Name: Stabiliser hépatocellulaire phénotype en utilisant des surfaces synthétiques optimisés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Découvrez l'optimisation de surfaces polymères pour la culture longue durée d'hépatocytes dérivés de cellules souches humaines. Cette méthode améliore l'adhésion cellulaire et la viabilité pour des applications thérapeutiques.

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D.C.H., M.B. et F.K. ont été soutenus par un fonds de suivi de l’EPSRC. B.L-V et D.S. ont chacun été soutenus par des bourses de doctorat du MRC. K.C. a été soutenu par un financement de la UK Regenerative Medicine Platform.

1. Synthèse de PHNGAD (poly [1,6-hexanodiol / néopentylglycol / di (éthylène glycol), de l&#39;acide adipique--ALt] diol) <img alt="Schéma 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51723/51723scheme1.jpg" width="500" /> Schéma 1: Synthèse de PHNAGD représentation schématique de la synthèse de PHNAGD.. PHNAGD a été préparé par la réaction de 1,6-Hexanodiol, le diéthylène glycol, neoppentyl glycol et d&#39;acide adipique. PHNAGD, Poly [1,6-hexanodiol / néopentylglycol / di (éthylène glycol), l&#39;acide adipique--ALt] diol. <ol><li> Appliquer un traitement thermique à des monomères de 1,6-hexanediol, le di (éthylène glycol) et du néopentylglycol à 40 ° C pendant 48 heures dans une étuve à vide pour éliminer l&#39;eau résiduelle. Laisser froid jusqu&#39;à température ambiante sous vide. </li><li> Ajouter 22 mmol de chaque monomère et d&#39;acide adipique (55 mmol) dans un ballon à fond rond à deux cols équipé d&#39;un barreau agité et raccordé à un appareil de Dean-Stark. </li><li> Placez tout l&#39;ensemble sous vide et chauffer doucement la glassware à 40 ° C pendant 6 heures, afin d&#39;éviter toute absorption d&#39;humidité au cours de l&#39;addition de la substance chimique dans le ballon. </li><li> Ajouter à la seringue, goutte à goutte, 0,0055 mole de titane de catalyseur (IV) de butoxyde. </li><li> On agite le mélange réactionnel à 180 ° C, sous une atmosphère de N2 pendant 24 heures, et recueillir l&#39;eau résiduelle dans le piège de Dean-Stark. Laissez le produit refroidir à température ambiante. </li></ol> Synthèse de 2 PU134 <img alt="Schéma 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51723/51723scheme2.jpg" width="500" /> Schéma 2: Synthèse de PU134 représentation schématique de la synthèse de polyuréthanne PU134 134 a été préparé par la réaction de 1,0 équivalent d&#39;un PHNGAD avec 2,0 équivalents d&#39;un 4,4 &#39;-méthylène bis (isocyanate de phényle), suivi par l&#39;addition de 1,0. équivalents d&#39;un agent d&#39;allongement de chaîne 1,4-butanediol. <ol><li> Mélanger un équivalent de la PHNGAD polyol (Mn ~ 1800 Da, 3,2 mmol) avec deux équivalents de 4»4-méthylène-bis (isocyanate de phényle) (6,4 mmol) dans anhydre N, N-diméthylformamide (12 ml). </li><li> On agite le mélange réactionnel à 70 ° C, sous une atmosphère de N2. </li><li> Ajouter à la seringue, goutte à goutte le titane de catalyseur (IV) butoxyde (0,8% en poids). </li><li> Après 1 heure, ajouter un équivalent de l&#39;allongeur de chaîne 1,4-butanediol (3,2 mmole). Augmenter la température à 90 ° C et agiter pendant 24 heures sous une atmosphère de N 2. </li><li> Après la réaction, collecter le polyuréthanne par précipitation par addition d&#39;éther diéthylique (hexane ou de l&#39;eau peut aussi être utilisé) goutte à goutte dans la solution de réaction jusqu&#39;à ce que la précipitation se produit. </li><li> Centrifuger la solution à 5300 g pendant 5 min. </li><li> Décanter le surnageant et sécher à 40 ° C dans une étuve à vide jusqu&#39;à ce que le solvant s&#39;évapore. Remarque: Afin de garantir que le produit final de la réaction possède les bons paramètres en ce qui concerne la distribution de la masse moléculaire, le grou fonctionnelps du polymère, et les températures de fusion et de transition vitreuse, diverses techniques analytiques et les méthodes peuvent être utilisées, telles que la Chromatographie de permeation sur gel ou par spectroscopie FITR. </li></ol> 3 Préparation des solutions de PU134 <ol><li> Peser 200 mg de PU134 dans une bouteille en verre. </li><li> Diluer PU134 à une concentration finale de 2% dans un certain nombre de solvants: chloroforme, un mélange de chloroforme et de toluène à 1: 1, le tétrahydrofuranne, et la combinaison de tétrahydrofurane et de dichlorométhane dans le rapport 1: 1. Remarque: L&#39;élection du droit solvant varie en fonction du polymère à utiliser. Différents solvants possèdent des points d&#39;ébullition différents qui peuvent influer sur la solubilisation du polymère. </li><li> Agiter la solution vigoureusement pendant 20 min à température ambiante en utilisant un agitateur à une vitesse de 200 MOT / min, jusqu&#39;à ce que la solution devienne homogène et aucun précipité n&#39;est observé. </li></ol> 4. revêtement de lames de verre avec PU134 <ol><li> Placez un roue 15 mm 2 lamelle sur la tournette. </li><li> Appliquer 50 ul de la solution de chaque PU134 à l&#39;aide d&#39;une pipette. Ajuster le volume de la solution de PU134 en conséquence de la taille de la lamelle couvre-objet en maintenant le volume nécessaire à la surface rapport proportionnel. </li><li> Faites tourner chaque lamelle pendant 7 secondes à 23 x g. </li><li> Lamelle air sec à température ambiante pendant au moins 24 heures avant la stérilisation. </li></ol> 5. irradiation de Coverslip <ol><li> Gamma-irradier polymère lamelle revêtue par application d&#39;une dose de 10 Grays l&#39;aide d&#39;un irradiateur de laboratoire pendant 12 min. </li><li> UV irradier revêtu de polymère en utilisant une lamelle 30 W, lampe UV pour 16 min de chaque côté. </li><li> Placer la lamelle revêtue de polymère dans une plaque de culture de tissu approprié en fonction de la taille de la diapositive. </li></ol> 6. microscopie électronique à balayage <ol><li> Or polymère manteau lamelle par pulvérisation pour 200 secondes dans une atmosphère de 5 x 10 -1 millibars de pression. </li><li> Capturez le micrographies de la lamelle couvre-objet revêtu de polymère en utilisant un microscope électronique à balayage à une tension d&#39;accélération de 20 kV en mode de formation d&#39;image d&#39;électrons secondaires. </li></ol> 7. microscopie à force atomique Observations <ol><li> Balayer une zone de 20 x 20 um de la surface du polymère. </li><li> Mettre en place une vitesse de balayage de 1,32 Hz à 1,60 Hz. </li><li> Mettre en place une résolution de 512 x 512 pixels dans la région balayée. </li><li> Calculer la moyenne quadratique (RMS ou Rq) du revêtement à l&#39;aide de la moyenne des écarts de hauteur à partir de prises au plan moyen de données d&#39;image exprimée en tant que: <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51723/51723eq1.jpg" width="123" /> Où Zi est la valeur courante de Z, et N est le nombre de points à l&#39;intérieur de la zone donnée. </li><li> 7.5 Calculer l&#39;écart ou rugosité de surface moyenne (Ra) de l&#39;image en utilisant, <img fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51723/51723eq2.jpg" width="154" /> Où Z (x) est la fonction qui décrit til analyse le profil de surface en termes de hauteur (Z) et la position (x) de l&#39;échantillon sur la longueur d&#39;évaluation de &quot;L&quot;. Ra représente la valeur moyenne de la surface par rapport au plan médian. </li></ol> 8. culture cellulaire et de la différenciation <ol><li> Culture et différencier la lignée humaine de cellules souches embryonnaires (CSEh) H9 comme décrit dans Hay 17. </li><li> Détacher les cellules en utilisant un réactif de dissociation et les Réensemencement sur ​​des lames revêtues PU134 à 9 jours du processus de différenciation, en présence d&#39;un milieu sans sérum comme décrit dans Szkolnicka 18,19. Remarque: L&#39;utilisation d&#39;une dissociation enzymatique des cellules est préférable de détachement de cellule physique. </li></ol> 9. cytochrome P450 de dosage fonctionnel <ol><li> Mesurer l&#39;activité du CYP3A suivant les instructions du fabricant. </li><li> Incuber CSEh hépatocytes dérivés au jour 13 ou 19 jours, et les médias sans cellules - comme contrôle négatif, avec le substr appropriémangé pendant 5 heures à 37 ° C. </li><li> Recueillir les surnageants de cellules et les médias, effectuer l&#39;essai selon les instructions du fabricant. </li><li> Mesurer le niveau de l&#39;activité de CYP et normalisée par rapport à la zone de surface (cm 2). </li></ol> 10 Immunocoloration <ol><li> Laver CSEh hépatocytes dérivé avec du PBS, pendant 1 min, répéter deux fois. </li><li> Ajouter glacée 100% de méthanol pour fixer les cellules, dans -20 ° C pendant 10 min. </li><li> Laver les cellules avec du PBS pendant 5 min et répéter deux fois. </li><li> Incuber les cellules avec du PBS / T (0,1% de Tween) / 10% de BSA pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Aspirer la solution de PBST et ajouter l&#39;anticorps primaire approprié dilué dans PBS / T (0,1% de Tween) / BSA à 1%, incubation à 4 ° C avec agitation douce O / N. </li><li> Laver les cellules avec du PBS / T (0,1% de Tween) / BSA à 1% pendant 5 minutes et répéter trois fois. </li><li> Diluer l&#39;anticorps approprié dans du PBS / T (0,1% de Tween) / 1% de BSA, ajouter aux cellules et incuber dans l&#39;obscurité à température ambiante pendant 1 h sous agitation douce. </li><li> Laver les cellules avec du PBS pendant 5 min et répéter trois fois. </li><li> Ajouter MOWIOL 488 (contenant DAPI 1: 1,000) à chaque puits, ajouter une lamelle doucement pour réduire le nombre de bulles d&#39;air. Magasin cellules fixé à 4 ° C dans l&#39;obscurité. Observer la coloration à l&#39;aide d&#39;un microscope avec filtre approprié et d&#39;une lampe fluorescente. Les anticorps primaires et secondaires optimisés sont répertoriés dans le tableau 1. </li></ol>

