Une plate-forme d'expression pratique et général pour la production de protéines sécrétées à partir de cellules humaines

Dans cette vidéo, nous décrivons une procédure rapide et économique pour l’expression des protéines sécrétées à partir de cellules T Durant HEC 2 9 3. Initialement, une culture de cellules T Cofluent HEC 2 9 3 à 40 % est préparée dans une plaque à six mondes. Un mélange de transfection est ensuite produit en diluant le jus de gène, puis teste les plasmides dans un milieu libre de sérum.

Le mélange de transfection est déposé sur les cellules, qui sont ensuite incubées à 37 degrés Celsius pour permettre l’expression des protéines. La détection de protéines dans l’agent supan peut être effectuée par western blot. Une fois qu’une construction appropriée est identifiée, la procédure peut être mise à l’échelle à l’aide d’usines de cellules à 10 couches.

Les cellules sont transfectées en utilisant l’IPE comme transfection. Le réactif et la protéine peuvent être récoltés à partir des surnageants de culture en utilisant la filtration à flux tangentiel suivie d’une chromatographie d’affinité. En fin de compte, cette plateforme permet l’expression d’un large éventail de macromolécules en milligrammes.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’expression de cellules d’insectes à base de virus balo est qu’un grand nombre de constructions peuvent être criblées et mises à l’échelle pour l’expression, avec des résultats obtenus en l’espace de trois semaines. La démonstration de cette procédure sera Hello Aiden pour Shada Zini et Jonathan Cook. Trois étudiants diplômés de mon laboratoire commencent par ensemencer 250 000 cellules HEC 2 9 3 T par puits dans un volume d’un millilitre dans une plaque à six puits, ajoutez un millilitre par puits de 10 % FBS pentre complété DMEM et S faites tourbillonner la plaque pour disperser les cellules uniformément.

Ensuite, incubez les cellules pendant la nuit dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Une fois que les cellules atteignent une co-fluidité d’environ 40 %, remplacez le SUP natum par deux millilitres de milieu frais pour préparer le mélange de transfection. Première aliquote de 90 microlitres de DMEM sans sérum dans un tube à orph.

Ajoutez ensuite trois microlitres de jus de gène, le réactif de transfection mélange doucement le contenu du tube et incube-le à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, ajoutez 10 microlitres d’un stock de 100 nanogrammes par microlitre du plasmide purifié mini prep, l’ADN. À transfecter.

Mélangez le contenu du tube et laissez-le reposer à température ambiante pendant 15 minutes. Pour effectuer la transfection, déposez le mélange sur les cellules T HEC 2 9 3. Goutte à goutte, gonflez doucement la plaque pour répartir uniformément le mélange de transfection.

Ensuite, incubez les cellules à 37 degrés Celsius. 24 heures plus tard, ajoutez un millilitre de milieu frais dans chaque puits et incubez pendant 48 heures supplémentaires. Trois jours après la transfection, récolter le supinate et détecter les niveaux d’expression de la protéine d’intérêt par western blot.

Une fois qu’une construction appropriée a été identifiée, la procédure de transfection peut être mise à l’échelle. À l’aide d’usines de cellules à 10 couches, remplissez une usine de cellules avec 1,2 litre de DMEM complété par 5 % FBS. Ajoutez ensuite 200 millions de cellules T HEC 2 9 3, en répartissant uniformément les cellules sur toutes les couches.

Quatre flacons de culture cellulaire de 225 centimètres carrés cultivés à une fluidité de 100 % contiennent environ 200 millions de cellules. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Préparez le mélange de transfection dans une fiole T 75 en diluant 840 microgrammes d’ADN dans 84 millilitres de stérile une fois. Pbs.

Ajoutez 2,5 millilitres d’un milligramme par millilitre, une solution d’ions polyéthylène ou PEI, et incubez le mélange à température ambiante pendant 15 minutes. La solution devrait devenir trouble. Ensuite, versez lentement le mélange de transfection dans l’usine de cellules et répartissez-le soigneusement.

Couches globales. Ajouter de l’acide valproïque à une concentration finale de quatre millimolaires. Cela augmentera les rendements d’expression une fois que le mélange de transfection aura été ajouté.

Incuber la culture à 37 degrés Celsius pendant quatre jours pour permettre l’expression des protéines. Récoltez le milieu quatre jours après la transfection et nettoyez immédiatement l’usine de cellules pour la réutiliser, centrifugez le milieu collecté à 6 000 g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius et filtrez-le à travers un appareil de filtration sous vide à godet stérique de 0,22 micron pour éliminer toute matière particulaire. Utilisez ensuite le système de filtration à flux tangentiel centra mate pour concentrer le surnageant à 75 millilitres.

Une fois le surnageant concentré, la protéine d’intérêt peut être purifiée par chromatographie d’affinité. Dans cette expérience, nous avons purifié les sous-unités tachées HA du domaine extracellulaire des deux récepteurs AAL humains en utilisant le système à grande échelle décrit ici, suivi d’une chromatographie anti THA de haute affinité. Comme le montre cette analyse de page SDS teintée de kumasi.

Les domaines extracellulaires des sous-unités alpha et gamma des deux récepteurs de l’interleukine migrent à des poids moléculaires de 40 kilodaltons et 46 kilodaltons. L’hétérogénéité des glycanes EnLink présents sur IL deux R alpha et IL deux R gamma a provoqué un élargissement de bande sur le gel de page SDS. La bande de poids moléculaire plus élevé représente la BSA contaminante.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’exprimer les protéines de la culture cellulaire humaine à l’aide d’usines cellulaires à 10 couches. N’oubliez pas que les lymphocytes T HC 2 93 sont considérés comme présentant un danger biologique et doivent être manipulés au niveau de biosécurité deux. Veuillez toujours porter des vêtements de protection individuelle appropriés, et les surfaces doivent être désinfectées conformément aux directives institutionnelles et gouvernementales.