Isolement de souris endométriale épithéliales et stromales Cellules pour

Les objectifs généraux de cette procédure sont d'isoler et de mettre en culture des cellules primaires murines endométriales, stromales et épithéliales afin de les cultiver en co-culture pour l'étude de la décidualisation in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la médecine reproductive, telles que les mécanismes de signalisation paracrine entre les cellules épithéliales et stromales durant des processus importants comme la décidualisation et l'invasion trophoblastique, ainsi que la régulation de cette voie de signalisation. Ces techniques peuvent être utilisées pour étudier le processus de décidualisation dans un système de co-culture épithéliale et stromale.

En utilisant ce système, vous pouvez évaluer si des molécules de signalisation sécrétées par l'une des deux cellules peuvent influencer ce processus. Avant de prélever l'utérus, effectuez un examen par frottis vaginal afin de vérifier les phases du cycle des animaux. Sélectionnez uniquement les souris en phase d'œstrus.

Caractérisé par la présence de cellules épithéliales cornéennes dans le lavage vaginal. Ensuite, utilisez une pince et des ciseaux pour ouvrir l'abdomen de l'animal en premier œstrus et déplacez les intestins sur le côté afin de visualiser les deux cornes utérines. Saisissez une corne à son extrémité la plus distale, sous la trompe de Fallope, et disséquez le tissu utérin de la trompe de Fallope à l’aide de pinces de dissection et de la pince Dumont n°5 pour retirer les tissus adipeux et conjonctifs.

Ensuite, retirez le cornet à l'extrémité distale, au-dessus du corps utérin. Après avoir retiré les cornus utérins, placez-les dans une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant trois millilitres de HBSS. Lorsque tous les cornus utérins ont été collectés, transférez la boîte sous un microscope stéréo et utilisez une pince pour éliminer les tissus adipeux et conjonctifs résiduels.

Ensuite, à l’aide de pinces Dumont numéro cinq, de pinces anatomiques et de petits ciseaux à ressort, ouvrir longitudinalement les cornes utérines pour en exposer les lumières, puis rincer les tissus dans une nouvelle boîte de Pétri contenant du HBSS frais. Transférer ensuite l’ensemble des cornes dans un tube de 15 millilitres contenant de la pancréatine et de la trypsine. Incuber les tissus horizontalement pendant 60 minutes à quatre degrés Celsius et à 50 tr/min sur un agitateur orbital.

À la fin de l'heure, transférer le tube sur la paillasse pour une incubation horizontale de 45 minutes sans agitation, suivie d'une incubation horizontale de 15 minutes sans agitation dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. À la fin de l'incubation au bain-marie, verser soigneusement le surnageant et transférer les utérus dans une boîte de Pétri contenant du milieu pour cellules épithéliales endométriales de souris froid pendant cinq minutes afin d'inactiver l'activité de la trypsine. Ensuite, transférer les tissus dans un tube de 15 millilitres contenant trois millilitres de HBSS froid, puis vortexer les tissus pendant 10 secondes pour libérer les feuillets épithéliaux.

Ensuite, rincez les utérus dans une nouvelle boîte de Pétri contenant trois millilitres de HBSS frais, et recueillez deux autres suspensions de feuillets épithéliaux dans deux nouveaux tubes de 15 millilitres comme vient d'être démontré. Après le troisième vortex du tissu, transférez les utérus dans un tube conique de 15 millilitres contenant le mélange de digestion des cellules stromales endométriales de souris pour une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius et 200 tr/min. Récupérez les feuillets épithéliaux en pipetant doucement les trois suspensions cellulaires à travers une maille en nylon de 100 microns afin d'éliminer les débris tissulaires, puis centrifugez la suspension cellulaire obtenue.

Resuspendre le culot dans 12 millilitres de milieu pour cellules épithéliales endométriales de souris en mélangeant soigneusement, puis laisser la solution se décanter pendant cinq minutes afin de séparer les cellules stromales endométriales résiduelles de souris par gravité. À la fin de la sédimentation, utiliser une pipette de cinq millilitres pour retirer délicatement les deux millilitres supérieurs du surnageant, puis centrifuger les cellules recueillies. Ensuite, resuspendre délicatement le culot épithélial de souris dans le milieu épithélial à l’aide d’une pipette.

Et ensemencez les cellules sur des lamelles recouvertes de collagène à la densité appropriée pour l'analyse en aval prévue. Après l'isolement des cellules épithéliales, poursuivez avec les cellules stromales et retirez le tube de digestion des cellules stromales murines contenant les utérus de l'incubateur. Après une incubation de 30 minutes, comme vient de l'être démontré, agitez doucement le tube à la main pendant 10 secondes, puis transférez les utérus dans une boîte de Pétri contenant trois millilitres de HBSS à quatre degrés Celsius.

Rincez soigneusement les tissus, puis ajoutez trois millilitres de milieu pour cellules stromales dans le tube de digestion afin d'inactiver l'activité de la trypsine, et transférez les utérus dans un tube conique de 15 millilitres contenant trois millilitres de milieu frais pour cellules stromales endométriales de souris. Agitez doucement le tube contenant les tissus pendant 10 secondes. Ensuite, transférez les utérus dans une boîte contenant du HBSS froid, puis dans un nouveau tube de 15 millilitres contenant du milieu pour cellules stromales.

Après un troisième rinçage et transfert du tissu, incuber les tissus utérins dans un mélange frais de digestion des cellules stromales endométriales de souris pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. À la fin de la digestion, faire passer les suspensions cellulaires du tube un au tube trois ainsi que le tube de trypsine à travers une maille en nylon de 40 microns, puis rincer la maille avec cinq millilitres supplémentaires de milieu pour cellules stromales endométriales de souris. Ensuite, recueillir les cellules par centrifugation.

Et resuspendre le culot dans un milieu frais pour cellules stromales endométriales de souris, puis ensemencer sur des lamelles recouvertes de polylysine à la densité appropriée selon l'analyse en aval prévue. La pureté des cultures primaires de cellules peut être évaluée en fonction des différences d'expression de la vimentine et de la cytokeratine, car les taux de vimentine sont élevés dans les cellules stromales endométriales de souris et faibles dans les cellules épithéliales endométriales de souris, tandis que les niveaux de cytokeratine sont élevés dans les cellules épithéliales endométriales de souris et faibles dans les cellules stromales endométriales de souris.

La double coloration mentine/cytokeratine illustre davantage l'expression de la mentine par les cellules stromales, ainsi que l'expression exclusive de la cytokératine par les cellules épithéliales. L'induction de la décidualisation dans les cultures de cellules stromales par l'application d'adénosine monophosphate cyclique et de MPA révèle que les niveaux d'ARNm de prolactine augmentent considérablement après cinq jours de traitement par rapport aux cultures de cellules stromales témoins. Comme les cellules épithéliales sont difficiles à visualiser dans les inserts latéraux de culture cellulaire, un test de viabilité pourrait être réalisé immédiatement après une simulation de décidualisation de cinq jours, un changement de couleur du bleu au rose vif indiquant la présence de cellules épithéliales viables.

À la suite de cette technique, d'autres méthodes telles que les tests d'adhérence des blastocystes peuvent être réalisées afin d'évaluer si des facteurs sécrétés par les cellules épithéliales en présence d'un blastocyste peuvent induire la décidualisation des cellules stromales.