Name: Une expression efficace de cellules de mammifères et en une seule étape de purification extracellulaire glycoprotéines à la cristallisation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Découvrez une méthode rapide d'expression de protéines glycosylées sécrétées dans des cellules 293F pour des études structurales. Ce protocole permet d'obtenir des quantités milligrammes de protéines de haute qualité.

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Ce travail a été soutenu par NIH R01-HL119813 (à T.J.B.), L’American Lung Association RG-196051 (à T.J.B.), une subvention pilote et de faisabilité CIMED (à T.J.B.), les bourses prédoctorales 14PRE19970008 de l’American Heart Association (à Z.Y.) et 15PRE22110004 (à D.L.K.).

1. production de quantités milligramme d&#39;ADN plasmidique à grande échelle pour la transfection transitoire <ol><li> Cloner la protéine d&#39;intérêt dans un certain nombre vecteur d&#39;expression mammifère élevé de copies en utilisant le site de restriction clonage, ou une autre technique appropriée. <ol><li> Pour des résultats optimaux, utilisez pHLsec 7 vecteur, qui a un haut-C-terminal 6His-tag, une séquence forte Kozak promoteur et un signal de sécrétion optimisé. </li></ol></li><li> Transformer le plasmide sur des cellules compétentes. <ol><li> Ajouter 20 ul de cellules compétentes de E. coli sur 1 ug d&#39;ADN de plasmide et incuber sur de la glace pendant 30 min. </li><li> Des cellules de choc thermique à 42 ° C pendant 35 sec, puis incuber sur de la glace pendant 2 min. </li><li> Ajouter 300 pi de milieu de croissance microbienne (SOC) et incuber à 37 ° C pendant 45 minutes, en agitant à 220 rpm. </li><li> Les cellules de plaque sur plaque de gélose avec la sélection antibiotique approprié. <ol><li> Utilisez 100 pg / ml de carbénicilline si le plasmide est dans le vecteur pHLsec. </li></ol></li></ol></li><li> Les colonies de la culture dans 250 ml de bouillon de Luria (LB) additionné de médias 100 ug / antibiotique (carbénicilline) O / N ml à 37 ° C, sous agitation à 220 tours par minute. </li><li> On purifie l&#39;ADN à partir de la culture en utilisant un kit Salut débit Plasmid Maxi selon le protocole du fabricant. <ol><li> Eluer ADN dans un tampon EB (10 mM de Tris-Cl, pH 8,5), au lieu de tampon TE. </li><li> Aliquoter le plasmide purifié au montant nécessaire pour la transfection et conserver à -20 ° C. </li></ol></li></ol> 2. grande échelle Culture et transfection transitoire de cellules 293F <ol><li> Supplément médias 1 L 293F avec 10 ml de glutamine et 5 ml Pen / Strep (deux 100x). Conserver à 4 ° C. 5 ml Pen / Strep est une résistance suffisante dans des conditions sans sérum et la concentration en antibiotique réduite améliore la viabilité des cellules au cours de la transfection, ce qui améliore les rendements en protéines. </li><li> Culture cellules 293F dans 300 ml médias dans 1 L polycarbonate déconcertés flacons Erlenmeyer avec bouchon à évents à 37 ° C avec 8% de CO2, sous agitation dans un incubateur de culture de tissu standard. </li><li> Diluer les cellules à 5 x 10 5 / ml densité une veille de la transfection. </li><li> Le jour de la transfection, le milieu de culture par addition de supplément de volume de 10% à 2% en poids / volume dans 293F cellulaire Boost médias. <ol><li> Mesurer la concentration de glucose en utilisant un moniteur de glucose selon les instructions du fabricant et les suppléments d&#39;utilisation selon les besoins pour obtenir une concentration en glucose de 500 mg / dL. </li></ol></li><li> Ajouter kifunensine (1 pg / ml de concentration finale) à cette étape pour contrôler la glycosylation des protéines. </li><li> Calculer le volume de l&#39;ADN requis pour une pg de plasmide pour 1 x 10 6 cellules. Dans des conditions stériles, diluer l&#39;ADN dans un milieu exempt de sérum de 5 ml. </li><li> Calculer le volume de réactif de transfection requis pour une pg de plasmide par 2 ul de réactif de transfection. Dans des conditions stériles, diluer le réactif de transfection (PEI-TMC-25) dans du milieu exempt de sérum de 5 ml. </li><li> Ajouterréactif de transfection d&#39;ADN en solution dans 1 ml incréments, en mélangeant doucement. Incuber pendant 30 min à température ambiante pour les complexes ADN-réactif de se former. Puis ajouter la solution sur les cellules dans un mode goutte à goutte. </li><li> Laisser les cellules transfectées pour exprimer la protéine de 72-96 h. Supplément avec ~ 10% du volume cellulaire Boost médias quotidiens, ou au besoin pour maintenir le glucose lecture 400-600 mg / dl. </li></ol> 3. Purification <ol><li> Décanter la culture dans un flacon de centrifugeuse, centrifugeuse pendant 20 min à 1300 x g pour sédimenter les cellules, puis recueillir le surnageant. Si nécessaire, faites tourner une deuxième fois et / ou utiliser le filtre de 0,22 um pour clarifier surnageant. </li><li> Ajouter tampon de liaison de 10% du volume 10x Ni-NTA (1,5 M de NaCl, 0,5 MK 2 HPO 4, Tris 0,1 M pH 8,5 mM imidazole 50). </li><li> Préparer une colonne de gravité par addition de 2 ml de suspension épaisse de Ni-NTA dans une colonne d&#39;équilibrage et avec 10 volumes de colonne (CV) de tampon de liaison 1x. Si possible, faire toutes les étapes de colonne dans une chambre de 4 C °. AlternativEly, la protéine de refroidissement et tous les tampons sur la glace avant l&#39;étape de la colonne, et garder la protéine et recueilli accréditives sur la glace. Remarque: Ni-NTA suspension est une résine de 50% en volume et de capacité de liaison déclaré de la fabrication est de 50 mg / ml. Ni-NTA beads peuvent être rechargées pour des usages multiples </li><li> Écouler le surnageant sur la résine et de recueillir