Deux méthodes de fixation des cellules humaines de l'endomètre stromales primaires de spécimens hystérectomie

L’objectif global de cette procédure est d’établir des cultures primaires de cellules stromales endométriales à partir d’hystérectomies réséquées. Ceci est accompli en distinguant et en séparant d’abord les couches utérines pour isoler une section de tissu endométrial. La deuxième étape consiste à choisir une technique d’isolement cellulaire entre les méthodes de grattage et d’essai lors de l’utilisation de la méthode de grattage.

La force mécanique et le grattage sont utilisés pour séparer et dissocier les cellules stromales de l’endomètre. Alternativement, lors de l’utilisation de la méthode de la trypsine, l’activité enzymatique de la trypsine est utilisée pour séparer et dissocier les cellules stromales de l’endomètre. En fin de compte, la microscopie est utilisée pour observer la croissance et la morphologie des cellules, tandis que d’autres techniques discutées dans le manuscrit sont utilisées pour vérifier les cultures stromales de l’endomètre.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions physiologiques clés dans le domaine de la reproduction, des phénomènes tels que le cycle reproductif et les menstruations. Les échantillons d’hystérectomie utilisés dans ce manuscrit ont été collectés conformément à un protocole éthique approuvé par l’IRB de l’université, numéroté I-R-B-H-S-R numéro 1 4 4 2 4. Conservez du tissu dérivé du patient dans un tube de 50 millilitres contenant du RPMI ou du DMEM avec une glycémie élevée à quatre degrés Celsius pendant au plus 24 heures avant le traitement de l’échantillon. Lorsque vous êtes prêt à commencer, lavez l’échantillon de tissu trois fois avec un XPBS et jetez la solution entre chaque lavage.

Ajoutez ensuite quatre à 10 millilitres de milieu de croissance complété par 10 % de FBS et 1 % de pénicilline streptomycine à l’échantillon de tissu. Ajoutez également une zone de champignons à une concentration finale de 0,25 microgramme par millilitre et incubez pendant 30 minutes. Ensuite, jetez le milieu de croissance et lavez le tissu deux fois avec un XPBS.

Placez le tissu sur une plaque de culture cellulaire de six centimètres et identifiez la couche d’endomètre à l’aide de ces images comme guide. Séparez ensuite l’endomètre et conservez les autres couches de tissu pour une utilisation future. À l’aide d’un scalpel ou d’une lame de rasoir, transectez le tissu en petits morceaux tout en grattant sur la boîte de culture cellulaire.

Les égratignures facilitent la fixation des cellules stromales primaires émergentes de l’endomètre. Ensuite, ajoutez délicatement deux millilitres de milieu de croissance dans le plat gratté. À ce stade, des fragments de tissu seront visibles et immobilisés par le mouvement de grattage.

Placez la parabole dans un incubateur de culture cellulaire désigné, séparé des autres lignées cellulaires, pour éviter toute contamination. Surveillez quotidiennement les cellules à l’aide d’un microscope optique. Recherchez de petites populations de cellules qui émergent du tissu tranché le deuxième jour ou trois tous les trois jours.

Retirez délicatement les anciennes cultures de lavage à l’aide d’un XPBS, puis ajoutez deux millilitres de substrat de croissance frais. Commencez à ajouter quatre millilitres de milieu de croissance. Une fois que le taux de prolifération augmente pendant les étapes de lavage, aspirez les morceaux de tissu restants.

Il est peu probable que de nouvelles colonies émergent du tissu. Après une semaine de passage de croissance, les cellules utilisant 0,05 % de trypsine. Lorsque les cellules atteignent entre 75 et 80 % de fluidité, congelez une plaque de cellules.

Une fois que deux ou trois plaques sont maintenues, les cellules primaires ne peuvent pas être passées indéfiniment. Pour commencer l’isolement médié par tripsin, placez un petit morceau de tissu endométrial dans un tube conique avec deux millilitres de trypsine à 0,25 % complété par 0,03 milligramme par millilitre. Can mycin incube ensuite le tissu sur une plate-forme rotative à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ensuite, agitez brièvement le tissu, puis centrifugez à 200 à 400 fois G pendant deux minutes, jetez le surnageant et ajoutez de la trypsine fraîche. Et la mycine peut-elle ensuite incuber le tissu à 37 degrés Celsius pendant une heure pendant la rotation. Après l’incubation, agitez le tissu pendant cinq à 10 secondes.

Ajoutez ensuite deux millilitres de milieu de croissance contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline streptomycine. Pour désactiver la trypsine, centrifugez les cellules à 200 à 400 fois G pendant deux à trois minutes. Ensuite, jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire.

Dans deux millilitres de milieu de croissance, placez la suspension cellulaire sur une boîte de culture cellulaire de six centimètres et raclez la plaque pour améliorer la fixation des cellules primaires. Surveillez quotidiennement la croissance cellulaire à l’aide d’un microscope optique et changez le milieu de croissance tous les deux à trois jours. Une fois que les cellules ont atteint une co-fluidité de 75 à 80 %, utilisez 0,05 % ou 0,25 % de trypsine pour les faire passer, isolant ainsi les cellules stromales de l’endomètre.

L’utilisation de la méthode de grattage génère des grappes de cellules émergentes précoces. Le long des égratignures induites par le scalpel, les cellules stromales de l’endomètre peuvent être identifiées par leur morphologie des fibroblastes. La méthode à la trypsine a un temps de préparation plus long que la méthode de grattage, mais les cellules viables sont observées plus tôt.

La méthode tryin génère également des cellules avec des modèles de croissance à la fois groupés et dispersés. Un marqueur tissulaire spécifique des cellules stromales de l’endomètre n’a pas encore été découvert. L’une des façons d’identifier les cellules stromales de l’endomètre est de mesurer la perte d’un marqueur.

Pour les cellules épithéliales telles que la cytokératine. Le manque de cytokératine démontre une absence de cellules épithéliales de l’endomètre. La perte de coloration de la cytokératine observée dans le passage cinq par rapport au passage deux, confirme l’absence de cellules épithéliales.

Des preuves fonctionnelles de la présence de cellules stromales endométriales peuvent être fournies à l’aide d’un test de décellularisation. L’augmentation de la prolactine et de la protéine de liaison du facteur de croissance analogue à l’insuline en réponse au traitement par CAMP et acétate d’hydroxy-progestérone indique l’établissement réussi d’une culture stromale endométriale. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’établir des cultures primaires de cellules stromales endométriales à partir d’hystérectomies réséquées.