Sondage haute densité fonctionnels des puces à protéines pour détecter les interactions protéine-protéine

L’objectif principal de cette procédure est d’identifier les interactions protéine, protéine au sein d’un protéome donné de manière parallèle et non biaisée, ce qui n’est pas possible avec d’autres technologies. Ceci est accompli en hybridant d’abord et en marquant un épitope d’une protéine d’intérêt avec une bibliothèque de protéines fonctionnelles hautement purifiées et de pleine longueur déposée dans un plan de coordonnées à la surface d’une lame de microscope. Une fois que la protéine a atteint l’équilibre avec chacune de ses protéines cibles respectives sur la puce, la fraction non liée est emportée et les interactions protéiques sont détectées avec un anticorps monoclonal contre l’épitope conjugué à une fraction fluorescente à l’aide d’un scanner de micropuce standard.

Les images résultantes sont entrelacées d’informations concernant l’intensité de chaque caractéristique par rapport à la protéine liée et au signal fluorescent. Ces informations sont extrapolées à l’aide du logiciel d’analyse de microréseaux pour générer une liste de valeurs d’intensité pour chaque caractéristique du réseau. Les informations concernant la paire d’interaction protéine-protéine peuvent être exportées vers un logiciel d’analyse bioinformatique en aval afin de noter les données spécifiques aux caractéristiques et d’identifier les interactions protéiques entre la protéine d’intérêt et les protéines de la puce

Les données brutes d’intensité du signal sont compilées sur deux microréseaux de protéines ou plus pour tenir compte des variations inter et intra essais, et les données sont normalisées pour noter chacune des interactions. La sortie résultante génère une liste cible de protéines en interaction, qui peut être utilisée pour guider l’interrogation ultérieure des interactions protéiques. La puce à protéines fonctionnelles in vivo a été mise au point dans le laboratoire de Michael Snyder il y a plus de 15 ans.

Depuis lors, de nombreuses applications réussies de cette technologie ont été réalisées en raison de sa polyvalence et de ses tests protéomiques biochimiques. Cette technique facilite l’étude des interactions protéiques et des réseaux de signalisation modulaires, ainsi que de la connectivité alternative et des cascades de signalisation précédemment connues. Pour cultiver et purifier les sondes de kinase de fusion V cinq, utilisez la souche de levure Y 2 58 fraîchement striée contenant une plaque de protéine de fusion V cinq, la levure sur uracile complet synthétique, gélose dextrose à 2 %, et croître à 30 degrés Celsius pendant trois jours à partir d’une culture congelée. Inoculer des cultures de démarrage à partir d’une seule colonie et cultiver pendant la nuit dans de l’uracile synthétique complet.

2 % de dextrose sur une plate-forme ou une roue secouante à 30 degrés Celsius. Le lendemain matin, inoculez 400 millilitres d’uracile complet synthétique. Culture raphinoise à 2 % avec une culture de démarrage suffisante pour atteindre une densité optique finale à 600 nanomètres ou une DO 600 de 0,1.

Augmentez les inoculums jusqu’à une OD 600 de 0,6, puis induisez l’expression de la construction de fusion de V cinq kinases en ajoutant suffisamment d’extrait de levure trois x. Pep tone complété par 6 % de galactose pour diluer le milieu d’induction d’un facteur trois ou d’une concentration finale de galactose de 2 %Induire des cellules à 30 degrés Celsius pendant six heures sur une plate-forme agitante. Utilisez un erlenmeyer de deux litres pour assurer une aération appropriée.

Récoltez les cellules en faisant tourner 400 millilitres de suspension cellulaire à 1000 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Lavez les cellules une fois avec 50 millilitres de tampon PBS glacé et transférez-les dans un tube conique de 50 millilitres. Lavez à nouveau le granulé dans une solution saline tamponnée au phosphate glacée ou un tampon PBS et transférez-le dans des tubes à bouchon pression de deux millilitres pour la lyse.