accréditives. Répétez cette étape. </li><li> Laver avec 10 CV de tampon de lavage (300 mM de NaCl, 50 mM de K 2 HPO 4, 20 mM d&#39;imidazole pH 8). </li><li> Eluer la protéine en 5 CV de tampon d&#39;élution (300 mM NaCl, 50 mM de K 2 HPO 4, imidazole 250 mM, pH 8). </li><li> Si déglycosylation est nécessaire: <ol><li> Pour un volume final de 0,5 ml, on concentre l&#39;éluat à 0,43 ml en utilisant un concentrateur de centrifugation. Si des précipités se forment, sédimenter les débris par centrifugation à 16.000 xg et 4 ° C. </li><li> Ajouter 50 pi de 500 mM Na-Citrate pH 5,5. </li><li> Ajouter 20 ul de EndoHf (1 x 10 6 U / ml). Incuber à température ambiante pendant 2 h. ne pase: L&#39;enzyme fonctionne de manière optimale à 37 ° C, ce qui peut provoquer le concentré de protéine agrégée. Prolonger l&#39;incubation RT, si déglycosylation, évaluée par SDS-PAGE ou immunoblotting, est incomplète. L&#39;enzyme n&#39;a pas d&#39;activité à 4 ° C. </li><li> Pour supprimer EndoHf: Laver amylose Résine 3x dans un tampon phosphate salin (PBS) ou un tampon de stockage final. Incuber protéines avec de la résine pendant 1 h à 4 ° C. Spin 5 min à 1000 x g pour sédimenter perles et de recueillir le surnageant. </li><li> Concentrez-protéine en utilisant un filtre approprié de centrifugation poids de coupure moléculaire et échange de tampon dans le tampon de stockage (NaCl 150 mM et HEPES 20 mM pH 7,5). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Meyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-host+expression+system+for+recombinant+production+of+challenging+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins.</a> PLoS One. 8, e68674(2013).</li>
<li>Chang, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+structural+genomics%3A+solving+the+glycosylation+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem.</a> Structure. 15, 267-273 (2007).</li>
<li>Rich, J. R., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+methods+for+the+production+of+homogeneous+human+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging methods for the production of homogeneous human glycoproteins.</a> Nat Chem Biol. 5, 206-215 (2009).</li>
<li>Wu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-2+promotes+macrophage+survival+and+lung+disease+after+respiratory+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">TREM-2 promotes macrophage survival and lung disease after respiratory viral infection.</a> J Exp Med. 212, 681-697 (2015).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitigated+cytotoxicity+and+tremendously+enhanced+gene+transfection+efficiency+of+PEI+through+facile+one-step+carbamate+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Mitigated cytotoxicity and tremendously enhanced gene transfection efficiency of PEI through facile one-step carbamate modification.</a> Adv Healthc Mater. 2, 1304-1308 (2013).</li>
<li>Elbein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosidase+inhibitors%3A+inhibitors+of+N-linked+oligosaccharide+processing%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Glycosidase inhibitors: inhibitors of N-linked oligosaccharide processing.</a> FASEB J. 5, 3055-3063 (1991).</li>
<li>Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-+and+cost-efficient+system+for+high-level+protein+production+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).</li>
<li>Kelker, M. S., Debler, E. W., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+mouse+triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells+1+%28TREM-1%29+at+1.76+A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of mouse triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) at 1.76 A.</a> J Mol Biol. 344, 1175-1181 (2004).</li>
<li>Kober, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+crystallization%2C+and+preliminary+crystallographic+analysis+of+wild-type+and+mutant+human+TREM-2+ectodomains+linked+to+neurodegenerative+and+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Preparation, crystallization, and preliminary crystallographic analysis of wild-type and mutant human TREM-2 ectodomains linked to neurodegenerative and inflammatory diseases.</a> Protein Expr Purif. 96, 32-38 (2014).</li>
<li>Yurtsever, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-cleavage+of+human+CLCA1+protein+by+a+novel+internal+metalloprotease+domain+controls+calcium-activated+chloride+channel+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Self-cleavage of human CLCA1 protein by a novel internal metalloprotease domain controls calcium-activated chloride channel activation.</a> J Biol Chem. 287, 42138-42149 (2012).</li>
<li>Sala-Rabanal, M., Yurtsever, Z., Nichols, C. G., Brett, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+CLCA1+modulates+TMEM16A+to+activate+Ca-dependent+chloride+currents+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Secreted CLCA1 modulates TMEM16A to activate Ca-dependent chloride currents in human cells.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+detect+ligand+interactions+that+promote+protein+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability.</a> Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Cellules HEK 293F offrent une forte production de protéines nécessitant modifications post-traductionnelles. Ce système permet l&#39;expression rapide et évolutive des protéines pliées contenant nativement disulfures, la glycosylation, la phosphorylation et qui, autrement, être absent en utilisant plus d&#39;outils d&#39;expression de routine. En outre, ce système peut être utilisé pour l&#39;expression et la purification de complexes multi-protéines simplement par co-transfection de plusieurs plasmides. Outre TREM2, ce...

