Name: Deux méthodes de fixation des cellules humaines de lendomètre stromales primaires de spécimens hystérectomie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Découvrez deux méthodes de fixation des cellules stromales endométriales primaires à partir de spécimens d'hystérectomie. Ces protocoles par grattage et trypsine permettent d'étudier la physiologie et la pathologie endométriales in vitro.

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Nous remercions la collaboration de Dr Thao Dang et les membres de son laboratoire pour l&#39;utilisation de leur équipement d&#39;imagerie et d&#39;un microscope. Nous remercions également la banque de tissus biologiques et de tissus installation de recherche (BTRF) noyau, Jeff Harper, et les résidents de l&#39;Université de Virginie de nous fournir le tissu utérin. Nous remercions Karol Szlachta pour l&#39;aide avec vue d&#39;ensemble schématique.

Spécimens hystérectomie utilisés dans ce manuscrit ont été recueillies en concordance avec un protocole d&#39;éthique de l&#39;Université de la CISR approuvé numérotée IRB-RSS # 14424. 1. Acquisition des échantillons de clinique Source <ol><li> Obtenir gouvernement et des principes éthiques en établissement et de la documentation d&#39;approbation avant de commencer. </li><li> Réaliser toutes les étapes des conditions stériles. </li><li> Préserver le tissu dérivé du patient dans les médias (RPMI ou DMEM / High glucose) dans un tube de 50 ml à 4 ° C si l&#39;échantillon ne peut pas être traitée dans la culture immédiatement. Les échantillons peuvent être stockés dans cet état pendant un maximum de 24 heures. </li><li> Laver échantillon de tissu trois fois avec 1X stérile tamponnée au phosphate (PBS) et jeter la solution entre les lavages. </li></ol> 2. Préparation de lignées cellulaires primaires à l&#39;aide de la méthode Grattage <ol><li> Ajouter 4-10 ml de milieu de croissance (RPMI ou DMEM / High Glucose supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline-streptomycin) de tissu et ajouter Fungizone (0,25 ug / ml de concentration finale) pendant 30 min. </li><li> Jeter le milieu de croissance. </li><li> Laver le tissu deux fois avec du PBS 1X. </li><li> Placer le tissu sur une plaque de culture de 6 cm de cellules de distinguer entre les couches myomètre et l&#39;endomètre (se référer aux figures 2A à 2C pour une description plus détaillée). Séparer l&#39;endomètre. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un scalpel ou une lame de rasoir, sectionner le tissu en petits morceaux en grattant sur la boîte de culture de 6 cm de cellule. Ces rayures faciliter la fixation des cellules de l&#39;endomètre primaires émergents. Par rapport à la méthode de la trypsine, plus le tissu est nécessaire (voir la figure 2D pour une approximation). </li><li> Doucement, ajouter 2 ml de milieu de croissance à plat rayé (fragments de tissus seront visibles et idéalement immobilisé à partir du mouvement de grattage). </li><li> Transférer la plaque (s) à un incubateur de culture cellulaire désignée (37 ° C et 5% CO 2). Désigner un lieu pour les lignes de cellules primaires, loin de OTHer des boîtes de culture cellulaire. Les cultures primaires sont plus sensibles à l&#39;infection et de contamination. </li><li> Examiner les cellules au microscope optique quotidien. De petites populations de cellules devraient émerger de deux ou trois jours autour des tissus tranches (voir la figure 3B). </li><li> Pour maintenir les cultures, laver délicatement avec du PBS 1X et ajouter un milieu de croissance frais (2 ml) tous les trois jours. Lorsque l&#39;augmentation du taux de prolifération, des milieux de croissance supplémentaire (3-4 ml) peuvent être ajoutés à la plaque de culture de 6 cm (s). Remarque: Pendant le lavage et médias changements, des morceaux de tissu seront probablement aspiré. Ceci n&#39;affectera pas la croissance de cellules adhérentes. Des morceaux de tissu doivent être aspirés par l&#39;étape ultérieure (2,10) en tant que nouvelles colonies sont peu susceptibles d&#39;apparaître après une semaine. </li><li> Lorsque la plaque de 6 cm est d&#39;environ 75 - 80% de confluence (voir la figure 3B), passage en utilisant 0,05% de trypsine. Cellules primaires ne peuvent pas être passées indéfiniment - geler bas une plaque de cellules dès que deux ou trois plaques sont maintained. Si plusieurs passages sont nécessaires, conformément à un protocole d&#39;immortalisation (revue dans Ref 3). </li></ol> 3. Préparation de lignées cellulaires primaires à l&#39;aide de la méthode de la trypsine <ol><li> Placer un petit morceau de tissu endométrial (voir la figure 2D pour un rapprochement) dans 2 ml de trypsine à 0,25% additionné de kanamycine (0,03 mg / ml de concentration finale). </li><li> Incuber les tissus à 37 ° C sur une plateforme rotative pendant 30 minutes. </li><li> Vortex brièvement le tissu. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 200-400 g pendant 2 min et jeter le surnageant. </li><li> Ajouter trypsine frais et à la kanamycine. </li><li> Faire incuber le tissu à 37 ° C tout en tournant pour un hr. </li><li> Vortex le tissu pour 5-10 sec. </li><li> Ajouter 2 ml de milieu de croissance (supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline-streptomycine) pour désactiver la trypsine. </li><li> Centrifuger les cellules à 200-400 g pendant 2-3 min. </li><li> Jeter le surnageant et ajouter 2 ml de grandire médias à le culot cellulaire. </li><li> Plaque sur une boîte de culture de 6 cm de cellule. Grattage de la plaque comme dans l&#39;étape 2.5 de préparation de lignées cellulaires primaires en utilisant la méthode Grattage n&#39;est pas nécessaire, mais améliore la fixation et l&#39;excroissance de cultures primaires. </li><li> Surveillance de cellules sous un microscope optique quotidien. Les cellules sont généralement visibles au microscope optique après 24-48 heures (voir la figure 3C). </li><li> Pour maintenir les cultures, de surveiller les cellules et changer de support tous les 2-3 jours comme dans l&#39;étape 2.9. </li><li> Pour le passage des cellules, utilisez 0,05% ou 0,25% de trypsine lorsque les cellules atteignent 75-80% de confluence (voir la figure 3C). </li></ol> 4. Sauvegarde tissu supplémentaire pour l&#39;analyse (Snap congélation et la fixation au formol) <ol><li> Laver l&#39;échantillon deux fois avec du PBS 1X. </li><li> Aspirer autant de liquide que possible. </li><li> Snap congélation, placer l&#39;échantillon de tissu de l&#39;endomètre dans un tube de 1,7 centrifugeuse (voir les figures 2F et 2G). Placez le 1.7tube de centrifugeuse dans l&#39;azote liquide pendant 10 secondes ou jusqu&#39;à ce qu&#39;il puisse être considéré que le tissu a gelé le bas. Remarque: Prenez soin de ne pas toucher directement l&#39;azote liquide lors de la préparation des échantillons. Les échantillons peuvent être conservés à -80 ° C jusqu&#39;à leur traitement ultérieur ou d&#39;analyse. </li><li> Pour la fixation au formol, couper un petit morceau de tissu endométrial (voir la figure 2H), et plonger dans 10% du formol tamponné de zinc. Après 24 heures, éliminer le formol et ajouter de l&#39;éthanol à 70% des échantillons de tissu jusqu&#39;à ce que le traitement ultérieur. </li></ol> 5. Immunofluorescence (IF) <ol><li> Cellule fixation <ol><li> Préparer les cellules sur une lame de culture ou de la plaque. </li><li> Doucement, laver les cellules avec du PBS 1X. </li><li> Ajouter pré-réfrigéré (4 ° C) et de l&#39;acétone Methanol (mélangés dans un rapport 1:1) pendant 5 min. </li><li> Air sécher la lame avant de poursuivre. Glisser peut être stocké à 4 ° C pendant 1 à 2 semaines si nécessaire. </li></ol></li><li> Traitement SI <ol><li> Réhydrater les cellules avec du PBS 1X pendant 10 min. Pour la following étapes 1-6, procéder à tous les lavages et les incubations sur une plate-forme tournante. </li><li> Bloc à l&#39;aide de PBS 1X supplémenté avec 1% de sérum-albumine bovine (BSA) et 1% d&#39;espèces sérum spécifique (2 ème source d&#39;anticorps) pendant 30 min à température ambiante (RT). </li><li> Incuber dans l&#39;anticorps primaire (voir les recommandations du fabricant pour la dilution de l&#39;anticorps). Reportez-vous aux documents d&#39;anticorps spécifiques. Diluer l&#39;anticorps primaire dans un tampon de blocage frais comme à l&#39;étape 5.2.2. Cette incubation peut être réalisée pendant au moins 2 heures à température ambiante ou une nuit à 4 ° C. </li><li> Laver 3 fois avec du PBS 1X pendant 5 min chacun. </li><li> Incuber dans l&#39;anticorps secondaire (voir les recommandations du fabricant pour la dilution de l&#39;anticorps). Diluer l&#39;anticorps secondaire dans du tampon de blocage frais comme à l&#39;étape 5.2.2. Pour empêcher la photo-blanchiment, il est important de procéder à des étapes ultérieures, et ce en l&#39;absence de lumière. </li><li> Laver 3 fois avec du PBS 1X pendant 5 min chacun. </li><li> Thoroughly sécher les diapositives. </li><li> Ajouter milieux de montage et solution de contre-coloration DAPI. </li><li> Appliquer la lamelle et sceller les bords