Après avoir fait tourner les cellules à 20 000 fois G pendant une minute à quatre degrés Celsius, retirez le tampon à l’aide d’une pipette et placez les tubes sur de la glace. Lyce les cellules avec des billes de zircone de 0,5 millimètre dans un volume un à un de granule de cellule à billes à lyse PBS, tampon. Ensuite, faites tourbillonner le mélange trois fois à l’aide d’une plate-forme d’agitation pendant deux minutes d’intervalle à quatre degrés Celsius.

Centrifugez le lysat à 20 000 fois, G dans une micro-fuge de table pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez le lysat clarifié dans un tube contenant environ 100 microlitres de résine d’affinité de nickel prélavée et incubez sur un nutate pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Pour capturer l’histamine, six pastilles de protéine de fusion V cinq marquées X la résine à l’aide d’une centrifugeuse de table pendant cinq minutes à 1000 fois G et quatre degrés Celsius après l’élimination du surnageant.

Lavez la résine avec un tampon de lavage pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius sur le mutateur. Répétez le lavage deux fois de plus avec un tampon de lavage frais. Éluez les protéines avec deux volumes de 100 microlitres de 200 millimolaires.

Ajoutez du glycérol à une concentration finale de 30 % des échantillons et conservez-le à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit utilisé dans le dosage. Pour détecter les interactions. Diluez l’anticorps conjugué V five fluoro four à 260 nanogrammes par millilitre dans une sonde, tamponnez et mélangez soigneusement en agitant.

Diluez ensuite la sonde de fusion V cinq sur une plage de concentration de cinq à 500 microgrammes par millilitre. Ensuite, sortez les microréseaux de protéines du congélateur et amenez-les à quatre degrés Celsius dans le réfrigérateur juste avant de les utiliser. Ajoutez le tampon de blocage directement sur le porte-lames contenant les microréseaux de protéines et couvrez le dessus avec du paraform pour éviter les fuites.

Bloquez les réseaux dans la mémoire tampon de blocage pendant une heure en les secouant à 50 RP sur une scène à quatre degrés Celsius. Après le blocage, transférez les réseaux dans une chambre humidifiée, carrelée à quatre degrés Celsius et ajoutez 90 microlitres de sonde diluée directement à la surface du réseau. Superposez les réseaux avec une lamelle de levage surélevée et incubez sans secouer dans la chambre humidifiée à quatre degrés Celsius pendant une heure et demie après l’incubation, ajoutez la lame dans un tube conique de 50 millilitres contenant suffisamment de tampon de sonde pré-refroidi pour envelopper complètement la lame, permettant à la glissière de glisser doucement hors de la puce à protéines.

Lavez les réseaux trois fois pendant une minute chacun dans trois tubes coniques. Appliquez la solution d’anticorps directement sur le réseau immédiatement après avoir terminé le lavage et superposez avec un glissement de levage effacé. Comme précédemment, incubez les enceintes pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius dans la chambre humidifiée.

Effectuez la même étape de lavage que précédemment et essorez dans un tube conique de 15 millilitres à 800 fois G dans une centrifugeuse de table pendant cinq minutes. À température ambiante, faites sécher les réseaux à l’air libre dans un support de diapositives dans l’obscurité pendant 30 minutes avant de balayer le réseau à 647 nanomètres. Dans cette expérience, l’activité de liaison de TDA un V cinq a été étudiée.

Des microréseaux de protéines de levure repérés en double avec environ 4 200 protéines de fusion GST pleine longueur ont été incubés avec le contrôle vectoriel vide ou avec des sondes TDA un V cinq. Les panneaux encastrés comparent la région identique dans les deux réseaux. Il convient de noter en particulier RIM 11, qui a également été identifié comme une cible phosphorylée de TDA one dans une étude publiée précédemment.

Une fois que les cibles ont été identifiées, elles peuvent être testées pour leur activité biochimique et fonctionnelle in vivo. Si vous regardez cette vidéo, vous devriez avoir une meilleure compréhension de la façon d’utiliser les microréseaux de protéines fonctionnelles comme moyen d’identifier les interactions protéiques candidates pour une validation et une interrogation plus poussées in vivo.