Comprendre la structure des protéines à un niveau atomique est clé pour découvrir la base moléculaire des voies biologiques et de maladies. X-ray cristallographie des protéines est la méthode la plus largement utilisée / applicable pour la détermination des structures macromoléculaires. Le principal défi de cette méthode est d&#39;obtenir des quantités suffisantes de bien plié, protéine pure. Cela devient un problème particulier lorsque l&#39;on travaille avec des protéines sécrétées mammifères, qui subissent des modifications post-traductionnelles spécifiques. Protéines bactérienne exprimées sont la principale source de protéines cristallisées déposés dans la Protein Data Bank 1. Des systèmes d&#39;expression bactériens sont largement préférés parce qu&#39;ils sont rapides, peu coûteux et généralement produire des rendements élevés de protéine. Cependant, domaines extracellulaires des protéines de mammifère exprimées dans des bactéries sont souvent pas correctement repliés, dans ce cas, repliement et purification extensive étapes sont nécessaires pour obtenir de façon homogène foLDED protéines. En outre, de nombreuses protéines de mammifères exigent glycosylation post-traductionnelle pour atteindre un repliement approprié 2. Bien que l&#39;expression et la glycosylation dans les cellules de levure ou d&#39;insectes peuvent surmonter le problème de pliage, modifications post-traductionnelles, y compris la glycosylation, diffèrent considérablement de celles des cellules de mammifères 3, produisant des protéines avec des modifications incorrectes ou non-homogènes. Les cellules de mammifères expriment toute la machinerie moléculaire nécessaire pour assurer modifications et pliage de post-traductionnelle appropriés; Toutefois, ces systèmes d&#39;expression ne sont pas généralement préféré par la plupart des laboratoires, en raison de rendements limités et des coûts élevés de réactifs et de consommables. Polyéthylèneimine (PEI), un réactif de transfection norme est relativement pas cher mais impose cytotoxicité considérable et une faible efficacité de transfection, résultant en une augmentation des coûts dans les médias de la cellule, l&#39;ADN, et de l&#39;équipement en culture. Beaucoup de solutions de rechange aux PEI sont prohibitifs. Nous nous adressonsces questions en décrivant une combinaison de l&#39;amélioration des outils de culture cellulaire et chimiquement modifiée PEI pour la méthode rapide et relativement peu coûteux pour l&#39;expression de protéines de mammifères sécrétées, suivie d&#39;une purification en une seule étape. Ce procédé donne des rendements suffisants robuste pour des études fonctionnelles et biochimiques 4, et dans certains cas, se traduit par une protéine se prêtent à une cristallisation sans autre purification. Ce protocole décrit plusieurs techniques pour maximiser l&#39;expression et le rendement pour les protéines de mammifères sécrété dans le rein embryonnaire humain (HEK) 293F cellules cultivées en suspension. L&#39;efficacité de transfection (et le coût), la production et la purification de la protéine sont grandement améliorées tout en suivant le protocole. PEI modifié par l&#39;addition de carbamates par réaction d&#39;ouverture de cycle en une seule étape (PEI-TMC-25, synthèse et les propriétés décrites en détail dans la référence 5) améliore grandement l&#39;efficacité de transfection, réduit la cytotoxicité de cationiquerupture de la membrane et par conséquent de réduire les coûts d&#39;expérimentation. En outre, la viabilité des cellules et l&#39;expression des protéines sont grandement améliorées grâce à l&#39;ajout de compléments de culture à fournir du glucose et des vitamines. Il est important pour la production de protéines glycosylées, le traitement par la kifunensine, un inhibiteur chimique non-toxique de la mannosidase I, produit des protéines avec définis glycanes immatures, qui peuvent être éliminés par la EndoHf d&#39;endoglycosidase pour produire des protéines avec un seul N-acétylglucosamine à la place du une pleine longueur glycane 6 N-liée. Enfin, la sécrétion de protéines dans un milieu défini chimiquement sans sérum permet une purification rapide et facile pour les études structurales et biochimiques. Single-step nickel-acide nitrilotriacétique de (Ni-NTA) purification de résine élimine la majorité des espèces contaminantes dans le surnageant et, dans certains cas, peut donner une protéine d&#39;une pureté suffisante pour la cristallisation.

