Name: Définition et génération évolutive des cellules hépatocytes-like de pluripotentes humaines Cellules souches (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Découvrez une méthode pour générer des cellules hépatocytes-like à partir de cellules souches pluripotentes humaines utilisant des matrices de laminine recombinante. Ce protocole évolutif et conforme aux BPF permet une production reproductible de hépatocytes fonctionnels pour la recherche hépatique.

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REMARQUE: Les informations du fournisseur pour tous les réactifs utilisés dans ce protocole a été indiqué dans le Tableau 1. Tous les médias / les plaques doivent être stériles et au moins à la température ambiante lorsque les cellules sont en contact direct avec eux. 1. repiquage pluripotentes humaines Cellules Souches (hPSCs) sur laminine 521 REMARQUE: La procédure de repiquage de cellules décrit ci-dessous est basée sur des cellules individuelles et est idéal pour la dérivation d&#39;une population homogène de cellules hépatocytes-like de hPSCs. Colonie de placage est également applicable et a été décrit précédemment 24. <ol><li> Préparer des plaques revêtues de laminine selon les besoins. <ol><li> Décongeler le 100 pg / mL stock d&#39;laminine recombinant 521 (LN-521) à 4 ° C. </li><li> On dilue le décongelé LN-521 dans de la glace froide 1x DPBS (avec du Ca 2+ / Mg 2+) pour faire une solution à 5 ug / ml. </li><li> Ajouter 1 ml de 5 ug / LN-521 ml de solution pour revêtir un puits d&#39;une plaque à 6 puitset la roche à se répandre uniformément dans le puits. </li><li> Incuber les plaques dans un 37 ° C / 5% de CO 2 culture cellulaire incubateur pour 2 - 4 h pour une utilisation d&#39; urgence ou dans un réfrigérateur C 4 ° pendant une nuit. </li><li> Stocker les plaques revêtues de laminine dans un réfrigérateur à 4 ° C si nécessaire. Gardez les plaques sur une surface plane et les sceller pour éviter l&#39;évaporation et la contamination. REMARQUE: Ne jamais laisser les puits revêtus sécher; haut - les avec supplément 1x DPBS (avec Ca 2+ / Mg 2+) si nécessaire. Utiliser les plaques dans les 2 semaines. </li></ol></li><li> Laisser le nombre requis de plaques pré-enduit pour atteindre la température ambiante avant de l&#39;utiliser ou incuber les plaques à 37 ° C pendant 0,5 à 1 h. </li><li> Aspirer soigneusement le LN-521 solution de revêtement sans endommager la surface revêtue. Remarque: Il est essentiel de ne pas endommager la surface revêtue avant l&#39;ensemencement des cellules sur elle. </li><li> Immédiatement ajouter 1 ml de réchauffé avant-mTeSR1 milieu additionné de kinase 10 uM Rho-associé (ROCK) inhibiteur de Y27632 à un puits d&#39;une plaque à 6 puits. Laissez la plaque dans l&#39;incubateur de culture cellulaire pour recevoir des cellules. REMARQUE: Ne jamais laisser les puits de laminine revêtu sécher. </li><li> Aspirer le moyen de hPSCs bien maintenu à environ 75% à 85% de confluence. Laver les cellules d&#39;un puits d&#39;une plaque à 6 puits une fois avec 1 ml de température ambiante 1x DPBS (pas Ca 2+ / Mg 2+). </li><li> Ajouter 0,5 ml de 1 x Accutase aux cellules et incuber à 37 ° C pendant 6-8 minutes pour dissocier les cellules. NOTE: Pour vérifier si la digestion est suffisant ou pas, tapotez doucement la plaque et vérifier si les cellules peuvent se détacher facilement. Si oui, alors il est temps d&#39;arrêter la réaction enzymatique; sinon, prolonger la digestion pour un supplément de 1 - 2 min. </li><li> Mettre fin à la dissociation par addition de 2 ml de milieu frais supplémenté avec mTeSR1 10 uM Y27632 dans les cellules. Pipette