High Throughput Screening Expression quantitative et purification appliquée à recombinant disulfure riches protéines venin produit dans E. coli

L’objectif global de la procédure suivante est d’utiliser un protocole de criblage d’expression à haut débit pour quantifier chez E. coli le niveau de protéines solubles à l’aide d’un robot automatisé de manipulation de liquides. Ceci est accompli en inoculant d’abord.96. Bien les pré-cultures avec des cellules transformées avec des plasmides codant pour les protéines de fusion cibles le lendemain, 24 plaques de puits remplies de milieux d’auto-induction sont inoculées avec les pré-cultures de nuit pour générer l’expression.

Après la récolte et la congélation, les protéines solubles des cultures d’expression sont ensuite purifiées par chromatographie d’affinité métallique immobilisée. En fin de compte, les niveaux de solubilité de chaque fusion de cible intacte peuvent être mesurés pour déterminer les conditions d’expression optimales pour la production de protéines et la génération de cibles réussies. Des avantages de cette technique par rapport aux méthodes traditionnelles d’efficacité accrue, le rayonnement limité d’un lot à l’autre et la simplicité du traitement et du suivi des données La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle.

Les étapes automatisées peuvent sembler intimidantes et difficiles à comprendre uniquement au format texte, car le texte ne transmet pas la rapidité ou la simplicité de la procédure. Après la transformation des bactéries, commencez par utiliser la pince robotisée pour mettre de côté le couvercle de la première plaque de gélose LB de 24 puits. Ensuite, utilisez le bras de manipulation de liquide à huit canaux pour mélanger, puis aspirez 50 microlitres de mélange de transformation à partir d’une plaque de transformation de 96 puits.

Versez le mélange de transformation dans les quatre premiers canaux du bras de manipulation des liquides dans la première colonne de la plaque de gélose LB et les transformations dans les quatre derniers canaux dans la deuxième colonne de la plaque de gélose LB Lavez soigneusement toutes les pointes après la distribution, puis continuez à transférer le mélange de transformation de la plaque de 96 puits dans tous les puits des quatre colonnes suivantes de la plaque de gélose LB jusqu’à ce que Cette plaque est terminée. Une fois le transfert vers la première assiette terminé, replacez le couvercle et commencez le transfert vers l’assiette suivante. Une fois que toutes les transformations ont été plaquées, secouez toutes les plaques pendant une minute à 1200 tr/min pour générer une distribution homogène du mélange de transformation.

Ensuite, après le mélange, utilisez le bras multicanaux 96 pour aspirer 60 microlitres du mélange de transformation restant de la plaque à 96 puits et distribuer le mélange dans une assiette à puits profond 96 contenant du bouillon LB. Scellez les pré-cultures du puits profond 96 avec un film adhésif respirant pour permettre l’aération de la culture, puis placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius à vitesse maximale pendant la nuit. Une fois que les pré-cultures sont dans l’incubateur, conduisez les plaques de gélose LB dans un capot avec leurs couvercles retirés pendant environ 10 minutes.

Ensuite, retournez les plaques dans un incubateur à plaques à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, utilisez le bras de manipulation de liquide pour aspirer 100 microlitres de la pré-culture de nuit dans une plaque de puits profond de 96 pour inoculer les cultures d’expression à une dilution de 40e, en utilisant le même schéma que précédemment, en lavant soigneusement le bras de manipulation de liquide à la station de lavage entre chaque colonne de pré-cultures. Une fois l’inoculation terminée, placez les cultures d’expression dans un incubateur à 37 degrés Celsius, scellé avec un adhésif respirant pendant quatre heures.

Réduisez ensuite la température à 17 degrés Celsius pour une incubation nocturne. Le lendemain matin, centrifugez le puits profond 24 plaques pendant 10 minutes à 3000 G.Jetez le surnageant dans un récipient à déchets contenant un agent antimicrobien, puis tapotez les plaques à l’envers sur du papier absorbant pour éliminer tout milieu résiduel afin de vérifier que les cultures ont bien poussé. Vérifiez la présence de granulés dans le puits profond.

Ensuite, aspirez 125 microlitres de tampon de lyse et distribuez le tampon deux fois dans chaque puits du puits profond 24 plaques avec quatre pointes dans chaque puits. Pour atteindre le volume final d’un millilitre de tampon de lyse pour remettre les granulés en suspension, agitez les plaques à 1200 tr/min pendant cinq minutes. Sur le robot, transférez les suspensions cellulaires dans les puits appropriés d’une plaque de puits profond 96 et stockez les plaques scellées à moins 80 degrés Celsius pendant au moins une heure.

Pour cette démonstration, nous utiliserons le protocole avec 50 microlitres de billes de nickel pour la purification des protéines de fusion cibles. Décongelez d’abord la plaque du puits profond 96 dans un bain-marie pendant environ 15 minutes. Ensuite, suspendez les lysats cellulaires dans l’incubateur à agitation à vitesse maximale pendant 10 minutes supplémentaires, les cultures doivent devenir visqueuses.