<ol><li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMOylation+of+HNF4%CE%B1+regulates+protein+stability+and+hepatocyte+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">SUMOylation of HNF4α regulates protein stability and hepatocyte function.</a> J Cell Sci. 125 (15), 3630-3635 (2012).</li>
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<li>Azevedo, E. C., Nascimento, E. M., Chierice, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV+and+gamma+irradiation+effects+on+surface+properties+of+polyurethane+derivate+from+castor+oil%5BTitle%5D)+AND+%22Pol%C3%ADmeros%22%5BJournal%5D)">UV and gamma irradiation effects on surface properties of polyurethane derivate from castor oil.</a> Polímeros. 23 (3), 305-311 (2013).</li>
<li>Rosu, L., Cascaval, C. N., Ciobanu, C., Rosu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+UV+radiation+on+the+semi-interpenetrating+polymer+networks+based+on+polyurethane+and+epoxy+maleate+of+bisphenol+A%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobilogy+A%3A+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of UV radiation on the semi-interpenetrating polymer networks based on polyurethane and epoxy maleate of bisphenol A.</a> Journal of Photochemistry and Photobilogy A: Chemistry. 169 (2), 177-185 (2005).</li>
<li>Yang, X. F., Tallman, D. E., Bierwagen, G. P., Croll, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blistering+and+degradation+of+polyurethane+coatings+under+different+accelerated+weathering+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Degradation+and+Stability%22%5BJournal%5D)">Blistering and degradation of polyurethane coatings under different accelerated weathering tests.</a> Polymer Degradation and Stability. 77 (1), 103-109 (2002).</li>
</ol>

D.C.H. est CSO, directeur, fondateur et actionnaire de FibromEd Products Ltd. M.B. et J.P.I. sont actionnaires fondateurs de FibromEd Products Ltd.

De nombreuses méthodes actuelles utilisées pour générer des hépatocytes à partir de cellules souches reposent sur des matrices indéfinies d’origine animale. Ces substrats peuvent être coûteux et très variables, affectant la fonction et la stabilité des cellules, ce qui représente un obstacle important à l’application. Par conséquent, nous avons effectué un criblage de matériaux synthétiques qui soutiennent la culture d’hépatocytes dérivés de cellules souches. Nous avons identifié un polyuréthane simple (PU134), formé par...