à l&#39;aide d&#39;étanchéité (s). Lames peuvent être stockées à 4 ° C dans l&#39;obscurité pendant jusqu&#39;à 2 semaines. </li></ol></li></ol> 6. Extraction de l&#39;ARN <ol><li> Pellet 1 x 10 7 cellules par centrifugation. Tous les matériaux et les réactifs de ce protocole doivent être RNase. </li><li> Lyser les cellules dans 1 ml de réactif TRIZOL, et incuber les échantillons homogénéisés pendant 10 min à température ambiante pour compléter la dissociation des complexes de nucléoprotéines. </li><li> Ajouter 200 ul de chloroforme pour 1 ml de TRIZOL. Secouer vigoureusement à la main pendant 15 secondes et incuber pendant 2-3 min à température ambiante. </li><li> Centrifuger à la vitesse maximale (15 000 xg) pendant 15 min à 4 ° C. Trois couches en résulteront. </li><li> Transférer la phase aqueuse supérieure dans un tube à centrifuger frais. Ajouter 1 pi de glycogène pour augmenter le rendement de l&#39;ARN; Toutefois, cette étape n&#39;est nécessaire que lorsque une petitequantité d&#39;ARN est prévu. </li><li> Ajouter 0,5 ml d&#39;alcool isopropylique à la couche aqueuse, et inverser les échantillons 3 à 5 fois. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 min. Pour augmenter le rendement, les échantillons peuvent être placés dans -20 ° C ou -80 ° C pendant 30 min. </li><li> Centrifuger à vitesse maximale pendant 10 minutes à 4 ° C. </li><li> À ce stade, une petite pastille d&#39;ARN doit être visible. Jeter le surnageant. </li><li> Laver l&#39;ARN avec 1 ml d&#39;éthanol à 75%. </li><li> Centrifuger à vitesse maximale pendant 5 min et jeter le surnageant. Les échantillons peuvent être lavées une fois de plus à éliminer les contaminants inorganiques, mais cette étape n&#39;est pas nécessaire. </li><li> En bref, sécher le culot d&#39;ARN jusqu&#39;à culot d&#39;ARN est sec (prend habituellement 7-10 min). Remarque: Une étape supplémentaire peut être utilisé pour diminuer la matière inorganique et de diminuer le temps de séchage. Après avoir jeté le surnageant du lavage à l&#39;éthanol, les échantillons de rotation à la vitesse maximale pendant une minute supplémentaire et aspirer le liquide résiduel. Prenez soin de ne pas aspirer à granulés. </li><li> Dissoudre l&#39;ARN dans l&#39;eau exempte de RNase, en fonction de la taille de la pastille d&#39;ARN. Les volumes varient généralement 10-50 pi. </li><li> Incuber les échantillons à 55 ° C pendant 10 min, et de mesurer la concentration de l&#39;ARN. </li><li> Conserver les échantillons à -20 ° C jusqu&#39;à leur traitement ultérieur. </li></ol> 7. Transcription inverse <ol><li> Amener l&#39;ARN de l&#39;échantillon (1-3 pg) jusqu&#39;à un volume de 9 pi avec H 2 O. </li><li> l&#39;ARN de la chaleur à 70 ° C pendant 10 min. </li><li> Pour générer un mélange maître AMV, combiner les réactifs suivants: 5 ul de dNTP (concentration de travail de 50 uM), 5 ul de oligos N6 ADN (concentration de travail de 80 uM), 5 ul de tampon 5X AMV, et 1 ul de AMV . Cette solution maître de mélange est conçu par un échantillon. </li><li> Ajouter 16 pi de mélange maître de l&#39;ARN chauffée. Le volume réactionnel final est de 25 ul de réaction. </li><li> Utiliser les conditions suivantes PCR pour la transcription inverse: (étape 1) de 42 ° C pendant 90 min, (Stage 2) 95 ° C pendant 5 min, et (étape 3) 4 ° C jusqu&#39;à traitement ultérieur. </li></ol> 8. PCR en temps réel <ol><li> Mener des réactions de PCR en utilisant les amorces, les températures de recuit, les nombres de cycles, et de réactifs figurant au tableau 1. Remarque: Il est idéal pour suivre les instructions du fabricant pour l&#39;utilisation de réactifs de PCR (voir à la société et numéros de catalogue de matériaux). </li></ol> 9. In vitro Protocole décidualisation (Dérivé de Ref 4 et 5) <ol><li> Plate cellules de l&#39;endomètre. </li><li> Atteindre une confluence de 75-85%. </li><li> Après que les cellules deviennent confluentes, laver une fois avec du PBS 1X. </li><li> Rapidement, ajouter des médias sans hormones (phénol libre RPMI supplémenté avec 5% de charbon bande de FBS et 1% de pénicilline-streptomycine). </li><li> Après 24 heures, ajouter des médias d&#39;hormone libre supplémenté avec de l&#39;acétate de médroxyprogestérone (MPA) à une concentration finale de 1 uM et 8 bromoadenosine-3 &#39;, 5&#39;-Monophosphate cyclique (AMPc) à une concentration finale de 0,5 mM. </li><li> Après au moins 48 heures, arrêter la réaction et sauver la plaque (s) pour un traitement ultérieur. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à divulgation.

