Application de biocouches interferométrie (BLI) pour étudier les interactions protéines-protéines dans la transcription
26 juillet 2019
Les interactions des facteurs de transcription (TF) avec la polymérase d'ARN sont habituellement étudiées utilisant des essais de retrait. Nous appliquons une technologie d'interférométrie biocouche (BLI) pour caractériser l'interaction de GrgA avec la polymérase d'ARN chlamydial. Par rapport aux essais de retrait, BLI détecte l'association et la dissociation en temps réel, offre une sensibilité plus élevée et est très quantitatif.
L’interaction protéine-protéine dans la transcription a été traditionnellement étudiée à l’aide de la dialyse por. Cependant, la dialyse por est purement quantitative. Nous utilisons l’interférométrie biocouche, ou BLI, pour surmonter ce problème.
Par rapport à Por dan, BLI détecte l’association en temps réel et la dissociation entre partenaires de liaison. Il génère également des paramètres cinétiques quantitatifs, qui sont indicatifs des mécanismes d’interaction. La technologie BLI peut sembler intimidante, mais il n’est pas difficile d’apprendre À utiliser cette technologie, il faut avoir accès à un instrument BLI et au logiciel associé.
Cette vidéo vous permettra de vous adapter facilement à la technologie BLI. Environ 10 minutes avant le début d’un essai, pipette 200 microlitres du tampon BLI dans un tube PCR. Retirez un biocapteur NTA nickel de l’emballage d’origine en tenant la grande partie du biocapteur à l’aide d’une main gantée.
Placez le biocapteur sur le tube PCR de telle sorte que seule la pointe en verre du biocapteur soit immergée dans le tampon BLI. Gardez la pointe du biocapteur immergée pendant au moins 10 minutes pour assurer une hydratation complète. Allumez la machine Blitz.
Assurez-vous que la machine est connectée à l’ordinateur via un port de sortie de données USB à l’arrière de la machine. Sur l’ordinateur, ouvrez le logiciel associé et cliquez sur Advanced Kinetics sur le côté gauche de l’écran. Dans le logiciel, tapez toutes les informations appropriées sur l’expérience sous chaque rubrique respective.
Cliquez sur Biosensor Type et choisissez Nickel NTA dans le menu dropdown. La durée de chaque étape peut être modifiée par défaut au besoin. Pour des résultats optimaux, utilisez un minimum de 30 secondes pour la ligne de base initiale et la ligne de base et 120 secondes pour l’association et la dissociation.
Retirez le biocapteur NTA de nickel hydraté du tube PCR et fixez-le sur la monture du biocapteur sur la machine en glissant la grande partie du biocapteur sur la monture. Placez un tube de microcentrifugeuse noire de 0,5 millilitre dans le support de tube de la machine et pipette 400 microlitres de tampon BLI en elle. Fermez le couvercle de la machine de telle sorte que la pointe du biocapteur soit immergée dans le tampon dans le tube de microcentrifugeuse.
Cliquez ensuite sur le logiciel pour commencer à enregistrer la ligne de base initiale. Une fois l’étape de base initiale terminée, ouvrez la couverture de la machine. Déplacez le curseur vers la droite, de sorte que le porte-gouttes est situé devant la flèche noire.
Pipette quatre microlitres d’un ligand dialysé son marqué sur le porte-gouttes et fermer le couvercle de la machine, qui va automatiquement commencer à enregistrer l’étape de chargement. Une fois l’étape de chargement terminée, ouvrez le couvercle de la machine. Déplacez le curseur vers la gauche, de sorte que le support du tube est une fois de plus situé en face de la flèche noire.
Fermez le couvercle de la machine et assurez-vous que la pointe du biocapteur est immergée dans le tampon BLI du tube dans le support du tube. La machine et le logiciel commenceront automatiquement à enregistrer l’étape de base. Une fois l’étape de base terminée, ouvrez le couvercle de la machine.
Retirez le porte-gouttes et nettoyez-le en arrosant n’importe quelle protéine et rincez-la avec de l’eau doublement déionisée pour un total de cinq fois. Utilisez un lingette de tissu pour nettoyer la surface du porte-gouttes après le dernier lavage. Replacez le porte-gouttes sur la machine.
Déplacez le curseur sur la machine vers la droite, de sorte que le porte-chute est une fois de plus situé en face de la flèche noire. Pipette quatre microlitres d’un analyte dialysé sur le porte-gouttes et fermer le couvercle de la machine, qui va automatiquement commencer à enregistrer l’étape de l’association. Une fois l’étape de l’association terminée, ouvrez la couverture de la machine.
Déplacez le curseur sur la machine vers la droite, de sorte que le support du tube est une fois de plus situé en face de la flèche noire et fermer le couvercle de la machine, qui va automatiquement commencer à enregistrer l’étape de dissociation. Une fois l’étape de dissociation terminée, ouvrez le couvercle de la machine et retirez le porte-gouttes et le support du tube. Rincer soigneusement les deux à l’eau double déionisée pour laver toute protéine.
