Stabiliser hépatocellulaire phénotype en utilisant des surfaces synthétiques optimisés

L’objectif global de cette procédure est d’optimiser les surfaces recouvertes de polymères afin de préserver la culture stable à long terme d’hépatocytes humains dérivés de cellules souches. Ceci est accompli en synthétisant d’abord le polyuréthane 1 3 4 ou le PU 1 3 4. La deuxième étape consiste à choisir le bon solvant pour solubiliser le PU 1 34.

Ensuite, le processus de revêtement par centrifugation avec le PU 1 3 4 sur la lamelle de recouvrement en verre est optimisé. La dernière étape est l’optimisation du processus de stérilisation du polymère P 1 34 : lamelles de verre revêtues, en fin de compte en microscopie électronique à balayage, en microscopie à force atomique et métabolisme des médicaments. Des tests sont utilisés pour montrer l’influence du revêtement polymère PU 1 34 dans la fonction des hépatocytes dérivés de cellules souches.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’utilisation d’al Metrices en culture pour maintenir les cellules souches puissantes URI qui ont des hépatocytes, est que ces matériaux synthétiques peuvent être ajustés pour l’objectif et une échelle s selon des normes de qualité garanties. De plus, ils affichent la cohérence du bus du deuxième lot. Les implications de cette technique s’étendent au traitement des maladies du foie, car elle représente un exemple de la façon dont la surface d’un polymère synthétique peut être optimisée pour préserver le phénotype cellulaire.

La démonstration de la procédure sera faite par le Dr Jeffrey Walton, un post-doctorant de mon laboratoire. Appliquez un traitement thermique sur le cadran à six hexanes du mono avec de l’éthylène glycol et du glycol neo PenTile à 40 degrés Celsius pendant 48 heures dans un four à vide. Pour éliminer toute eau résiduelle, ajoutez 22 millimoles de chaque monomère et 55 millimoles d’un acide dpic dans une fiole à fond rond à deux cols reliée à un appareil Dean Stark et équipée d’une barre d’agitation magnétique.

Ensuite, placez l’ensemble sous vide et chauffez doucement la verrerie à 40 degrés Celsius pendant six heures afin d’éviter toute absorption d’humidité lors de l’ajout du produit chimique dans le ballon. Après avoir retiré l’ensemble du four et placé le système sous l’azote, ajoutez 0,0055 mole du catalyseur titane quatre, mais oxydez goutte à goutte à l’aide d’une seringue dans le ballon. Mélangez le mélange réactionnel à 180 degrés Celsius pendant 24 heures, en recueillant l’eau résiduelle dans le piège à austère.

Laissez le produit refroidir à température ambiante. Mélangez ensuite 3,2 millimoles, ou un équivalent du polyol P-H-N-G-A-G avec 6,4 millimoles ou deux équivalents de quatre quatre méthyles et d’un isocyanate de bisphénol. Dans 12 millilitres de DML anhydre dans une fiole à fond rond à deux cols reliée à un appareil de Stark et équipée d’une barre magnétique en étoile.

Mélangez le mélange réactionnel à 70 degrés Celsius sous une atmosphère d’azote. Ajoutez ensuite le catalyseur titane quatre oxyde goutte à goutte via une seringue à une concentration finale de 0,8 %Après une heure, ajoutez un équivalent de la prolongateur de chaîne un cadran à quatre butane pour donner un produit copolymère. Augmentez la température à 90 degrés Celsius et mourez de faim pendant 24 heures sous une atmosphère d’azote.

Une fois que le mélange réactionnel a appelé à température ambiante, un dal éther descend dans le sens de la goutte à goutte vers le mélange réactionnel jusqu’à ce qu’une précipitation du produit en polyuréthane soit observée. Après avoir transféré le mélange réactionnel dans un tube à centrifuger, centrifugez la solution à 5, 300 fois G pendant cinq minutes. Après décantation, le supinate sèche à température ambiante jusqu’à ce que le solvant s’évapore.