D&#39;autres groupes ont décrit et adapté méthodologie pour la préparation de cultures stromales endométriales, dont la plupart utilisent la collagénase 4,12,13,15-18. Dans ce manuscrit, nous avons fourni la méthodologie et les données pour deux endomètre méthodes de culture de cellules stromales primaires simplifiées, qui sont tous deux utilisés par notre laboratoire pour des raisons économiques et de la disponibilité pratique de la trypsine et / ou une lame de rasoir. Lorsque l&...

Le corpus de l&#39;utérus humain est composé de trois couches, la perimetrium (ou séreuse), le myomètre et l&#39;endomètre. Distinguer chacune de ces couches est une étape importante pour établir des lignées cellulaires de l&#39;endomètre. Le perimetrium est la couche la plus externe de l&#39;utérus et composée de fines cellules séreuses. Le myomètre est la couche intermédiaire épaisse de l&#39;utérus et le composé de cellules musculaires lisses. L&#39;endomètre est identifié en tant que couche intérieure de l&#39;utérus et comprend des populations de cellules épithéliales et stromales. L&#39;endomètre est encore subdivisé en couche basalis dont la tige population cellulaire est l&#39;hypothèse de repeupler la couche de functionalis environ tous les 28 jours 1. La couche de functionalis de l&#39;endomètre humain subit des modifications biochimiques et morphologiques importantes en réponse aux hormones circulant. Ces hormones sont dérivées de la glande pituitaire et les ovaires. Laproduction coordonnée et la libération d&#39;hormones entraîne un cycle de reproduction. Le cycle de reproduction est conçu pour préparer l&#39;endomètre pour les événements potentiels d&#39;implantation embryonnaire. Chez les humains, le cycle de reproduction est connu comme &quot;le cycle menstruel&quot; et divisé en trois phases - proliférative, sécrétoires, et menstruels. La phase proliférative implique la prolifération de l&#39;endomètre functionalis couche tandis que la phase sécrétoire est marquée par functionalis maturation. Plus précisément, les modifications extracellulaires, les sécrétions, et la différenciation cellulaire signalent une implantation potentielle. Si l&#39;implantation ne se produit pas avant la fin de la phase de sécrétion, la couche functionalis de l&#39;endomètre est éliminée au cours de la phase menstruel. L&#39;importance de la menstruation et les événements qui déclenchent l&#39;effusion de la couche de functionalis sont encore en discussion. Chez l&#39;homme, il a été posé que la menstruation est le résultat d&#39;un événement à mi-sécrétoire différenciation de phase spécifique connuecomme &quot;décidualisation spontanée» 2. Dans ce manuscrit, nous proposons une méthodologie détaillée pour les deux méthodes d&#39;isolement de cellules stromales de l&#39;endomètre, et utilisons une combinaison de l&#39;immunofluorescence et des images numériques pour démontrer l&#39;efficacité de ces approches. En outre, nous appliquons un modèle couramment utilisé dans vitro de décidualisation spontanée pour confirmer l&#39;isolement de cellules stromales de l&#39;endomètre.