<table><tbody><tr><td>Flacons de culture</td><td>GeneMate</td><td>F-5909B</td><td></td></tr><tr><td>293 Freestyle Media</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>12338-018</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>À utiliser à la place du</td></tr><tr><td>réactif de transfection Glutamine Hype 5</td><td>Oz Biosciences</td><td>HY01500</td><td></td></tr><tr><td>293réactif de transfection de fectine</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>12347019</tr><tr><td>réactif de transfection PEI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow&nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>Endo Hf</td><td>NEB</td><td>P0703L</td><td></td></tr><tr><td>Résine d’amylose</td><td>NEB</td><td>E8021S</td><td></td></tr><tr><td>Cell Boost R05.2</td><td>HyClone</td><td>SH30584.02</td><td>Supplément de culture cellulaire</td></tr><tr><td>GlucCell</td><td>CESCO Bioengineering</td><td>DG2032</td><td>Système de surveillance du glucose</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>519850.91</td><td>Milieu sans sérum pour la transfection de l’ADN</td></tr><tr><td>Luria Broth (LB Media)</td><td>Life Technologies</td><td>10855-001</td><td></td></tr><tr><td>GC10 Cellules compétentes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2919</td><td></td></tr></tbody></table>

une expression efficace de cellules de mammifères et en une seule étape de purification extracellulaire glycoprotéines à la cristallisation

