Découvrir interactions des protéines et caractérisation de protéines de fonction utilisant la technologie HaloTag

L’objectif global de cette procédure est d’isoler efficacement les complexes protéiques des cellules de mammifères. Ceci est accompli en transectant d’abord les cellules avec une construction de fusion de marqueurs de halo pour exprimer la protéine d’intérêt. La deuxième étape consiste à découper les cellules et à capturer de manière covalente les complexes protéiques sur la résine via une balise halo

Ensuite, les complexes protéiques de la résine sont lavés en douceur pour éliminer toute interaction non spécifique. La dernière étape consiste à éluer les complexes protéiques de la résine. En fin de compte, les tirages de marqueurs de halo sont utilisés pour isoler et découvrir de nouvelles interactions protéiques à partir de systèmes mammifères.

Les méthodes que nous allons vous présenter aujourd’hui peuvent permettre des découvertes clés dans le domaine de la protéomique fonctionnelle, notamment l’identification de nouvelles interactions protéiques et la détermination de la localisation des protéines à l’intérieur des cellules. Aujourd’hui, deux de nos scientifiques seniors, Jackie Mendez et Alen Beek, effectuent ces procédures. Tout d’abord, pour chaque fusion ou contrôle, préparez un plat de 15 centimètres avec 30 millilitres de cellules à trois à quatre fois 10 à la cinquième cellule par millilitre, ou une à 1,2 fois 10 à sept cellules au total par construction.

Incuber les cellules pendant 18 à 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Après l’incubation, transfectez la construction avec le réactif de transfection souhaité. Après 24 à 48 heures, après la transfection, retirez le support et lavez doucement la couche cellulaire avec 20 à 25 millilitres de PBS glacé, retirez le lavage PBS et ajoutez 25 à 30 millilitres de PBS réfrigéré à quatre degrés Celsius.

Ensuite, grattez doucement les cellules de la parabole avec un grattoir à cellules. Une fois les cellules rassemblées dans des tubes coniques, centrifugez les échantillons pendant cinq à dix minutes à 2000 fois G et quatre degrés Celsius. Après avoir jeté le surnageant, placez les pastilles de cellule à moins 80 degrés Celsius pendant un minimum de 30 minutes ou un maximum de six mois.

Pour chaque échantillon de fusion ou de contrôle, préparez 18 millilitres de tampon de lavage d’équilibrage de résine. Mélangez délicatement la résine en inversant le flacon pour obtenir une suspension uniforme. Pour chaque expérience de pull-down, versez 200 microlitres de résine dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre.

Centrifuger l’échantillon pendant une minute à 800 fois G.Après la centrifugation. Retirez délicatement le surnageant sans déranger la résine au fond du tube. Une fois que le surnageant a été jeté, ajoutez 800 microlitres de tampon de lavage d’équilibrage de résine à l’échantillon et mélangez soigneusement en retournant le tube plusieurs fois. Après.

Centrifugation de l’échantillon pendant deux minutes à 800 fois. G.Retirez et jetez soigneusement le surnageant. Répétez les étapes précédentes deux fois de plus pour un total de trois lavages.

Après la décongélation des granules cellulaires, mettez-les en suspension dans 300 microlitres de lyse de mammifère préalablement préparée. Tampon par pipetage vers le haut et vers le bas. Transférez ensuite dans un nouveau micro tube à centrifuger et ajoutez six microlitres de 50 x cocktail d’inhibiteurs de protéase.

Ensuite, ajoutez trois microlitres d’ADN RQ one et retournez l’échantillon pendant 10 minutes. À température ambiante, faites passer l’échantillon cinq à dix fois à travers une aiguille de seringue de calibre 25 ou 27. Une fois que l’échantillon a été centrifugé 14 000 fois, G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, transférez le lysat clair dans un nouveau tube et placez-le sur de la glace.

Ensuite, ajoutez 700 microlitres supplémentaires d’un tampon XTBS préalablement préparé au lysat clair et mélangez bien en pipetant de haut en bas. Retirez les derniers lavages des tubes de résine équilibrés préalablement préparés sans perturber la résine au fond de chaque tube. Ajoutez ensuite un millilitre de lysat dilué dans chaque tube.