<table><tbody><tr><td>0,25 trypsine ou 0,05 % de trypsine&nbsp ;</td><td>Hyclone</td><td>SH3023602 ou SH30004202</td><td></td></tr><tr><td>1,7 micro tube à centrifuger&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-272A</td><td></td></tr><tr><td>1 & micro ; L, 20 et micro ; l, 200 ml et 1 000 & micro ; l Pipette&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-401,24-402, 24-412, 24-430</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique de 15 ml.</td><td>Hyclone</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Tube Conique 50 ml&nbsp ;</td><td>Hyclone</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Plat de Culture Cellulaire de 6 cm&nbsp ;</td><td>Thermo scientific</td><td>12-556-002</td><td></td></tr><tr><td>Chambres à 8 puits&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-4162</td><td></td></tr><tr><td>Acétate&nbsp ;</td><td>Fisher scientific</td><td>C4-100</td><td></td></tr><tr><td>AMV RT Enzyme/Tampon&nbsp ;</td><td>Bio Labs</td><td>M077L</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1605-100</td><td></td></tr><tr><td>Zinc formol tamponné&nbsp ;</td><td>Thermo</td><td>59201ZF</td><td></td></tr><tr><td>Bande de charbon de bois FBS&nbsp ;</td><td>Fisher</td><td>NC9019735</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Housse de protection&nbsp ;</td><td>Fisher Brand</td><td>12-544D</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur cyclique (cAMP)&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>B7880</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Glycémie élevée&nbsp ;</td><td>Hyclone</td><td>SH30243FS</td><td></td></tr><tr><td>dNTP&nbsp ;</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td></td></tr><tr><td>Âne Anti Chèvre -TRITC&nbsp ;</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-3855</td><td></td></tr><tr><td>Sérum d’âne&nbsp ;</td><td>Jackson s lab</td><td>017-000-002</td><td></td></tr><tr><td>E Anticorps anti-cadhérine&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Epitomics</td><td>1702-1</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-1</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-600-511</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone Amphotéricine B&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>Sonde GAPDH&nbsp ;</td><td>Technologies de la vie</td><td>HS99999905</td><td></td></tr><tr><td>Glycogène&nbsp ;</td><td>5Prime</td><td>2301440</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre Anti Souris - FITC&nbsp ;</td><td>Jackson s Lab</td><td>115-096-003</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycine&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de médroxyprogestérone (MPA)&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>M1629</td><td></td></tr><tr><td>MeOH (Méthanol)&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4-08-1</td><td></td></tr><tr><td>Supports de montage (avec DAPI)</td><td>Labratories Vecteurs</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>N6 ADN Oligos&nbsp ;</td><td>Grattoir Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Numéro 15&nbsp ; &nbsp ;</td><td>BD</td><td>371615</td><td></td></tr><tr><td>Pan Cytokératine&nbsp ; Souris mAB&nbsp ;</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>4545</td><td></td></tr><tr><td>PBS (solution saline tamponnée au phosphate)&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-399-4</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine Solution de glutamine 100X&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Hyclone</td><td>SV30082.01</td><td></td></tr><tr><td>PML Anti Chèvre Anti corps&nbsp ;</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9862</td><td></td></tr><tr><td>Apprêt(s)&nbsp ;</td><td>Eurofins</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI&nbsp ;</td><td>Hyclone</td><td>SH30027FS</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (sans phénol)&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>11835</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Green&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-4162</td><td></td></tr><tr><td>Taqman&nbsp ;</td><td>Thermo</td><td>AB-4138</td><td></td></tr><tr><td>Trizol&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-vimentine&nbsp ;</td><td>Épitomiques</td><td>4211-1</td><td></td></tr></tbody></table>

