Découvrir interactions des protéines et caractérisation de protéines de fonction utilisant la technologie HaloTag

L'objectif général de cette procédure est d'isoler efficacement des complexes protéiques à partir de cellules de mammifères. Cela est réalisé en transfectant d'abord les cellules avec un vecteur d'expression de fusion portant une étiquette halo afin d'exprimer la protéine d'intérêt. La deuxième étape consiste à lyser les cellules et à capturer de manière covalente les complexes protéiques sur une résine via l'étiquette halo.

Ensuite, les complexes protéiques fixés sur la résine sont lavés délicatement pour éliminer toutes les interactions non spécifiques. La dernière étape consiste à éluer les complexes protéiques de la résine. En définitive, les précipitations par halo-tag sont utilisées pour isoler et découvrir de nouvelles interactions protéiques à partir de systèmes mammaliens.

Les méthodes que nous allons vous démontrer aujourd’hui peuvent permettre des découvertes clés dans le domaine de la protéomique fonctionnelle, notamment l’identification de nouvelles interactions protéiques et la détermination de la localisation des protéines à l’intérieur des cellules. Deux de nos scientifiques principaux, Jackie Mendez et Alen Beek, réalisent ces procédures aujourd’hui. Tout d’abord, pour chaque fusion ou contrôle, préparez une plaque de 15 centimètres contenant 30 millilitres de cellules à une concentration de trois à quatre fois 10 à la puissance 5 cellules par millilitre, soit un total d’un à 1,2 fois 10 à la puissance 7 cellules par construit.

Incuber les cellules pendant 18 à 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 % CO2. Après l'incubation, transfecter le construit avec le réactif de transfection souhaité. Entre 24 et 48 heures après la transfection, retirer le milieu et laver délicatement la couche cellulaire avec 20 à 25 millilitres de PBS froid sur glace, puis éliminer le lavage au PBS et ajouter 25 à 30 millilitres de PBS refroidi à quatre degrés Celsius.

Ensuite, détacher délicatement les cellules de la boîte à l’aide d’un grattoir à cellules. Une fois les cellules recueillies dans des tubes coniques, centrifuger les échantillons de cinq à dix minutes à 2000 fois G et à quatre degrés Celsius. Après avoir éliminé le surnageant, placer les culots cellulaires à moins 80 degrés Celsius pendant un minimum de 30 minutes ou un maximum de six mois.

Pour chaque échantillon de fusion ou témoin, préparez 18 millilitres de tampon de mise en équilibre et de lavage de la résine. Mélangez délicatement la résine en retournant le flacon afin d'obtenir une suspension homogène. Pour chaque expérience de précipitation, ajoutez 200 microlitres de résine dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.

Centrifuger l'échantillon pendant une minute à 800 fois G. Après la centrifugation, retirer soigneusement le surnageant sans perturber la résine au fond du tube. Une fois le surnageant éliminé, ajouter 800 microlitres de tampon de lavage d'équilibration de la résine à l'échantillon et mélanger soigneusement en retournant plusieurs fois le tube. Après.

Centrifuger l'échantillon pendant deux minutes à 800 fois. G. Retirer soigneusement et jeter le surnageant. Répéter les étapes précédentes deux fois supplémentaires pour un total de trois lavages.

Après décongélation des culots cellulaires, suspendez-les dans 300 microlitres de lyse pour mammifères préparée au préalable. Ensuite, transférez-les dans un nouveau tube de microcentrifugeuse et ajoutez six microlitres de cocktail d'inhibiteurs de protéases 50 x.

Ensuite, ajoutez trois microlitres de RQ1 DNAs et inversez l'échantillon pendant 10 minutes. Lysez les cellules à température ambiante en faisant passer l'échantillon de cinq à dix fois à travers une aiguille de seringue de 25 ou 27 gauge. Une fois l'échantillon centrifugé à 14 000 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, transférez le lysat clair dans un nouveau tube et placez-le sur de la glace.

Ensuite, ajoutez 700 microlitres supplémentaires de tampon 1X TBS préalablement préparé au lysat clair et mélangez soigneusement en aspirant et en rejetant à l’aide d’une pipette. Retirez les derniers lavages des tubes de résine équilibrés préparés précédemment sans perturber la résine au fond de chaque tube. Puis ajoutez un millilitre du lysat dilué dans chaque tube.