Fonctionne ensuite pour peser 200 milligrammes de PU 1 34 dans une bouteille en verre. Diluer l’échantillon à une concentration finale de 2 % dans du chloroforme ou du chloroforme et du toluène dans un rapport de un pour un ou du tétra roran ou une combinaison de tétra roran anti-chlorométhane. Dans un rapport de un à un, agitez vigoureusement la solution pendant 20 minutes à température ambiante à l’aide d’un agitateur à une vitesse de 200 mouvements par minute jusqu’à ce que la solution devienne homogène et qu’aucun précipité ne soit observé.

Une fois terminé, placez une lamelle en verre d’environ 15 millimètres carrés sur le spin-coter. Appliquez 50 microlitres de solution de PU un à quatre sur la lamelle à l’aide d’une pipette en faisant tourner chaque lamelle pendant sept secondes à 23 fois G.Ensuite, séchez la lamelle à l’air libre à température ambiante pendant au moins 24 heures avant la stérilisation. À ce stade, irradiez aux rayons gamma chaque lamelle recouverte de polymère en appliquant une dose de 10 gris à l’aide d’un radiateur de laboratoire pendant 12 minutes.

Alternativement, irradiez par UV chaque lamelle recouverte de polymère à l’aide d’une ampoule UV de 30 watts pendant 16 minutes de chaque côté. Une fois terminé, placez la lamelle recouverte de polymère dans une plaque de culture tissulaire appropriée en fonction de la taille de la lamelle. Après avoir cultivé et différencié la lignée de cellules souches embryonnaires humaines, des cellules ont été détachées à l’aide d’un réactif de dissociation et les ont rejouées sur les lamelles enrobées de PU 1 34 au neuvième jour du processus de différenciation en présence d’une microscopie électronique à balayage en milieu libre de sérum.

Des images des différentes lamelles de recouvrement en verre revêtu montrent que le revêtement au toluène ou au chloroforme n’était pas homogène, mettant en évidence un revêtement irrégulier avec une précipitation de PE 1 34. En revanche, les tétraédres permettaient le revêtement par centrifugation d’une surface beaucoup plus uniforme. De plus, l’analyse par microscopie à force atomique des différents revêtements polymères montre une réduction de 40 % de la rugosité du P 1 34 solubilisé dans la tétra-hydrofurine par rapport à d’autres solvants, démontrant un revêtement PU 1 34 plus uniforme, une application biologique, la différenciation de l’endoderme hépatique a été induite et au neuvième jour, des cellules hépatoblastiques ressemblant à des cellules étaient apparentes, la majorité des cellules exprimant la cytokératine 19, la protéine alpha feta et le facteur nucléaire hépatocytaire pour alpha et de faibles niveaux d’albumine comme mesure de la fonction métabolique.

La fonction du cytochrome P quatre 50 a été évaluée quatre jours après le replacage sur différentes surfaces recouvertes de polymères. Une augmentation de deux fois de l’activité métabolique dans les cellules replaquées sur des surfaces revêtues de tétra hydro fure mpu 1 3 4 a été observée. Ces résultats démontrent que l’activité métabolique des hépatocytes dérivée de cellules souches embryonnaires humaines est améliorée avec un visage de revêtement P 1 34 plus uniforme. L’imagerie de contraste n’a montré aucune différence grossière après l’irradiation UV ou gamma, ce qui a été confirmé par l’analyse par microscopie électronique à balayage.

Les hépatocytes dérivés de cellules souches embryonnaires humaines recouverts de PU 1 34 rayonnés de rayons gamma ont montré une augmentation de trois fois de l’activité du CYP 3 a par rapport aux cellules recouvertes de PU 1 34 rayonnées d’UV. Ces observations démontrent que le rayonnement gamma est la technique de stérilisation optimale. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de vérifier l’homogénéité du revêtement entre les différents CLO de revêtement par centrifugation, et n’oubliez pas que travailler avec des instruments de solvants chimiques peut être extrêmement dangereux.

Des applications telles que le port de lunettes de sécurité doivent toujours être prises en compte lors de l’exécution de cette procédure.