Les matières biologiques ont été largement utilisés dans l&#39;entretien et la différenciation des cellules souches pluripotentes 1. Tout en permettant, ces substrats biologiques contiennent souvent une multitude de composants définis. Matrigel est un substrat communément utilisé pour la culture de cellules souches et de la différenciation. Malheureusement, sa composition variable influe sur la fonction des cellules et le phénotype. Bien qu&#39;une grande variété de matrices biologiques alternatives, mieux définis ont été utilisés 2-7, leur origine animale ou pauvres évolutivité en fait des candidats inappropriés pour la production industrielle. Par conséquent, l&#39;identification des alternatives synthétiques, à composition définie et des performances fiables, sont des objectifs clés de la recherche sur les cellules souches. Dans une tentative pour surmonter les limitations des indéfinis substrats de culture de cellules, des collaborations interdisciplinaires entre la chimie et de la biologie ont identifié des matériaux synthétiques ayant la capacité de supporter le phénotype cellulaire. Synthsubstrats étiques sont évolutives, rentables, et peuvent être fabriqués dans des structures 3D complexes, imitant l&#39;environnement in vivo. En raison de ces propriétés des substrats synthétiques ont été largement utilisés pour supporter et entraîner la différenciation de nombreux types de cellules 8-10. Essais de débit de pointe et haute ont facilité la sélection rapide de matériaux synthétiques, de grandes bibliothèques, et livré de nouveaux matériaux aux propriétés flexibles avec de larges applications dans la recherche et le développement 11-13 biomédicale. Utilisant à haut débit, la technologie de dépistage micro-réseau polymère, nous avons identifié rapidement d&#39;une simple polyuréthane (PU134), adapté pour l&#39;entretien des hépatocytes dérivés de cellules souches humaines. Ce polymère a été jugée supérieure à des substrats provenant des animaux en ce qui concerne la différenciation et la fonction des hépatocytes 14-16. Nous avons par la suite optimisé le processus conditions de revêtement, de la topographie et de stérilisation pour accéder à effetssur le rendement en polymère stabilisant fonction des hépatocytes et la durée de vie. Ceci a des implications importantes en ce qui concerne la compréhension des fondamentaux de la biologie des hépatocytes pour la modélisation à base de cellules et des applications en médecine régénérative. La technologie décrite ici est un exemple de la façon dont la surface d&#39;un polymère synthétique peut être optimisée pour conserver le phénotype cellulaire. Nous croyons que la combinaison de cette technologie avec un hépatocyte libre protocole de différenciation de sérum efficace a le potentiel de fournir une production évolutive des hépatocytes pour l&#39;utilisation de la modélisation in vitro et la médecine régénérative.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Synthèse, préparation, enrobage et caractérisation de lamelles enrobées de polymère PU134</td></tr><tr><td></td><td>Shaker Edmun B&uuml ; hler</td><td>KS-15</td><td></td></tr><tr><td>Irradiateur</td><td>CIS Biointernational</td><td>IBL 637&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Système de revêtement spécialisé</td><td>P-6708</td><td></td></tr><tr><td>Microscope électronique à balayage&nbsp ;</td><td></td> Philips <td>XL30CPSEM</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à force atomique</td><td>Nanoscope DimensionV, VEECO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p4-GLO CYP3A4</td><td>Ampoule UV Promega</td><td>V8902</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse</td><td></td> ESCO <td></td>NanoScope VEECO <td></td> version 1.20</tr><tr><td>Microscope à fluorescence</td><td>Olympus</td><td>TH45200</td><td>Utiliser le logiciel Volocity 4</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire</td><td>Corning, Royaume-Uni&nbsp ;</td><td>3527</td><td></td></tr><tr><td>lames de verre</td><td>Fournitures de laboratoire scientifique</td><td>MIC3308</td><td></td></tr><tr><td>Diéthylène glycol</td><td>Sigma&ndash ; Aldrich</td><td>93171</td><td></td></tr><tr><td>1,6-hexanediol</td><td>Sigma&ndash ; Aldrich</td><td>240117</td><td></td></tr><tr><td>Néopentyl glycol</td><td>Sigma&ndash ; Aldrich</td><td>408255</td><td></td></tr><tr><td>Acide adipique</td><td>Sigma&ndash ; Aldrich</td><td>9582</td><td></td></tr><tr><td>anhydre N,N-Dimethylformamide</td><td>Sigma&ndash ; Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>Éther diéthylique</td><td>Sigma&ndash ; Aldrich</td><td>676845</td><td></td></tr><tr><td>butoxyde de titane (IV)&nbsp ;</td><td>Sigma&ndash ; Aldrich</td><td>244112</td><td></td></tr><tr><td>1,4-butanediol&nbsp ;</td><td>Sigma&ndash ; Aldrich</td><td>493732</td><td></td></tr><tr><td>Four à vide</td><td>Thermoscientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4,4'-Methylenebis(phenyl isocyanate)</td><td>Sigma&ndash ; Aldrich</td><td>101688</td><td></td></tr><tr><td>Tétrahydrofurane</td><td>Sigma&ndash ; Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>Coucheuse par pulvérisation cathodique</td><td>Bal-Tec SCD 050</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Inmunostaining</td></tr><tr><td>Phosphate tampon salin (-MgCl2, -CaCl2)</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td>Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>PBST, PBS composé de 0,1 % TWEEN 20&nbsp ;</td><td>&nbsp ; Fournitures de laboratoire scientifique Ltd</td><td>EC607&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>&nbsp ; Scientific Laboratory Supplies Ltd</td><td>CHE5010</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich, UK</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>MOWIOL 488 DAPI</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td>Composé de Tris HCl et de glycérol selon les instructions</td></tr><tr> du fabricant<td colspan="4">Culture cellulaire et Dosage fonctionnel</td></tr><tr><td>CYP3A activity pGLO kit</td><td>Promega</td><td>V8902</td><td></td></tr><tr><td>Hepatozyme</td><td>Gibco</td><td>17705021</td><td></td></tr><tr><td>TryLE express</td><td>Life Technologies</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12604013">12604013</a></td><td></td></tr></tbody></table>