deux méthodes de fixation des cellules humaines de l&#39;endomètre stromales primaires de spécimens hystérectomie

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

Beaucoup d&#39;efforts ont été consacrés à établir des systèmes de culture cellulaire in vitro. Ces systèmes sont conçus pour modéliser un grand nombre de procédés in vivo. systèmes de culture cellulaire résultant de l&#39;endomètre échantillons humains ne font pas exception. Les applications vont de processus physiologiques cycliques normales à des pathologies de l&#39;endomètre telles que les cancers gynécologiques, les maladies infectieuses et les carences en matière de reproduction. Ici, nous proposons deux méthodes pour établir des cellules stromales de l&#39;endomètre primaires à partir d&#39;échantillons d&#39;hystérectomie endomètre résection chirurgicale. Le premier procédé est appelé «le procédé de raclage&quot; et intègre raclage mécanique à l&#39;aide des lames chirurgicales ou rasoir tandis que le second procédé est appelé «le procédé de la trypsine.&quot; Cette dernière méthode utilise l&#39;activité enzymatique de la trypsine, de promouvoir la séparation des cellules et primaire excroissance cellulaire. Nous illustrons la méthodologie étape par étape à travers des images numériques et la microscopie. Nous également providexemples de e pour la validation des lignées de cellules stromales de l&#39;endomètre par des réactions quantitatives en temps réel de la chaîne de la polymérase (qPCR) et immunofluorescence (IF).

Comme l&#39;a souligné dans la section Protocole, assurez-vous de procéder à toutes les méthodes sous gouvernement, institutionnels, et des principes éthiques lors de la manipulation et la préparation de tissus humains. Sont inclus dans ce manuscrit est une illustration du processus général de &quot;la méthode de raclage&quot; (figure 1A) et &quot;le procédé de la trypsine&quot; (Figure 1B) utilisé pour établir des cultures primaires de l&#3...

Établir des systèmes primaires de l&#39;endomètre stromales de cellules de culture à partir d&#39;échantillons hystérectomie est une technique biologique précieux et une étape cruciale avant de poursuivre une vaste gamme de recherche vise. Ici, nous décrivons deux méthodes utilisées pour établir les cultures stromales de tissus de l&#39;endomètre résection chirurgicale des patients humains.

Deux méthodes de fixation des cellules humaines de l&#39;endomètre stromales primaires de spécimens hystérectomie

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

L'objectif général de cette procédure est d'établir des cultures primaires de cellules stromales endométriales à partir d'hystérectomies réséquées. Cela est réalisé en premier lieu en distinguant et en séparant les couches utérines afin d'isoler une section de tissu endométrial. La deuxième étape consiste à choisir une technique d'isolement cellulaire parmi les méthodes de grattage et de trituration, en utilisant ici la méthode de grattage.La force mécanique et le grattage sont utilisés pour séparer et dissocier les cellules stromales endométriales. En alternative, lorsqu'on utilise la méthode à la trypsine, l'activité enzymatique de la trypsine permet de séparer et de dissocier les cellules stromales endométriales. Enfin, la microscopie est employée pour observer la croissance et la morphologie cellulaires, tandis que d'autres techniques décrites dans le manuscrit sont utilisées pour valider les cultures de cellules stromales endométriales.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en physiologie dans le domaine de la reproduction, telles que le cycle reproducteur et la menstruation. Les spécimens d'hystérectomie utilisés dans cet article ont été collectés conforméme

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Cette vidéo décrit le protocole permettant d’isoler les cellules mésothéliales humaines primaires de l’échantillon d’épiploon humain. Les cellules mésothéliales peuvent être utilisées pour établir un modèle de cancer de l’ovaire in vitro afin d’étudier l’adhésion, l’invasion et la prolifération des cellules cancéreuses de l’ovaire.

