Définition et génération évolutive des cellules hépatocytes-like de pluripotentes humaines Cellules souches
2 mars 2017
La méthode présentée ici décrit une solution évolutive et de bonnes pratiques de fabrication (BPF) système de différenciation -ready pour générer des cellules hépatocytes humains comme à partir de cellules souches pluripotentes. Il sert comme un système rentable et standardisée pour générer des cellules hépatocytes comme humains pour la recherche fondamentale et appliquée foie humain.
L’objectif global de ce protocole est de produire des cellules humaines de type hépatocytes à partir de cellules souches pluripotentes en utilisant des matrices de laminines recombinantes dans des conditions définies. Cette méthode permet à l’utilisateur de fabriquer sur mesure des hépatocytes humains fonctionnels pour étudier la biologie du foie dans la boîte. Le principal avantage de cette technique est que sa nature définie permet la production de masse d’hépatocytes avec un haut degré de reproductibilité expérimentale. Pour commencer l’expérience, décongelez 100 microgrammes par millilitre de laminine-521 recombinante, ou LN-521, à quatre degrés Celsius.Diluez le LN-521 décongelé dans du 1xDBPS glacé avec du magnésium calcique pour obtenir une solution de cinq microgrammes par millilitre. Ajoutez un millilitre de la solution LN-521 de cinq microgrammes par millilitre pour enrober un puits d’une plaque à six puits, et basculez la plaque pour la répartir uniformément dans le puits. Ensuite, incubez les plaques dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius à 5 % de CO2 pendant au moins deux heures pour une utilisation urgente. Apportez la plaque revêtue de l’incubateur à la hotte de culture tissulaire. Aspirez soigneusement la solution de revêtement LN-521 sans endommager la surface revêtue. Ajoutez ensuite immédiatement un millilitre de mTeSR préchauffé
Aperçu
Ce protocole décrit une méthode pour générer des cellules de type hépatocyte humain à partir de cellules souches pluripotentes en utilisant des matrices de laminine recombinante. Il fournit un système scalable et prêt pour la fabrication selon les bonnes pratiques de fabrication (GMP) afin de produire des hépatocytes fonctionnels pour la recherche sur le foie.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Différenciation cellulaire
- Biologie des cellules souches
- Recherche sur le foie
Contexte
- Les cellules hépatocytes humaines sont essentielles pour l'étude de la biologie du foie.
- Les cellules souches pluripotentes peuvent se différencier en divers types cellulaires.
- Les matrices de laminine recombinante favorisent l'adhérence et la croissance cellulaires.
- Les méthodes normalisées améliorent la reproductibilité des recherches.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode rentable pour produire des cellules semblables à des hépatocytes.
- Permettre la production massive d'hépatocytes fonctionnels.
- Faciliter la recherche en biologie hépatique et en modélisation des maladies du foie.
Méthodes utilisées
- Décongélation et dilution de la laminine-521 recombinante.
- Revêtement des plaques de culture cellulaire avec une solution de laminine.
- Incubation des plaques pour favoriser l'adhésion cellulaire.
- Ajout de mTeSR préchauffé pour la culture cellulaire.
Résultats principaux
- Génération réussie de cellules de type hépatocyte humain.
- Reproductibilité élevée de la production cellulaire.
- Caractéristiques fonctionnelles des cellules de type hépatocyte confirmées.
- Système évolutif adapté à diverses applications de recherche.
Conclusions
- La méthode offre une approche fiable pour la production d'hépatocytes.
- Elle soutient à la fois la recherche fondamentale et appliquée sur le foie.
- Les études futures pourront exploiter ce système pour les tests de médicaments et la modélisation des maladies.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Les systèmes de différenciation définis réduisent la variabilité entre lots dans la production de cellules hépatocytes-like, améliorant ainsi la reproductibilité des modèles hépatiques précliniques. Des procédés évolutifs et compatibles avec les bonnes pratiques de fabrication (BPF) permettent une fourniture régulière pour les tests de métabolisme et de toxicité des médicaments. Cela répond à un goulot d'étranglement majeur dans la translation des hépatocytes dérivés de cellules souches vers des applications industrielles.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la Découverte et Validation de la Cible
- Valeur scientifique : Permet l'exploration des voies hépatiques à l'aide de modèles cellulaires physiologiquement pertinents et évolutifs.
- Valeur opérationnelle : Les matrices de laminine définies réduisent la variabilité, améliorant la reproductibilité des tests entre les expériences.
- Valeur prédictive : Une forte reproductibilité soutient des études fiables sur l'engagement des cibles et les mécanismes d'action.
Développement de tests et de criblages
- Valeur scientifique : Produit des cellules de type hépatocyte présentant une fonction métabolique stable pour le criblage de composés.
- Valeur opérationnelle : Des conditions définies sans sérum permettent une standardisation entre laboratoires et sites de production.
- Extensibilité : Compatible avec des lignées de CPSh à usage de recherche et conforme aux bonnes pratiques de fabrication, permettant une production cellulaire à grande échelle.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Les cellules présentent un phénotype et une fonction proches de celles des hépatocytes primaires, améliorant ainsi la fidélité du modèle de maladie.
- Valeur opérationnelle : Un système défini réduit la variabilité entre lots, soutenant les études permettant l'ouverture d'un dossier d'essai clinique (IND).
- Continuité translationnelle : Établit un lien entre la différenciation des cellules souches et la validation préclinique de thérapeutiques ciblant le foie.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode s'inscrit dans la continuité découverte-préclinique en fournissant une source évolutible d'hépatocytes fonctionnels pour des applications en aval.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en biologie hépatique grâce à une différenciation définie et reproductible.
- Écrans de sélection : Permet la production standardisée de cellules de type hépatocyte pour une évaluation cohérente des composés.
- Analytique : Génère des données fonctionnelles quantifiables (par exemple, albumine, urée) pour l'analyse comparative de conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité allant de la différenciation aux modèles précliniques de maladies hépatiques et de réponse aux médicaments.
- Réutilisation en entreprise : Une plateforme définie et évolutive favorise la réutilisation entre projets et sites, réduisant la charge liée à la réoptimisation.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Une confiance prédictive dans la fonction des hépatocytes réduit l'ambiguïté mécanistique dans les tests liés au foie.
- Valeur opérationnelle : Des composants définis et un procédé sans sérum améliorent la reproductibilité et la montée en échelle.
- Valeur stratégique : Permet de meilleures décisions d'avancement ou d'abandon en réduisant la variabilité biologique des données précliniques.
- Impact sur le portefeuille : Une priorisation ajustée au risque des candidats ciblant le foie grâce à des systèmes modèles fiables.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Compétences en culture de cellules souches et en protocoles de différenciation.
- Accès à des matrices de laminine recombinantes et à des milieux de différenciation définis.
- Standardisation des procédures d'ensemencement et d'incubation entre les équipes.
- Considérations d'adaptation pour différentes lignées de CSPH et formats de montée en échelle.
- Les limites incluent la maturation fonctionnelle par rapport aux hépatocytes primaires, comme indiqué dans la source.