Incuber les échantillons avec mélange sur un rotateur de tube pendant 15 minutes à 22 degrés Celsius. Après cette centrifugeuse, les tubes de résine pendant deux minutes à 800 fois G.Après avoir jeté le surnageant, ajoutez un millilitre de tampon de lavage d’équilibrage de résine et mélangez soigneusement en retournant chaque tube de résine à la main plusieurs fois après la centrifugation des tubes de résine pendant deux minutes à 800 fois. G.Jetez les lavages une fois les étapes précédentes et les étapes de lavage ont été répétées trois fois.

Ajoutez un millilitre de tampon de lavage d’équilibrage de résine dans les tubes après avoir incubé les échantillons à 22 degrés Celsius pendant cinq minutes avec une rotation constante, centrifugez les tubes de résine pendant deux minutes à 800 fois G et jetez les lavages. À ce stade, resus suspend la résine de chaque échantillon dans 50 microlitres de tampon d’élution SDS. Agitez les tubes à température ambiante avec un agitateur automatique de micro-tube de centrifugation pendant 30 minutes.

Après une centrifugation de deux minutes à 800 fois G.Transférez les IET dans des tubes frais pour analyse Pour le western blot ou le gel de coloration à l’argent, chargez cinq à 10 microlitres des échantillons sur un gel dénaturant SDS pour la spectrométrie de masse. Conservez 40 microlitres de chaque échantillon à moins 20 degrés Celsius pour une analyse future. Dans un verre de couverture à huit chambres pour chaque protéine de fusion ou plaque de contrôle, 400 microlitres de cellules HELOC dans leur milieu approprié dans chaque puits à une densité de un à deux fois 10 à la cinquième cellules par millilitre.

Après avoir incubé les cellules pendant 18 à 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2, transfectez-les avec le réactif de transfection souhaité après 18 à 24 heures, diluez après la transfection le ligand TMR un à 200 dans le milieu cellulaire approprié. Ajoutez ensuite 100 microlitres de cette solution dans chaque puits et mélangez délicatement. Ensuite, incubez les cellules transfectées contenant le ligand pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2.

Lorsque vous avez terminé, aspirez le milieu contenant le ligand et remplacez-le par 500 microlitres du milieu approprié dépourvu de ligand de fusion de protéines, qui a été pré-averti à 37 degrés Celsius. Une fois l’étape précédente a été répétée deux fois pour un total de trois lavages. Remettez les cellules dans l’incubateur pendant 30 minutes.

Après l’incubation de 30 minutes, aspirez le milieu et remplacez-le par 500 microlitres de milieu approprié, qui a été préchauffé à 37 degrés Celsius. Suite à cette image, les cellules d’un microscope utilisant les paramètres d’acquisition appropriés en utilisant le protocole halo, BRD quatre et l’expression de contrôle de la balise halo sont observées. L’expression de la protéine de fusion peut également être détectée à l’aide de Western blots avec des anticorps anti-halo ou des anticorps dirigés contre la protéine d’appât.

Les gels de coloration à l’argent des réplicats biologiques de Halo BRD quatre et des pulldowns de contrôle démontrent une reproductibilité élevée et montrent des protéines qui interagissent avec la protéine BRD quatre. La grande abondance de composants de PTF B, CDK nine et Cyclin T, ainsi que de la protéine BRD neuf, confirme la capture spécifique des complexes BRD quatre. Les gels ont montré d’autres protéines identifiées comme des interacteurs potentiels de BRD quatre.

À titre d’exemple supplémentaire, des isolements complexes ont été réalisés avec la protéine Halo HD one. Dans ce cas, la protéase TEV a été utilisée pour clivage dans une région de liaison entre l’étiquette Halo et le DAC H, libérant des quantités significatives de la protéine d’appât HD one. Comme observé.

Les échantillons de tirage HD one ont montré des niveaux élevés d’activité HD one, qui a été inhibée par l’inhibiteur de HDA saha. Pour démontrer davantage la spécificité, aucune inhibition de l’HDA n’a été observée avec l’inhibiteur de la famille des sirtuines EX 5 27 et aucun signal n’a été détecté en utilisant le tampon seul. Les cellules He A transfectées avec Halo BRD quatre et Halo HDAC un ont été marquées par fluorescence avec TMR.

L’imagerie des ligands a montré que les deux se localisaient dans le noyau et démontraient que le marqueur n’altérait pas la localisation cellulaire physiologique de ses partenaires de fusion. Ainsi, à la suite de cette procédure, les protéines isolées et leurs partenaires en interaction peuvent être identifiés et analysés plus en détail à l’aide de diverses méthodes analytiques telles que la spectrométrie de masse et le western blot.