Retirez le biocapteur et jetez-le en toute sécurité. Répétez ces étapes pour la même paire d’analyte ligand en utilisant différentes concentrations d’analyte. Une fois toutes les courses terminées, enregistrez les données sur le logiciel en cliquant sur Fichier et Enregistrer l’expérience comme sur le côté gauche de l’écran.
Sous le titre Exécuter les données, sélectionnez Correction d’étape et ajustement un à un et cliquez sur Analyser pour générer des données cinétiques. Pour extraire les données quantitatives dans une feuille de travail et générer des graphiques, cliquez sur Export to CSV et enregistrez les données enregistrées sous forme de fichier CSV. Ouvrez le fichier CSV à l’aide d’un logiciel de feuille de calcul.
GrgA pleine longueur est faite de 288 acides aminés. Comme indiqué ici, une région moyenne de 28 acides aminés lie Sigma 28 directement. Ici, la région moyenne marquée avec un terminal final His-tag a été utilisé comme ligand, qui a d’abord été immobilisé à la pointe d’un biocapteur nickel NTA.
Les enregistrements d’expériences avec trois concentrations différentes d’analyte commençant chacun 30 secondes avant la liaison ligand et se terminant deux minutes après le début du dernier lavage sont montrés. La visualisation améliorée de l’association et de la dissociation d’analyte de ligand est montrée après suppression des valeurs dans les deux premières étapes et réinitialisation de la ligne de base. Après le lavage non lié et terminal His-marqué GrgA 138 à 165 hors du biocapteur, l’association en temps réel avec l’analyte a été enregistrée suite à l’ajout de Sigma 28.
Enfin, la dissociation en temps réel a été enregistrée après le lavage. Avant les analyses BLI, le glycérol est retiré des ligands et des analytes. Nous recommandons que BLI soit effectué peu de temps après la dialyse comme discuté dans le texte.
Après avoir caractérisé les interactions protéine-protéine dans la transcription avec BLI, on peut étudier comment l’interaction affecte l’initiation de transcription, l’allongement, et ou la terminaison.
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Aperçu
Cette étude utilise l'interférométrie par couche biologique (BLI) pour examiner l'interaction entre GrgA et la polymérase ARN chlamydienne. La BLI présente des avantages par rapport aux dosages d'immunoprécipitation classiques en fournissant des données en temps réel sur l'association et la dissociation, ainsi qu'une sensibilité accrue et une analyse quantitative.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biochimie
- Biologie moléculaire
- Régulation de la transcription
Contexte
- Les interactions entre protéines jouent un rôle essentiel dans les processus de transcription.
- Les méthodes traditionnelles telles que les essais de précipitation montrent des limites en analyse en temps réel.
- La biointerférométrie en couche mince (BLI) est une technologie plus récente qui permet de surmonter ces limitations.
- La BLI fournit des paramètres cinétiques quantitatifs indicatifs des mécanismes d'interaction.
Objectif de l'étude
- Caractériser l'interaction de GrgA avec la polymérase ARN chlamydienne.
- Mettre en évidence les avantages de la BLI par rapport aux méthodes traditionnelles.
- Fournir des informations sur la dynamique des interactions des facteurs de transcription.
Méthodes utilisées
- Technologie de l'interférométrie en bicouche (BLI).
- Surveillance en temps réel des interactions protéiques.
- Analyse quantitative des taux d'association et de dissociation.
- Comparaison avec les dosages d'immunoprécipitation classiques.
Résultats principaux
- La BLI a permis de détecter avec succès des interactions en temps réel entre GrgA et l'ARN polymérase.
- Les résultats ont révélé une sensibilité plus élevée par rapport aux tests d'immunoprécipitation.
- Des paramètres cinétiques quantitatifs ont été obtenus, mettant en lumière les mécanismes d'interaction.
- L'étude souligne la facilité d'apprentissage et d'utilisation de la technologie BLI.
Conclusions
- La BLI est un outil puissant pour l'étude des interactions protéine-protéine dans la transcription.
- Elle fournit des données en temps réel et des informations quantitatives que les méthodes traditionnelles ne possèdent pas.
- Les résultats appuient l'utilisation de la BLI dans les futures études sur la transcription.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La interférométrie à couche biologique (BLI) répond à un défi clé dans la phase de découverte précoce en permettant une analyse quantitative en temps réel des interactions entre protéines, essentielles pour la validation des cibles dans la régulation de la transcription. Sa capacité à détecter des événements de liaison invisibles aux dosages classiques de type « pulldown » renforce la fiabilité prédictive dans la réduction des risques mécanistiques des voies des facteurs de transcription. Cela permet de prendre des décisions éclairées quant au passage ou non à l'étape suivante lors de l'identification des candidats-médicaments et du choix des modèles précliniques pour les cibles antimicrobiennes.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet d'étudier des hypothèses thérapeutiques en confirmant les interactions entre facteurs de transcription et facteurs sigma chez les bactéries pathogènes.
