Une expression efficace de cellules de mammifères et en une seule étape de purification extracellulaire glycoprotéines à la cristallisation

L'objectif général de cette technique d'expression de protéines de mammifères est de produire des quantités de l'ordre du milligramme de protéines correctement repliées, adaptées à des études structurales, biophysiques et fonctionnelles. Le principal avantage de cette technique réside dans son protocole rapide et simple permettant d'obtenir des protéines de mammifères sécrétées et une concentration en pureté requise pour des études structurales. En général, nous constatons que la plupart des problèmes liés au rendement protéique sont dus à l'état de santé et à la viabilité des cellules.

En surveillant attentivement la viabilité cellulaire et les niveaux de sucre dans le milieu, vous améliorez considérablement le rendement en protéines et prolongez l'utilité des cellules. Il est également très important de surveiller la densité cellulaire. Nous constatons que si, à un moment quelconque avant la transfection, les cellules dépassent 2 millions de cellules par millilitre, le rendement en protéines est fortement réduit. Pour réaliser une culture à grande échelle de cellules 293F, complétez un litre de milieu 293F avec 10 millilitres de glutamine 100 x et cinq millilitres de pénicilline-streptomycine 100 x.

L'antibiotique est à une concentration suffisante en conditions sans sérum, et la concentration réduite d'antibiotique améliore la viabilité cellulaire pendant la transfection, ce qui augmente les rendements protéiques en culture. Cultiver les cellules 293F dans 300 millilitres de milieu dans des flacons Erlenmeyer en polycarbonate de un litre, munis de plots et de bouchons ventilés, à 37 degrés Celsius avec 8 % de dioxyde de carbone, sous agitation dans un incubateur standard pour culture cellulaire, un jour avant la transfection ; diluer les cellules à une densité de 0,5 million de cellules par millilitre le jour de la transfection. Compléter le milieu de culture en ajoutant 10 % en volume de Cell Boost à 2 % en poids par volume dans le milieu 293F.

Ajouter du kafu visible à cette étape pour contrôler la glycosylation des protéines. Préparer les solutions d'ADN et de réactif de transfection dans un milieu sans sérum et incuber pendant cinq minutes. Ensuite, ajouter le réactif de transfection à la solution d'ADN par incréments d'un millilitre en mélangeant.

Incuber doucement pendant 30 minutes à température ambiante afin de permettre la formation des complexes ADN-réactif. Ensuite, ajouter la solution aux cellules de manière goutte à goutte, et laisser les cellules transfectées exprimer la protéine pendant 72 à 96 heures pour purifier la glycoprotéine. Tout d'abord, verser délicatement le milieu de culture dans un flacon de centrifugation et centrifuger pendant 20 minutes à 1300 ×g. Pour former un culot de cellules, récupérer le surnageant et, si nécessaire, effectuer une seconde centrifugation ou utiliser un filtre de 0,22 micron pour clarifier le surnageant.

Ensuite, ajouter un volume de 10 % de tampon de liaison 10 x nickel nitrolo, acide triacétique ou nickel NTA. Préparer ensuite une colonne par gravité à quatre degrés Celsius en ajoutant deux millilitres de suspension de nickel NTA dans une colonne et en équilibrant avec 10 volumes de colonne de tampon de liaison 1 x, travaillé à quatre degrés Celsius. Faire passer le surnageant sur la résine et recueillir l'écoulement.

Après avoir versé le surnageant sur la colonne, effectuer un lavage avec 10 volumes de colonne de tampon de lavage. Ensuite, éluer la protéine dans cinq volumes de colonne de tampon d'élution. Si une déglycosylation est nécessaire pour un volume final de 0,5 millilitre, concentrer l'EIT à 0,43 millilitre à l'aide d'un concentrateur par centrifugation, puis éliminer tout débris par centrifugation à 16 000 ×g et 4 degrés Celsius.

Ensuite, ajouter 50 microlitres de citrate de sodium 500 millimolaire, pH 5,5 et 20 microlitres d'endo HF. Incuber le mélange à température ambiante pendant deux heures pour éliminer l'endo HF. Laver d'abord la résine amylose trois fois dans une solution saline tamponnée au phosphate. Incuber la protéine avec la résine lavée pendant une heure à quatre degrés Celsius.

Après l'incubation, effectuez une centrifugation de cinq minutes à 1000 Gs pour former un culot de résine et récupérez le surnageant. Concentrez la protéine à l'aide d'un filtre de centrifugation doté d'une coupure de poids moléculaire appropriée, puis effectuez un échange de tampon dans le tampon de stockage indiqué. Voici des résultats représentatifs de gel SDS-PAGE pour une protéine sécrétée exprimée dans des cellules traitées au ciné suivant une chromatographie d'affinité au nickel.

La première piste correspond à la protéine avant la déglycosylation, et la seconde piste correspond à la protéine après déglycosylation par l'endo HF. La protéine glycosylée migre environ 10 kilodaltons plus haut, puis se concentre en une seule bande, conforme au poids moléculaire prédit après déglycosylation, suite à l'étape unique de purification. Les tamis de cristallisation ont été préparés selon la méthode de la goutte suspendue.

L'image supérieure montre le premier cristal obtenu et l'image inférieure illustre les conditions de cristallisation optimisées. Cela démontre que l'homogénéité biochimique de la protéine d'intérêt peut constituer un facteur déterminant pour la réussite de la cristallisation, et qu'un système d'expression mammalien optimisé produit des protéines adaptées à cette cristallisation. Une purification supplémentaire de la protéine purifiée par nickel est facilement réalisée par chromatographie d'exclusion stérique.

Cette étape constitue également une démarche utile pour évaluer la production protéique et optimiser les conditions afin d'obtenir des protéines correctement repliées. La protéine d'intérêt doit être l'espèce majoritaire dans l'élution chromatographique, et le volume d'élution doit correspondre au poids moléculaire de la protéine. Des temps d'EEU plus précoces peuvent suggérer une agrégation ou un mauvais repliement de la protéine, une fois la technique maîtrisée.

Cette technique peut être réalisée en quatre jours si elle est correctement effectuée. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de maintenir des conditions stériles pour la culture cellulaire. Après cette procédure, d'autres méthodes comme la chromatographie d'exclusion par taille, la diffusion multi-angle de la lumière et la fluorométrie par balayage différentiel peuvent être réalisées afin d'évaluer l'état d'oligomérisation et la stabilité thermique de la protéine.