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

La production de protéines de mammifères sécrétées pour les études structurales et biophysiques peut être difficile, longue et coûteuse. Voici un protocole rapide et économique pour l’expression des protéines sécrétées dans les cellules de mammifères et la purification en une étape à l’aide de la chromatographie d’affinité du nickel. Le système est basé sur la transfection transitoire à grande échelle de cellules de mammifères en suspension, ce qui réduit considérablement le temps de production de protéines, car il élimine des étapes, telles que le développement de virus d’expression ou la génération de lignées cellulaires d’expression stables. Ce protocole utilise des agents de transfection bon marché, qui peuvent être facilement fabriqués par une simple modification chimique, ou des agents de transfection à prix modéré, qui augmentent le rendement grâce à une efficacité de transfection accrue et à une cytotoxicité réduite. Une surveillance attentive et le maintien de la glycémie dans les milieux augmentent le rendement en protéines. Le contrôle de la maturation des glycanes natifs à l’étape d’expression augmente le rendement final de protéines de mammifères correctement repliées et fonctionnelles, qui sont des propriétés idéales pour poursuivre la cristallographie aux rayons X. Dans certains cas, la purification en une seule étape produit des protéines d’une pureté suffisante pour la cristallisation, ce qui est démontré ici à titre d’exemple.

Ici suit les résultats de ce système d&#39;expression appliquée à une immunoglobuline sécrétée 13 kDa (Ig) le domaine de récepteur de protéine humaine exprimée de déclenchement sur les cellules myéloïdes (2, résidus 19-132 hTREM2). TREM2 est une protéine transmembranaire de type I contenant un seul domaine de type Ig extracellulaire qui dispose de deux ponts disulfure et deux sites de glycosylation N-liés. Contrairement à de nombreux autres domaines Ig protéines 8, TREM2 ne se prêtaient pas à repliement des c...

Il s’agit d’un protocole rapide et rentable pour la production de protéines de mammifères glycosylées sécrétées et la purification ultérieure en une seule étape avec des rendements suffisants de protéines homogènes pour la cristallographie aux rayons X et d’autres études biophysiques.

Une expression efficace de cellules de mammifères et en une seule étape de purification extracellulaire glycoprotéines à la cristallisation

