Une expression efficace de cellules de mammifères et en une seule étape de purification extracellulaire glycoprotéines à la cristallisation

L’objectif global de cette technique d’expression de protéines de mammifères est de produire des quantités millimétriques de protéines repliées nativement adaptées aux études structurelles, biophysiques et fonctionnelles. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’un protocole rapide et simple pour obtenir des protéines de mammifères sécrétées et une concentration en pureté requise pour les études structurales. En général, nous constatons que la plupart des problèmes liés au rendement en protéines sont dus à la santé et à la viabilité des cellules.

En surveillant de près la viabilité cellulaire et les niveaux de sucre dans les milieux, vous améliorez considérablement le rendement en protéines et prolongez l’utilité des cellules. Il est également très important de surveiller la densité cellulaire. Nous constatons que si, à tout moment avant la transfection, les cellules dépassent 2 millions de cellules par millilitre, le rendement en protéines est considérablement réduit Pour effectuer une culture à grande échelle de 2 cellules 93 F, complétez un litre de milieu 2 93 F avec 10 millilitres de 100 x glutamine et cinq millilitres de 100 x streptocoque.

L’antibiotique est à une puissance suffisante dans des conditions sans sérum et la concentration réduite d’antibiotiques améliore la viabilité cellulaire pendant la transfection, ce qui améliore les rendements en protéines de la culture. Les 2 cellules de 93 F dans 300 millilitres de milieu dans un litre, des flacons erlenmeyer à chicanes en polycarbonate avec des bouchons ventilés à 37 degrés Celsius avec 8 % de dioxyde de carbone tout en secouant dans un incubateur de culture tissulaire standard un jour avant la transfection diluent les cellules à une densité de 0,5 million de cellules par millilitre le jour de la transfection. Complétez le milieu de culture en ajoutant 10 % de volume de 2 % de poids par volume de cellules dans un milieu de 2 93 F.

Ajoutez du kafu à cette étape pour contrôler la glycosylation des protéines. Préparez des solutions de réactifs d’ADN et de transfection dans un milieu exempt de sérum et incubez pendant cinq minutes. Ensuite, ajoutez le réactif de transfection dans la solution d’ADN par incréments d’un millilitre en mélangeant.

Incuber doucement pendant 30 minutes à température ambiante pour que les complexes d’ADN réactif se forment. Ensuite, ajoutez la solution sur les cellules de manière goutte à goutte, laissez les cellules transfectées exprimer la protéine pendant 72 à 96 heures pour purifier la glycoprotéine. Décantez d’abord la culture dans un flacon centrifuge pendant 20 minutes à 1300 Gs.To granulez les cellules, collectez le surnat et, si nécessaire, tournez une deuxième fois et/ou utilisez un filtre de 0,22 micron pour clarifier le surnageant.

Ensuite, ajoutez 10 % de volume de 10 x charge de nickel nitro, d’acide triacétique ou de tampon de liaison nickel NTA. Ensuite, préparez une colonne gravitaire à quatre degrés Celsius en ajoutant deux millilitres de boue de nickel NTA à une colonne et en équilibrant avec 10 volumes de colonne d’un tampon de liaison x fonctionnant à quatre degrés Celsius. Faites couler le surnageant sur la résine et récupérez l’écoulement.

Après avoir versé le surnageant, le flux sur la colonne de lavage avec 10 volumes de colonne de tampon de lavage. Ensuite, éluez la protéine en cinq volumes de colonne de tampon d’élution. Si la déglycosylation est nécessaire pour un volume final de 0,5 millilitre, concentrer l’EIT à 0,43 millilitre à l’aide d’une pastille de concentrateur de centrifugation par centrifugation à 16 000 GS et quatre degrés Celsius.

Ajoutez ensuite 50 microlitres de citrate de sodium de 500 millimolaires, pH 5,5 et 20 microlitres d’endo hf. Incuber le mélange à température ambiante pendant deux heures pour éliminer l’endo HF laver d’abord la résine d’amylose trois fois dans une solution saline tamponnée au phosphate. Incuber la protéine avec la résine lavée pendant une heure à quatre degrés Celsius.

Après l’incubation, essorez pendant cinq minutes à 1000 G pour granuler la résine et recueillir le surnageant. Concentrez la protéine à l’aide d’un seuil de coupure de poids moléculaire approprié, d’un filtre de centrifugation et d’un échange de tampon dans le tampon de stockage illustré. Voici les résultats représentatifs de la page SDS pour une protéine sécrétée exprimée dans les cellules traitées au ciné après chromatographie d’affinité au nickel.

La première voie est la protéine avant la déglycosylation, et la seconde est la protéine après la déglycosylation par endo hf. La protéine glycosylée augmente d’environ 10 kilodaltons, puis s’effondre en une seule bande compatible avec le poids moléculaire prédit après la déglycosylation, après l’étape de purification unique. Des écrans en cristal ont été installés à l’aide de la méthode de la goutte suspendue.

L’image du haut montre l’impact initial du cristal et l’image du bas montre les conditions de cristallisation optimisées. Cela démontre que l’homogénéité biochimique de la protéine d’intérêt peut être un facteur déterminant pour le succès de la cristallisation, et qu’un système d’expression optimisé chez les mammifères produit des protéines propices à cette cristallisation. La purification ultérieure de la protéine purifiée au nickel est facilement effectuée par chromatographie d’exclusion stérique.

Il s’agit également d’une étape utile vers l’évaluation de la production de protéines et l’optimisation des conditions pour produire des protéines correctement repliées. La protéine d’intérêt doit être l’espèce principale dans l’élution chromatographique, et le volume d’élution doit correspondre au poids moléculaire de la protéine. Plus tôt. Les temps EEU peuvent suggérer une agrégation ou un mauvais repliement de la protéine Une fois maîtrisé.

Cette technique peut être réalisée en quatre jours si elle est correctement exécutée. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de maintenir des conditions stériles pour la culture cellulaire Après cette procédure. D’autres méthodes telles que la taille, la chromatographie d’exclusion, la diffusion multi-angle de la lumière et le balayage différentiel, la fluorométrie peuvent être effectuées afin d’évaluer l’état d’oli isation et la stabilité thermique de la protéine.