- Valeur opérationnelle : Fournit des paramètres cinétiques quantitatifs (taux d'association et de dissociation) qui précisent les mécanismes d'interaction et réduisent l'ambiguïté mécanistique.
- Valeur prédictive : Détecte des interactions faibles ou transitoires non observées par les dosages en point final, améliorant ainsi la confiance dans les cibles et le tri des portefeuilles pour les programmes d'antimicrobiens.
Développement de tests et criblage
- Prêt-à-l’emploi du test : Génère des courbes de liaison reproductibles en temps réel, adaptées à une standardisation dans le cadre de campagnes de criblage de composés.
- Données quantitatives : Fournit des constantes cinétiques (kon, koff, KD) permettant de classer par ordre d’affinité les ligands ou les mutants lors de l’optimisation des candidats médicaments.
- Évolutivité : Permet une analyse à plusieurs concentrations à l’aide de cycles de régénération, facilitant le profilage à débit moyen des réseaux d’interactions.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Caractérise les interactions chez Chlamydia, un pathogène intracellulaire obligatoire, soutenant la validation préclinique de mécanismes de virulence liés à la transcription.
- Continuité translationnelle : Relie les données d'interactions moléculaires à des résultats fonctionnels en matière d'expression génique, permettant une validation ciblée alignée sur les biomarqueurs.
- Avancement ajusté au risque : Soutient les décisions d'aller ou de ne pas aller plus loin en quantifiant la force et la spécificité de liaison dès les premières étapes du processus de découverte.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La BLI s'inscrit dans le continuum de découverte allant du criblage de l'interaction avec la cible à l'optimisation du composé candidat, en fournissant des informations mécanistiques qui éclairent la validation préclinique en aval des thérapeutiques modulant la transcription.
- Découverte en biologie : Soutient la vérification d'hypothèses sur les réseaux de facteurs de transcription en fournissant des données quantitatives en temps réel sur les interactions, essentielles pour clarifier les voies biologiques.
- Essais de criblage : Permet la préparation des tests grâce à une détection reproductible et sans marquage des interactions biomoléculaires, associée à des sorties cinétiques bien définies.
- Analyses : Génère des sensoriels d'association/dissociation et des valeurs de KD ajustées permettant une comparaison objective des conditions de liaison à différentes concentrations d'analyte.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre la cinétique des interactions moléculaires et la régulation transcriptionnelle fonctionnelle dans des systèmes pertinents pour la maladie, comme Chlamydia.
- Réutilisation institutionnelle : Constitue une plateforme portable et sans marquage, applicable à plusieurs classes de cibles au-delà de la transcription, soutenant ainsi les modèles de laboratoires mutualisés.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en révélant la cinétique de liaison en temps réel et en détectant des interactions indétectables par les dosages d'immunoprécipitation.
- Valeur opérationnelle : Offre des protocoles standardisés et reproductibles avec une consommation minimale d'échantillons et sans nécessiter d'étiquettes radioactives ou fluorescentes.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en réduisant les faux positifs lors du criblage précoce et en permettant une priorisation fondée sur les données des cibles à haute confiance.
- Impact sur le portefeuille : Favorise un développement ajusté au risque en fournissant des données quantitatives sur la liaison, qui éclairent les relations structure-activité et l'optimisation des candidats médicaments.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en purification des protéines, en marquage His et en manipulation des biocapteurs afin d'assurer une immobilisation adéquate du ligand et une délivrance précise de l'analyte.
- Dépend de l'accès à un instrument de BLI (par exemple, système Blitz) et aux logiciels associés pour l'acquisition en temps réel des données et l'ajustement cinétique.
- Exige une standardisation interéquipes des conditions tampons, des protocoles de dialyse et des étapes de correction de la ligne de base afin d'assurer la comparabilité des données.
- Implique des adaptations à prendre en compte lors de l'application à différents systèmes modèles, notamment en ce qui concerne la stabilité du ligand et l'efficacité de la régénération de la surface.
- Limité par la nécessité d'une densité d'immobilisation optimisée afin d'éviter les artefacts de transport de masse et d'assurer une modélisation cinétique précise.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
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Title
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Biosensor Hydration and Assay Set-Up
2:51
Loading of Ligand onto Biosensor and Washing Away Additional Ligand
3:43
Association of Analyte to Ligand and Dissociation of Analyte from Ligand
5:41
Results: A 28 Amino Acid Middle Region of GrgA Binds σ28 In Vitro
6:45
Conclusion