de haut en bas à l&#39;aide d&#39;une pointe de P1000 plusieurs fois pour faire une suspension à cellule unique. </li><li> Compter les cellules viables en utilisant un hémocytomètre.Utilisez Trypan bleu pour tache et exclure les cellules mortes 14 </li><li> Calculer le nombre total de cellules nécessaires. Pour routine repiquage HPSC, ensemencer 4 x 10 5 à 5 x 10 5 cellules par puits d&#39;une plaque à 6 puits (ie, 4,21 x 10 4 à 5,26 x 10 4 par cm 2). Pour repiquage hPSCs pour la différenciation des hépatocytes, ensemencer 6,5 x 10 5 à 7,5 x 10 5 (ie, 6,84 x 10 4 à 7,89 x 10 4 par cm 2) cellules par puits d&#39;une plaque à 6 puits. NOTE: La densité de semis pour chaque lignée cellulaire pourrait avoir besoin d&#39;optimisation mineure basée sur la densité empirique donnée ici pour la différenciation hépatique. </li><li> Transférer la suspension cellulaire nécessaire dans 15 ml stérile ou dans 50 ml tube de centrifugation et centrifuger à 115 g pendant 3 min à température ambiante. </li><li> Aspirer le surnageant lentement, puis remettre en suspension le culot cellulaire dans l&#39;eau douce, moyenne mTeSR1 chaud additionné de kinase 10 uM Rho-associé (ROCK) inhibitor Y27632, en utilisant un milieu adéquat pour rendre la densité cellulaire souhaitée. NOTE: L&#39;utilisation d&#39;un inhibiteur de ROCK est fortement recommandé afin d&#39;améliorer la fixation des cellules et le taux de survie. </li><li> Ensemencer les cellules sur les plaques préparées et le rock d&#39;avant en arrière et de gauche à droite pour répartir uniformément les cellules. NOTE: Il est essentiel de veiller à ce que les cellules sont réparties uniformément dans les puits si la plaque est pour la culture cellulaire de routine ou la différenciation des hépatocytes expérimentation. </li><li> Placer les plaques dans l&#39;incubateur de cellules et à maintenir les cellules à 37 ° C / 5% de CO2 pendant 24 heures afin de leur permettre de se fixer et de se rétablir. </li><li> Examinez les cellules le jour suivant et de retirer un inhibiteur de ROCK si le contact cellule-cellule a été établie. Maintenir les cellules dans un milieu mTeSR1 pour la culture de routine ou de passer à un milieu de différenciation selon les besoins. NOTE: Si les cellules ont été ensemencées avec la densité mentionné, la confluence devrait être idéal pour l&#39;entretien de routine ou hépatocytes differentiation. </li></ol> 2. Différencier hPSCs aux cellules hépatocytes-like sur recombinantes laminines <ol><li> Préparer le milieu de différenciation. <ol><li> Faire activine Une solution mère humaine: dissoudre l&#39;activine humaine Une poudre pour faire un / ml solution mère à 100 pg dans stérile 0,2% de sérum albumine bovine (BSA) / DPBS. Faites de petits aliquotes et les stocker à -20 ° C. Utilisez au 1: 1000. </li><li> Faire la souris Wnt 3a solution mère: dissoudre la souris Wnt 3a poudre pour faire un / ml solution mère à 10 pg dans stérile 0,2% de BSA / DPBS. Faites de petits aliquotes et les stocker à -20 ° C. Utilisez au 1: 200. </li><li> Faire facteur de croissance des hépatocytes humains (HGF) solution mère: dissoudre la poudre de HGF humain pour faire un / ml solution mère à 10 pg dans stérile 0,2% de BSA / DPBS. Faites de petits aliquotes et les stocker à -20 ° C. Utilisez au 1: 1000. </li><li> Faire oncostatine M (OSM) solution mère: dissoudre oncostatine M (OSM) en poudre pour faire un / ml solution mère de 20 pg dans stérile 0,2% de BSA / DPBS. Faire de petites aliquotes et sles arracha à -20 ° C. Utilisez au 1: 1000. </li><li> Faire 500 mL de stock moyen d&#39;endoderme-amorçage: supplément de B27 2% (50x, moins de