stabiliser hépatocellulaire phénotype en utilisant des surfaces synthétiques optimisés

Stabilizing Hepatocellular Phenotype Using Optimized Synthetic Surfaces

Actuellement, l’une des principales limitations de la biologie cellulaire est le maintien d’un phénotype cellulaire différencié. Les matrices biologiques sont couramment utilisées pour la culture et le maintien d’hépatocytes primaires et pluripotents dérivés de cellules souches. Bien que les matrices biologiques soient utiles, elles permettent une culture à court terme d’hépatocytes, limitant ainsi leur application à grande échelle. Nous avons tenté de surmonter les limites en utilisant un revêtement polymère synthétique. Les polymères représentent l’une des plus grandes classes de biomatériaux et possèdent un large éventail de propriétés mécaniques, physiques et chimiques, qui peuvent être ajustées en fonction de leurs besoins. Il est important de noter que ces matériaux peuvent être mis à l’échelle selon des normes de qualité garanties et afficher une cohérence d’un lot à l’autre. Ceci est essentiel si les cellules doivent être expansées pour le criblage à haut débit dans l’industrie des tests pharmaceutiques ou pour la thérapie cellulaire. Les polyuréthanes (PU) sont un groupe de matériaux qui se sont révélés prometteurs dans la culture cellulaire. Nos progrès récents dans l’optimisation d’une surface recouverte de polyuréthane, pour la culture à long terme d’hépatocytes humains présentant un phénotype stable, sont présentés et discutés.

Le solvant du polymère influence la topographie de la surface revêtue de polymère
Le polyuréthane 134 a été solubilisé dans le chloroforme, seul ou en association avec du toluène, du tétrahydrofuranne ou du dichlorométhane, et les lames de verre ont été recouvertes par centrifugation à partir des différentes formulations. La microscopie électronique à balayage (MEB) et la microscopie à force atomique (AFM) ont été utilisées pour caractériser les propriétés physiques des revête...

Cet article se concentrera sur le développement de surfaces recouvertes de polymères pour la culture stable à long terme d’hépatocytes humains dérivés de cellules souches.

Stabiliser hépatocellulaire phénotype en utilisant des surfaces synthétiques optimisés

Currently, one of the major limitations in cell biology is maintaining differentiated cell phenotype. Biological matrices are commonly used for culturing ...