Ensuite, utilisez une pipette manuelle à huit canaux pour distribuer des mélanges d’ADN et de sulfate de magnésium dans chaque puits de la plaque de puits profond 96 jusqu’à une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre et 20 millimolaires respectivement. Secouez la plaque scellée pendant encore 15 minutes, après quoi la culture devrait devenir non visqueuse. Pour éviter le colmatage de la plaque filtrante pendant la purification, il est essentiel de vérifier soigneusement visuellement qu’aucun des lysats n’est plus visqueux.

Sur le robot de manipulation de liquides, utilisez des pointes de 200 microlitres de large pour bien mélanger la boue de résine avant de transférer 200 microlitres de la boue dans la plaque du puits profond 96 contenant le lysat. Agitez la plaque du puits profond 96 à 1400 tr/min et à température ambiante pendant 10 minutes pour permettre la liaison, puis utilisez les pointes à alésage large pour mélanger, puis transférez les 1200 microlitres de boue de lysat de résine en aliquotes de 200 microlitres sur la plaque filtrante. Allumez maintenant le vide pendant environ 30 secondes pour filtrer le lysat à travers la plaque, en recueillant le flux dans un puits profond.

96 sous le puits profond 96 contenant l’écoulement est retiré de dessous la plaque filtrante et stocké sur un support jusqu’à la fin de l’expérience. Ensuite, lavez la résine deux fois avec 800 microlitres de tampon de liaison à chaque fois après le deuxième lavage, utilisez la pince robotisée pour placer une plaque fraîche, profonde, bien 96 sous la plaque filtrante pour recueillir le lavage de 50 millimolaires I midaz. Ajoutez 150 microlitres de tampon de lavage sur la plaque filtrante et appliquez à nouveau le vide jusqu’à ce que le tampon soit passé à travers le puits profond contenant 96.

Le lavage est retiré sous la plaque filtrante et stocké sur une grille jusqu’à la fin de l’expérience. Ensuite, après avoir lavé deux fois de plus avec 800 microlitres de tampon de lavage, comme démontré pour le tampon de liaison, les lavages ont utilisé la pince robotisée pour transférer la microplaque sur la table de travail et ont remis le bloc SPE et la plaque filtrante sur la microplaque pour collecter l’élucien. Ajoutez ensuite 190 microlitres de tampon Elucian à la résine dans la plaque filtrante.

Après trois minutes, appliquez le vide une minute pour permettre à tout le tampon de passer. Vérifiez rapidement et visuellement que les volumes d’Ellucian sont corrects. Enfin, des échantillons en bloc de l’eau de lavage et d’écoulement ellucien sont diffusés à travers des plaques pour quantifier le niveau d’expression soluble.

Analysez d’abord la plaque ellucienne et seulement lorsque cela est nécessaire, vérifiez les fractions de lavage et d’écoulement pertinentes. Ces données illustrent un résultat d’électrophorèse du système de puce de laboratoire à pied à coulisse. Les protéines de fusion clivées intactes sont représentées par les bandes supérieures, les fragments de protéines clivés étant représentés par les bandes inférieures.

Les rendements de fusion pour chaque protéine cible ont été déterminés comme se situant dans les plages de 0,1 à deux, de deux à 10 et de 10 à 25 microgrammes par litre, ou dans certains cas, n’ont pas été détectés. L’évaluation du succès de l’expression de la protéine par le nombre de liaisons disulfure présentes dans chaque fragment de protéine de fusion démontre un succès raisonnable pour tous les nombres de liaisons disulfure testées, le niveau de réussite le plus bas étant de 66 % pour les cibles contenant six liaisons disulfure. L’analyse de la distribution du succès d’expression basée sur le point isoélectrique et le nombre de résidus n’indique pas de biais particulier pour la technique, avec à la fois des cibles exprimées avec succès et des cibles qui n’ont pas été détectées dispersées sur l’ensemble de la parcelle.

Une fois les fusions détectées et clivées, les cibles purifiées subissent un contrôle qualité par ionisation par électronébulisation, spectrométrie de masse. Ici, la cible représentative montrée est une protéine de venin riche en sulfure de 5,7 kilodaltons avec quatre liaisons disulfure. Ce spectre montre les résultats pour la protéine avant la réduction avec le DTT comme c’était le cas après le clivage et le dessalage sans autre intervention.

Ce spectre montre la protéine après réduction avec DTT suivie d’un dessalage pour éliminer tout excès de DTT. Les flèches indiquent les ions correspondant aux masses expérimentales et la désignation de chaque ion est indiquée en vert. Les masses parentales expérimentales calculées pour ces ions sont indiquées dans le tableau et correspondent à une différence de masse de huit Daltons, équivalente à quatre liaisons sulfure oxydées.

Une fois mis en place, le protocole complet peut être effectué sur plus d’un millier de cultures en une semaine. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser les cultures d’E. coli à petite échelle pour identifier les conditions de succès nécessaires à la production de protéines solubles à l’aide de méthodes à haut débit.