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

L'objectif général de cette technique d'expression de protéines de mammifères est de produire des quantités de l'ordre du milligramme de protéines correctement repliées, adaptées à des études structurales, biophysiques et fonctionnelles. Le principal avantage de cette technique réside dans son protocole rapide et simple permettant d'obtenir des protéines de mammifères sécrétées et une concentration en pureté requise pour des études structurales. En général, nous constatons que la plupart des problèmes liés au rendement protéique sont dus à l'état de santé et à la viabilité des cellules.En surveillant attentivement la viabilité cellulaire et les niveaux de sucre dans le milieu, vous améliorez considérablement le rendement en protéines et prolongez l'utilité des cellules. Il est également très important de surveiller la densité cellulaire. Nous constatons que si, à un moment quelconque avant la transfection, les cellules dépassent 2 millions de cellules par millilitre, le rendement en protéines est fortement réduit. Pour réaliser une culture à grande échelle de cellules 293F, complétez un litre de milieu 293F avec 10 millilitres de glutamine 100 x et cinq millilitres de pénicilline-streptomycine 100 x.L'antibiotique est à une concentration suffisante en conditions sans sérum, et la concentration réduite d'antibiotique améliore la viabilité cellulaire pendant la transfection, ce qui augmente les rendements protéiques en culture. Cultiver les cellules 293F dans 300 millilitres de milieu dans des flacons Erlenmeyer en polycarbonate de un litre, munis de plots et de bouchons ventilés, à 37 degrés Celsius avec 8 % de dioxyde de carbone, sous agitation dans un incubateur standard pour culture cellulaire, un jour avant la transfection ; diluer les cellules à une densité de 0,5 million de cellules par millilitre le jour de la transfection. Compléter le milieu de culture en ajoutant 10 % en volume de Cell Boost à 2 % en poids par volume dans le milieu 293F.Ajouter du kafu visible à cette étape pour contrôler la glycosylation des protéines. Préparer les solutions d'ADN et de réactif de transfection dans un milieu sans sérum et incuber pendant cinq minutes. Ensuite, ajouter le réactif de transfection à la solution d'ADN par incréments d'un millilitre en mélangeant.Incuber doucement pendant 30 minutes à température ambiante afin de permettre la formation des complexes ADN-réactif. Ensuite, ajouter la solution aux cellules de manière goutte à goutte, et laisser les cellules transfectées exprimer la protéine pendant 72 à 96 heures pour purifier la glycoprotéine. Tout d'abord, verser délicatement le milieu de culture dans un flacon de centrifugation et centrifuger pendant 20 minutes à 1300 ×g. Pour former un culot de cellules, récupérer le surnageant et, si nécessaire, effectuer une seconde centrifugation ou utiliser un filtre de 0,22 micron pour clarifier le surnageant.Ensuite, ajouter un volume de 10 % de tampon de liaison 10 x nickel nitrolo, acide triacétique ou nickel NTA. Préparer ensuite une colonne par gravité à quatre degrés Celsius en ajoutant deux millilitres de suspension de nickel NTA dans une colonne et en équilibrant avec 10 volumes de colonne de tampon de liaison 1 x, travaillé à quatre degrés Celsius. Faire passer le surnageant sur la résine et recueillir l'écoulement.Après avoir versé le surnageant sur la colonne, effectuer un lavage avec 10 volumes de colonne de tampon de lavage. Ensuite, éluer la protéine dans cinq volumes de colonne de tampon d'élution. Si une déglycosylation est nécessaire pour un volume final de 0,5 millilitre, concentrer l'EIT à 0,43 millilitre à l'aide d'un concentrateur par centrifugation, puis éliminer tout débris par centrifugation à 16 000 ×g et 4 degrés Celsius.Ensuite, ajouter 50 microlitres de citrate de sodium 500 millimolaire, pH 5,5 et 20 microlitres d'endo HF. Incuber le mélange à température ambiante pendant deux heures pour éliminer l'endo HF. Laver d'abord la résine amylose trois fois dans une solution saline tamponnée au phosphate. Incuber la protéine avec la résine lavée pendant une heure à quatre degrés Celsius.Après l'incubation, effectuez une centrifugation de cinq minutes à 1000 Gs pour former un culot de résine et récupérez le surnageant. Concentrez la protéine à l'aide d'un filtre de centrifugation doté d'une coupure de poids moléculaire appropriée, puis effectuez un échange de tampon dans le tampon de stockage indiqué. Voici des résultats représentatifs de gel SDS-PAGE pour une protéine sécrétée exprimée dans des cellules traitées au ciné suivant une chromatographie d'affinité au nickel.La première piste correspond à la protéine avant la déglycosylation, et la seconde piste correspond à la protéine après déglycosylation par l'endo HF. La protéine glycosylée migre environ 10 kilodaltons plus haut, puis se concentre en une seule bande, conforme au poids moléculaire prédit après déglycosylation, suite à l'étape unique de purification. Les tamis de cristallisation ont été préparés selon la méthode de la goutte suspendue.L'image supérieure montre le premier cristal obtenu et l'image inférieure illustre les conditions de cristallisation optimisées. Cela démontre que l'homogénéité biochimique de la protéine d'intérêt peut constituer un facteur déterminant pour la réussite de la cristallisation, et qu'un système d'expression mammalien optimisé produit des protéines adaptées à cette cristallisation. Une purification supplémentaire de la protéine purifiée par nickel est facilement réalisée par chromatographie d'exclusion stérique.Cette étape constitue également une démarche utile pour évaluer la production protéique et optimiser les conditions afin d'obtenir des protéines correctement repliées. La protéine d'intérêt doit être l'espèce majoritaire dans l'élution chromatographique, et le volume d'élution doit correspondre au poids moléculaire de la protéine. Des temps d'EEU plus précoces peuvent suggérer une agrégation ou un mauvais repliement de la protéine, une fois la technique maîtrisée.Cette technique peut être réalisée en quatre jours si elle est correctement effectuée. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de maintenir des conditions stériles pour la culture cellulaire. Après cette procédure, d'autres méthodes comme la chromatographie d'exclusion par taille, la diffusion multi-angle de la lumière et la fluorométrie par balayage différentiel peuvent être réalisées afin d'évaluer l'état d'oligomérisation et la stabilité thermique de la protéine.