Le but global de cette procédure est d'optimiser les surfaces recouvertes de polymères afin de préserver la culture stable à long terme d'hépatocytes humains dérivés de cellules souches. Cela est réalisé en premier lieu par la synthèse du polyuréthane 1 3 4 ou PU 1 3 4. La deuxième étape consiste à choisir le bon solvant pour solubiliser le PU 1 34.Ensuite, le procédé de dépôt par centrifugation du PU 1 3 4 sur la lame de verre est optimisé. La dernière étape consiste à optimiser le protocole de stérilisation des lames de verre recouvertes du polymère P 1 34, suivi d'une caractérisation par microscopie électronique à balayage, microscopie à force atomique et métabolisme des médicaments. Des tests sont utilisés pour démontrer l'influence du revêtement polymère PU 1 34 sur la fonction des hépatocytes dérivés de cellules souches.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'utilisation de matrices biologiques en culture pour maintenir des cellules souches pluripotentes différenciées en hépatocytes, réside dans le fait que ces matériaux synthétiques peuvent être précisément ajustés selon l'application et produits à grande échelle selon des normes garantissant la qualité. En outre, ils présentent une cohérence constante d'un lot à l'autre. Les implications de cette technique s'étendent au traitement des maladies hépatiques, car elle illustre comment la surface d'un polymère synthétique peut être optimisée pour préserver le phénotype cellulaire.Le Dr Jeffrey Walton, postdoctorant de mon laboratoire, démontrera la procédure. Avant de commencer cette procédure, appliquez un traitement thermique au mono-1,6-hexanediol, au diéthylène glycol et au néopentylglycol à 40 degrés Celsius pendant 48 heures dans une étuve sous vide. Pour éliminer toute trace d'eau, ajoutez 22 millimoles de chaque monomère et 55 millimoles d'acide dpic à un ballon rond à deux cols relié à un appareil de Dean-Stark et muni d'un barreau d'agitation magnétique.Après cela, placer l'ensemble sous vide et chauffer doucement le matériel de verrerie à 40 degrés Celsius pendant six heures afin d'éviter toute absorption d'humidité lors de l'ajout du produit chimique au ballon. Après avoir retiré l'ensemble du four et placé le système sous azote, ajouter 0,0055 mole du catalyseur titane quatre, mais l'oxyde, goutte à goutte à l'aide d'une seringue, dans le ballon. Agiter le mélange réactionnel à 180 degrés Celsius pendant 24 heures, en recueillant l'eau résiduelle dans le piège de Dean-Stark.Laisser refroidir le produit à température ambiante. Ensuite, mélanger 3,2 millimole, soit une équivalence, du polyol P-H-N-G-A-G avec 6,4 millimole, soit deux équivalences, de 4,4'-méthylènebisphénol d'isocyanate, dans 12 millilitres de DML anhydre, dans un ballon rond à deux cols relié à un appareil de Dean-Stark et muni d'un barreau aimanté. Agiter le mélange réactionnel à 70 degrés Celsius sous une atmosphère d'azote. Ajouter ensuite le catalyseur dioxyde de titane goutte à goutte à l’aide d’une seringue jusqu’à une concentration finale de 0,8 %. Après une heure, ajouter un équivalent de l’agent de prolongation de chaîne butane-1,4-diol pour obtenir le produit de copolymère. Augmenter la température à 90 degrés Celsius et laisser réagir pendant 24 heures sous une atmosphère d'azote.Une fois que le mélange réactionnel a refroidi à température ambiante, ajouter goutte à goutte du diéthyléther au mélange réactionnel jusqu'à l'observation de la précipitation du produit de polyuréthane. Après avoir transféré le mélange réactionnel dans un tube à centrifugation, centrifuger la solution à 5 300 × g pendant cinq minutes. Après décantation, sécher le surnageant à température ambiante jusqu'à évaporation complète du solvant.On pèse ensuite 200 milligrammes de PU 1 34 dans un flacon en verre. On dilue l'échantillon à une concentration finale de 2 % dans du chloroforme ou dans un mélange de chloroforme et de toluène en rapport un pour un, ou du tétrahydrofurane, ou une combinaison de tétrahydrofurane et de chlorométhane, en rapport un pour un. Agiter vigoureusement la solution pendant 20 minutes à température ambiante à l'aide d'un agitateur réglé à une vitesse de 200 mouvements par minute, jusqu'à obtention d'une solution homogène et en l'absence de précipité visible.Lorsque l'opération est terminée, placez un carré d'environ 15 millimètres de côté en verre à couvre-objet sur le spin coater. Appliquez 50 microlitres de la solution PU un à quatre sur le couvre-objet à l’aide d’une pipette, puis faites tourner chaque couvre-objet pendant sept secondes à 23 fois G. Laissez ensuite sécher à l’air le couvre-objet à température