Incuber les échantillons avec agitation sur un rotateur de tubes pendant 15 minutes à 22 degrés Celsius. Après cette étape, centrifuger les tubes de résine pendant deux minutes à 800 fois G. Après avoir éliminé le surnageant, ajouter un millilitre de tampon de lavage d'équilibrage de la résine et mélanger soigneusement en retournant chaque tube de résine manuellement plusieurs fois, puis centrifuger les tubes de résine pendant deux minutes à 800 fois G. Éliminer les lavages une fois les étapes précédentes et de lavage répétées trois fois.

Ajoutez un millilitre de tampon de lavage d'équilibrage de résine dans les tubes après avoir incubé les échantillons à 22 degrés Celsius pendant cinq minutes sous agitation constante, centrifugez les tubes de résine pendant deux minutes à 800 ×g et jetez les surnageants. À ce stade, resuspendez la résine de chaque échantillon dans 50 microlitres de tampon d'élution SDS. Agitez les tubes à température ambiante à l’aide d’un agitateur automatique pour tubes de microcentrifugeuse pendant 30 minutes.

Après centrifugation pendant deux minutes à 800 × g, transférez les EIT dans des tubes neufs pour analyse. Pour le western blot ou la coloration argent du gel, chargez cinq à 10 microlitres des échantillons sur un gel dénaturant SDS pour spectrométrie de masse. Conservez 40 microlitres de chaque échantillon à moins 20 degrés Celsius pour des analyses ultérieures. Dans une plaque à huit puits avec couvre-objet, ajoutez pour chaque protéine de fusion ou contrôle 400 microlitres de cellules HELOC dans leur milieu approprié dans chaque puits, à une densité de un à deux fois 10⁵ cellules par millilitre.

Après avoir incubé les cellules pendant 18 à 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 % CO2, transfectez-les avec le réactif de transfection souhaité. Après 18 à 24 heures suivant la transfection, diluez le ligand TMR d’un à 200 dans le milieu cellulaire approprié. Ajoutez ensuite 100 microlitres de cette solution dans chaque puits et mélangez délicatement. Incubez ensuite les cellules transfectées contenant le ligand pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius et 5 % CO2.

Lorsque l'opération est terminée, aspirez le milieu contenant le ligand et remplacez-le par 500 microlitres de milieu approprié dépourvu de ligand de fusion protéique, préalablement réchauffé à 37 degrés Celsius. Une fois l'étape précédente répétée deux fois, pour un total de trois lavages, remettez les cellules dans l'incubateur pendant 30 minutes.

Après une incubation de 30 minutes, aspirez le milieu et remplacez-le par 500 microlitres de milieu approprié préalablement réchauffé à 37 degrés Celsius. Ensuite, observez les cellules au microscope en utilisant les paramètres d'acquisition appropriés selon le protocole halo, BRD four et l'expression du contrôle du marqueur halo. L'expression de la protéine de fusion peut également être détectée par immunoblotting (Western blot) à l'aide d'anticorps anti-marqueur halo ou d'anticorps dirigés contre la protéine appât.

Les gels colorés à l'argent de réplicats biologiques des immunoprécipitations de Halo BRD quatre et des témoins démontrent une forte reproductibilité et mettent en évidence les protéines interagissant avec la protéine BRD quatre. L'abondance élevée des composants de PTF B CDK neuf et de la cycline T, ainsi que de la protéine BRD neuf, confirme la capture spécifique des complexes BRD quatre. Les gels ont révélé d'autres protéines identifiées comme interagisseurs potentiels de BRD quatre.

À titre d'exemple supplémentaire, des isolations complexes ont été réalisées avec la protéine Halo HD one. Dans ce cas, la protéase TEV a été utilisée pour cliver une région de liaison entre l'étiquette Halo et H DAC one, libérant ainsi de grandes quantités de la protéine cible HD one. Comme observé.

Les échantillons de HD un obtenus par tirage à l'aide d'une protéine cible ont montré des niveaux élevés d'activité de HD un, activité qui a été inhibée par l'inhibiteur de HDA saha. Afin de démontrer davantage la spécificité, aucune inhibition de HDA n'a été observée en présence de l'inhibiteur de la famille des sirtuines EX 5 27, et aucun signal n'a été détecté lorsqu'un tampon seul était utilisé. Les cellules He A transfectées avec Halo BRD quatre et Halo HDAC un ont été marquées de manière fluorescente avec du TMR.

L'imagerie par ligand a montré que les deux protéines sont localisées dans le noyau, démontrant ainsi que la marque n'a pas modifié la localisation cellulaire physiologique de leurs partenaires de fusion. Ainsi, après cette procédure, les protéines isolées ainsi que leurs partenaires d'interaction peuvent être identifiées et analysées plus en détail à l'aide de diverses méthodes analytiques telles que la spectrométrie de masse et le western blot.