la vitamine A) et 1% de pénicilline / streptomycine (concentrations finales à 100 UI / ml et 100 ng / mL, respectivement); haut jusqu&#39;à 500 mL en utilisant Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) de milieu de base. NOTE: Conserver le stock à 4 ° C et utiliser dans les deux semaines. moyen aliquote du stock et ajouter activine A et Wnt 3a (concentrations finales à 100 ng / ml et 50 ng / mL, respectivement) frais à chaque changement de milieu. </li><li> Faire 500 ml de KSR moyen / différenciation DMSO: 80% knock-out DMEM (KO DMEM), 20% de remplacement de sérum knock-out (KSR), 0,5% GlutaMAX, 1% d&#39;acides aminés non essentiels (NEAA), 0,1 mM de bêta-mercaptoéthanol, 1% de DMSO, et 1% de pénicilline / streptomycine (concentrations finales à 100 UI / ml et 100 pg / ml, respectivement). Filtrer sous vide. Conserver à 4 ° C et utiliser dans les deux semaines. </li><li> Faire 500 mL de milieu de maturation HepatoZYME: 1% GlutaMAX, 10 pM d&#39;hydrocortisone 21-hémisuccinate sel de sodium (HCC) et 1% de pénicilline / streptomycine (concentrations finales à 100 UI / ml et 100 pg / ml, respectivement); haut jusqu&#39;à 500 mL en utilisant HepatoZYME milieu de base. NOTE: Conserver le stock à 4 ° C et utiliser dans les deux semaines. moyen aliquote du stock et ajouter HGF et OSM frais (concentrations finales à 10 ng / ml et 20 ng / mL, respectivement) pour chaque changement de milieu. </li></ol></li><li> hPSCs de semences pour la différenciation des hépatocytes sur LN-521, tel que décrit dans la section 1. Si LN-521 / LN-111 doit être utilisé comme substrat, enduire les plaques avec LN-521 et LN-111 (1: 3) à la concentration finale de la laminine 5 ug / ml; le traitement reste devrait être la même que celle des plaques LN-521 revêtues purs. NOTE: LN-521 / LN-111 ne sont pas idéales pour la culture de routine de hPSCs; il est uniquement utilisé pour des expériences de différenciation. </li><li> Vérifiez la confluence des cellules 24 h après l&#39;ensemencement. Initier la différenciation cellulaire une fois que la confluence des cellules atteint environ 40%. REDéplacez le moyen mTeSR1 passé et ajouter du milieu de l&#39;endoderme-amorçage frais supplémenté avec 100 ng / mL activine A et 50 ng / mL Wnt 3a. Appelez ce jour de différenciation 1. NOTE: Il est fortement recommandé d&#39;initier la différenciation du jour après l&#39;ensemencement des cellules. </li><li> Changer le support d&#39;endoderme-amorçage toutes les 24 h pendant 3 jours pour les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh). En ce qui concerne les cellules souches pluripotentes humaines induites (les hiPSCs), prolonger ce stade pour 2 jours de plus pour amorcer les cellules aux cellules de l&#39; endoderme comme définitives, mais d&#39; utiliser le moyen de endoderme-amorçage complété seulement avec 100 ng / mL activine A pour ces deux jours 12 . REMARQUE: Pour assurer la spécification de l&#39;endoderme réussie, on peut examiner l&#39;expression de marqueurs endodermiques, comme FOXA2 et Sox17. Selon immunofluorescence, plus de 80% des cellules dérivées sont positives pour les deux marqueurs dans notre laboratoire. </li><li> Passez à KSR / DMSO milieu de différenciation au jour 4 (pour CSEh) / jour 6 (pour hiPSCs). Changer le support daily pendant les 3 premiers jours et ensuite sur le cinquième jour de ce stade de différenciation. NOTE: Aucune alimentation est nécessaire sur le quatrième jour de ce stade de différenciation. Utilisez non supplémenté KO-DMEM pour laver les cellules une fois avant changement de milieu, s&#39;il y a beaucoup de cellules mortes. Pour vérifier si la différenciation