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L’expression de protéines recombinantes par des systèmes mammifères devient une méthode attrayante pour produire des complexes protéiques pour la biologie structurale. Nous présentons ici un système d’expression simple mais très efficace utilisant des cellules de mammifères cultivées en suspension pour purifier des complexes protéiques pour des études structurales.

Expression de protéines recombinantes pour la Biologie Structurale HEK 293F cellules en suspension: une approche nouvelle et accessible

Domaines à doigt de zinc sont intrinsèquement perméable cellule et capable de médier la délivrance de protéines dans une large gamme de types de cellules de mammifères. Ici, un protocole étape par étape détaillé pour la mise en œuvre de la technologie à doigt de zinc pour la livraison de protéine intracellulaire est présenté.

Protein livraison directe aux cellules de mammifères en utilisant la cellule perméable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt; Domaines doigt de zinc

Nous décrivons ici un système d’expression de granzyme rentable utilisant des cellules HEK293T qui produit des rendements élevés de protéase pure, entièrement glycosylée et enzymatiquement active.

Un rendement élevé et Expression System coût-efficace de granzymes humain dans des cellules de mammifères

La production à l’échelle du laboratoire de protéines eucaryotes avec une modification post-traductionnelle appropriée représente un obstacle important. Voici un protocole robuste avec une mise en place et un délai d’exécution rapides pour l’expression de protéines à l’aide d’un système d’expression de mammifères. Ce système prend en charge le marquage sélectif des acides aminés, le marquage sélectif des protéines et les modulateurs de petites molécules de la composition des glycanes.

High Yield expression de protéines recombinantes humaines avec la transfection transitoire de cellules HEK293 en suspension

Nous présentons des approches pour la caractérisation biophysique et structurelle des glycoprotéines avec le pli de l’immunoglobuline par interférométrie biolayer, calorimétrie isotherme de titration et cristallographie aux rayons x.

Caractérisation des glycoprotéines dont le pli d’immunoglobuline par cristallographie aux rayons x et Techniques biophysiques

La purification des canaux ioniques est souvent difficile, mais une fois atteint, il peut potentiellement permettre in vitro les enquêtes des fonctions et des structures des canaux. Nous décrivons ici les procédures pas à pas pour l’expression et purification des protéines de mammifères bestrophin, une famille de Ca2 +-activé les canaux Cl– .

Expression et Purification des canaux ioniques de mammifères Bestrophin

Ce protocole décrit les techniques utilisées pour déterminer les structures de canal d’ion par cryo microscopie électronique, y compris un système baculovirus utilisé pour exprimer efficacement gènes dans des cellules de mammifères avec le minimum d’effort et de toxicité, d’extraction de protéine, de purification, contrôle qualité, préparation des échantillons grille et dépistage, ainsi que collecte de données et traitement.

Expression et Purification de l’homme sensible lipides canal de Cation TRPC3 pour la détermination de structure par particule Cryo microscopie électronique

Ce protocole décrit une configuration pour la cristallisation du transporteur de stérols ABCG5/G8. ABCG5/G8 est reconstitué en bicelles pour la cristallisation en gouttes suspendues. Le protocole ne nécessite pas de matériaux ou de substrats spécialisés, ce qui le rend accessible et facile à adapter dans n’importe quel laboratoire pour déterminer la structure de la protéine par cristallographie aux rayons X.

Cristallisation ABCG5/G8 dans un environnement bicellaire lipidique pour la cristallographie aux rayons X

Les études structurales et biochimiques des transporteurs membranaires humains nécessitent des quantités de quelques milligrammes de protéines stables, intactes et homogènes. Nous décrivons ici des méthodes évolutives pour cribler, exprimer et purifier les transporteurs de solutés humains à l’aide de gènes optimisés pour les codons.

Expression et purification à haut débit de vecteurs de solutés humains pour des études structurales et biochimiques

Découvrez une méthode rapide d'expression de protéines glycosylées sécrétées dans des cellules 293F pour des études structurales. Ce protocole permet d'obtenir des quantités milligrammes de protéines de haute qualité.

Une expression efficace de cellules de mammifères et en une seule étape de purification extracellulaire glycoprotéines à la cristallisation (Vidéo) | JoVE Journal

Une expression efficace de cellules de mammifères et en une seule étape de purification extracellulaire glycoprotéines à la cristallisation

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