d’instrument BLI, réglé sur le programme souhaité.

L’embout du biocapteur est recouvert d’une couche biocompatible immobilisée avec des groupes nickel-acide nitrilotriacétique, Ni-NTA. Immergez l’embout du biocapteur dans le tampon.

L’instrument émet une lumière blanche vers le biocapteur, qui est réfléchie par deux interfaces : la couche de référence interne ou optique et la couche biocompatible. Les faisceaux réfléchis interfèrent de manière constructive ou destructrice à différentes longueurs d’onde lumineuses. Un photodétecteur détecte le motif d’interférence qui en résulte.

Après la mesure de la réponse interférométrique de base, ajoutez une solution de ligand marquée à l’histidine. Les marqueurs d’histidine se lient aux cations nickel sur le biocapteur, immobilisant les ligands sur l’extrémité.

Après association, la lumière blanche émise est réfléchie par la couche optique, et la couche biocompatible s’immobilise avec des ligands avec une épaisseur optique accrue à l’extrémité. Cela augmente la distance entre les couches réfléchissantes, provoquant un décalage du motif d’interférence et un décalage de longueur d’onde.

Lavez la pointe en enlevant les ligands non liés. Incuber avec une solution d’analyte cible. L’analyte se lie au ligand, augmentant encore l’épaisseur optique à l’extrémité, provoquant un décalage de longueur d’onde accru.

Positionnez l’embout du biocapteur dans le tampon. Enregistrer le décalage de longueur d’onde lors de la dissociation de l’analyte du ligand immobilisé sur la pointe.

Le suivi de l’évolution du décalage de longueur d’onde au fil du temps facilite l’étude des interactions moléculaires entre les ligands et les analytes.

Allumez la machine BLItz. Assurez-vous que la machine est connectée à l’ordinateur via un port de sortie de données USB à l’arrière de la machine.

Sur l’ordinateur, ouvrez le logiciel associé et cliquez sur « Advanced Kinetics » sur le côté gauche de l’écran. Dans le logiciel, tapez toutes les informations appropriées sur l’expérience sous chaque rubrique respective. Cliquez sur « Type de biocapteur » et choisissez « Ni-NTA » dans le menu déroulant. La durée de chaque étape peut être modifiée par défaut si nécessaire. Pour des résultats optimaux, utilisez un minimum de 30 secondes pour la ligne de base initiale et la ligne de base et de 120 secondes pour l’association et la dissociation.

Retirez le biocapteur Nickel-NTA hydraté du tube PCR et fixez-le sur le support du biocapteur sur la machine, en faisant glisser la partie large du biocapteur sur le support.

Placez un tube de microcentrifugation noir de 0,5 millilitre dans le porte-tube de la machine et pipetez-y 400 microlitres de tampon BLI. Fermez le couvercle de la machine de manière à ce que l’extrémité du biocapteur soit immergée dans le tampon du tube de microcentrifugation. Cliquez sur « Suivant » sur le logiciel pour commencer à enregistrer la base de référence initiale.

Une fois l’enregistrement de l’étape de référence initiale terminée, ouvrez le capot de l’appareil. Déplacez le curseur vers la droite. Pipetez 4 microlitres d’un ligand dialysé marqué His-étiqueté sur le support de goutte et fermez le couvercle de la machine, qui commencera automatiquement à enregistrer l’étape de chargement.

Une fois l’enregistrement de l’étape de chargement terminée, ouvrez le capot de la machine. Déplacez le curseur vers la gauche, de sorte que le support de tube soit à nouveau situé devant la flèche noire. Fermez le couvercle de la machine et assurez-vous que l’embout du biocapteur est immergé dans le tampon BLI du tube dans le support de tube. La machine et le logiciel commenceront automatiquement à enregistrer l’étape de référence.

Une fois l’enregistrement de l’étape de base terminée, ouvrez le capot de l’appareil. Retirez le support de goutte et nettoyez-le en pipetant toute protéine et en le rinçant avec de l’eau double désionisée pour un total de cinq fois. Utilisez une lingette en papier pour nettoyer la surface du support de goutte après le dernier lavage. Replacez le support de chute sur la machine. Déplacez le curseur de la machine vers la droite de sorte que le support de goutte soit à nouveau situé devant la flèche noire.

Pipetez 4 microlitres d’un analyte dialysé sur le support de goutte et fermez le couvercle de la machine, qui commencera automatiquement à enregistrer l’étape d’association. Une fois l’étape d’association terminée l’enregistrement, ouvrez le capot de la machine. Déplacez le curseur de la machine vers la droite de sorte que le support de tube soit à nouveau situé devant la flèche noire, et fermez le couvercle de la machine, qui commencera automatiquement à enregistrer l’étape de dissociation.