Isolement des cellules mésothéliales : une technique pour isoler les cellules mésothéliales primaires à partir d’un échantillon de tissu d’épiploon humain

Cette étude décrit un procédé détaillé pour l'isolement et la caractérisation de cellules de cancer ovarien primaire à partir de spécimens cliniques solides. Spécimens cliniques sur le cancer de l'ovaire sont soumis à une digestion enzymatique pour obtenir viable, libre fibroblastes cancer épithélial de l'ovaire (COE) de cellules très approprié pour des applications en aval.

Méthode pour l&#39;obtention de cellules cancéreuses ovariennes primaires à partir d&#39;échantillons solides

Ici, nous présentons un protocole pour construire un modèle in vitro tridimensionnel de la muqueuse de la cavité péritonéale, composé de cellules mésothéliales humaines primaires et de fibroblastes superposés avec une matrice extracellulaire, comme outil pour étudier l’adhésion, l’invasion et la prolifération des cellules cancéreuses de l’ovaire.

Modélisation des étapes précoces de cancer de l&#39;ovaire Diffusion dans une culture organotypique de la cavité péritonéale humain

Cette étude présente une méthode standardisée et validée pour l'isolement et la culture de la souris primaire stroma de l' endomètre et des cellules épithéliales, qui peut être utilisé dans un système de coculture pour étudier en decidualization vitro.

Isolement de souris endométriale épithéliales et stromales Cellules pour<em&gt; In vitro</em&gt; decidualization

Cette étude présente une procédure validée et optimisée pour l’isolement et la culture de cellules stromales endométriales humaines pour mener l’essai in vitro décidualisation avec. En outre, cette étude fournit une méthode détaillée pour efficacement défiant un gène spécifique à l’aide de siARN dans les cellules du stroma endométriales humains.

Isolement de cellules du stroma endométriales humains pour In Vitro décidualisation

L’objectif de cette méthodologie est d’identifier les cellules souches cancéreuses (CSC) dans les lignées de cellules cancéreuses et les échantillons primaires de tumeurs humaines avec le protocole de formation de sphère, d’une manière robuste, en utilisant des essais fonctionnels et la caractérisation phénotypique avec cytométrie du flux et de l’Ouest Tache.

Obtenir des sphères de cellules souches cancéreuses à partir de tumeurs gynécologiques et du cancer du sein

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Établissement d’organoïdes endométriaux 3D à partir de l’utérus de souris

Ce protocole démontre une technique fiable et efficace pour isoler les fibroblastes primaires des tissus vaginaux humains préménopausiques ou postménopausiques. Les protocoles existants pour l’isolement des fibroblastes vaginaux ne tiennent pas compte des défis de l’isolement cellulaire du tissu sénescent. Du tissu vaginal a été obtenu chez des femmes après une chirurgie du prolapsus des organes pelviens.

Traitement tissulaire et isolement des fibroblastes primaires du vagin humain

Le protocole présente un nouveau modèle expérimental in vitro capable de récapituler la biologie de deux types de lignées cellulaires adhérentes avec un échafaudage imprimé en trois dimensions (3D). La construction de ce modèle et les procédures opératoires, de la préparation et de la culture cellulaires à l’analyse et à l’évaluation, sont décrites.

Modèle de co-culture utilisant deux types de lignées cellulaires adhérentes

Découvrez deux méthodes de fixation des cellules stromales endométriales primaires à partir de spécimens d'hystérectomie. Ces protocoles par grattage et trypsine permettent d'étudier la physiologie et la pathologie endométriales in vitro.

Deux méthodes de fixation des cellules humaines de l'endomètre stromales primaires de spécimens hystérectomie

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