ambiante pendant au moins 24 heures avant la stérilisation. À ce stade, irradiez chaque couvre-objet recouvert de polymère par rayonnement gamma en appliquant une dose de 10 grays à l’aide d’un appareil de radiologie de laboratoire pendant 12 minutes.Alternativement, irradier chaque lame recouverte de polymère à l’aide d’une ampoule UV de 30 watts pendant 16 minutes de chaque côté. Une fois terminé, placer la lame recouverte de polymère dans une plaque de culture tissulaire adaptée en fonction de la taille de la lame. Après la culture et la différenciation des cellules souches embryonnaires humaines détachées à l’aide d’un réactif de dissociation, les repiquer sur les lames recouvertes de PU 1 34 au neuvième jour du processus de différenciation en présence de milieu sans sérum pour la microscopie électronique à balayage.Les images des différentes lames de verre recouvertes montrent que le revêtement réalisé avec du toluène ou du chloroforme n'était pas homogène, présentant une couche irrégulière avec une précipitation de PE 1 34. En revanche, le tétrahydrofuranne a permis un revêtement par rotation bien plus uniforme. De plus, l'analyse par microscopie à force atomique des différents revêtements polymériques révèle une réduction de 40 % de la rugosité de P 1 34 solubilisé dans le tétrahydrofuranne par rapport aux autres solvants, démontrant ainsi un revêtement PU 1 34 plus homogène. Pour une application biologique, la différenciation en endoderme hépatique a été induite et, au neuvième jour, des cellules semblables à des hépatoblastes étaient visibles, la majorité exprimant la cytokeratine 19, la protéine alpha-foetoprotéine et le facteur nucléaire hépatocytaire 4 alpha, ainsi que de faibles niveaux d'albumine comme indicateur de la fonction métabolique.La fonction de la cytochrome P450 a été évaluée quatre jours après le repiquage sur différentes surfaces revêtues de polymères. Une augmentation deux fois plus importante de l'activité métabolique a été observée dans les cellules repiquées sur des surfaces revêtues de tétrahydrofuranne-mPU134. Ces résultats démontrent que l'activité métabolique des hépatocytes dérivés de cellules souches embryonnaires humaines est améliorée avec une surface de revêtement P134 plus uniforme. L'imagerie en contraste de phase n'a révélé aucune différence majeure après irradiation UV ou gamma, ce qui a été confirmé par analyse en microscopie électronique à balayage.Les hépatocytes dérivés de cellules souches embryonnaires humaines replatés sur des lamelles en verre recouvertes de PU 1 34 irradiées par rayons gamma ont montré une activité CYP trois a trois fois plus élevée que les cellules replatées sur des lamelles en verre recouvertes de PU 1 34 irradiées aux UV. Ces observations démontrent que l'irradiation gamma constitue la technique de stérilisation optimale. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de vérifier l'homogénéité du revêtement entre différents CLO de revêtement par rotation, et de ne pas oublier que le travail avec des solvants chimiques et des instruments peut être extrêmement dangereux.Des précautions telles que le port de lunettes de protection doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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Recherche

JoVE Journal

Chemistry

Chimie

Cet article se concentrera sur la génération de l'endoderme hépatiques humaines embryonnaires humaines à partir des populations de cellules souches.

Génération robuste des hépatocytes comme des cellules embryonnaires humaines à partir populations de cellules souches

Une technique permettant d’isoler des hépatocytes humains et des cellules hépatiques non parenchymateuses du même donneur est décrite. Les différents types de cellules hépatiques constituent la base des modèles hépatiques fonctionnels et de l’ingénierie tissulaire. Cette nouvelle méthode vise à isoler les cellules hépatiques avec un rendement et une viabilité élevés.

Protocole pour l&#39;isolement des hépatocytes humains primaires et correspondant Principales populations de cellules hépatiques non parenchymateuses

La méthode présentée ici décrit une solution évolutive et de bonnes pratiques de fabrication (BPF) système de différenciation -ready pour générer des cellules hépatocytes humains comme à partir de cellules souches pluripotentes. Il sert comme un système rentable et standardisée pour générer des cellules hépatocytes comme humains pour la recherche fondamentale et appliquée foie humain.

Définition et génération évolutive des cellules hépatocytes-like de pluripotentes humaines Cellules souches

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