pour cette étape est réussie ou non, on peut tester l&#39;expression de marqueurs de cellules progénitrices hépatiques, comme l&#39;AFP, CK19 et HNF4A. Près de 90% des cellules sera positif pour ces marqueurs basés sur notre expérience. </li><li> Après 5 jours de la phase de différenciation KSR / DMSO, passer à l&#39;étape de maturation HepatoZYME. Laver les cellules une fois avec un milieu de base brut HepatoZYME après élimination du milieu KSR / DMSO. Ajouter HepatoZYME maturation milieu additionné de 10 ng / mL HGF et 20 ng / mL OSM. </li><li> Changer le support toutes les 48 h pour 7 - 10 jours, à quel point les cellules sont prêtes pour la caractérisation standard ou une utilisation ultérieure. NOTE: hépatocytes examens d&#39;expression du marqueur, métaboliquedes tests fonctionnels (tels que l&#39;activité du cytochrome P450), l&#39;urée et des tests de sécrétion d&#39;albumine, des tests de stockage de glycogène, et indocyanine verte (ICG) des tests d&#39;absorption sont des méthodes de caractérisation typiques. NOTE: Le calendrier du protocole de différenciation est illustré à la figure 5. Dans notre laboratoire, nous vérifions régulièrement hépatocytes spécifique marqueur expression des niveaux des HLCS dérivés, la sécrétion de l&#39;albumine, et le cytochrome P450 (CYP) 3A et 1A2 activité. </li></ol>

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</ol>

Dr David C. Hay est un co-fondateur et directeur de Stemnovate Limited.

Pour faire avancer la recherche sur les cellules souches pluripotentes et la médecine translationnelle, des systèmes sans xéno-qui sont conformes aux lignes directrices de bonnes pratiques de fabrication actuelles sont nécessaires. La clé de tout processus de différenciation est la matrice extracellulaire (ECM). L&#39;ECM soutient non seulement la fixation des cellules, mais fournit également un accès à des facteurs de signalisation clés, influençant la détermination de la cellule et le phénotype 25, 26. Laminines sont multifonctionnelles des protéines de la matrice extracellulaire in vivo. Dans le foie, la laminine sécrétion est cruciale pour la régénération du foie après une hépatectomie partielle 27 et est nécessaire pour progéniteur hépatique maintien des cellules 28. L&#39;importance de laminines dans l&#39;entretien du foie et de la régénération a été la base pour tester commercialement disponibles laminines humains recombinants dans notre système de différenciation des hépatocytes. il supérieurela différenciation des patocyte a été réalisée sur LN-521 et LN-521 / LN-111 substrats par rapport à Matrigel. CLH dérivées ont été clairement polarisées et organisées dans le plat, et leur fonction cellulaire a été significativement améliorée par rapport à leurs homologues gélatineux mélange de protéines. Derrière ces améliorations est la régulation à la baisse de contamination colon-, fibroblast- souches et des gènes associés aux cellules sur les laminines, ainsi que d&#39; une diminution de la prolifération cellulaire et l&#39; expression du gène associé à la migration 10. En conclusion, le protocole décrit ici génère des hépatocytes analogue qui sont plus proches dans la nature pour les hépatocytes humains adultes. Le processus est reproductible, prête à l&#39;automatisation, et peut être rentable à l&#39;échelle pour l&#39;application. Fait important, les variations de lot à lot a été diminué de manière significative par rapport aux techniques qui utilisent Matrigel, ce qui entraîne un système amélioré pour la différenciation des chercheurs dans ce domaine. </p&gt;

tissu humain primaire et les types cellulaires dérivés sont régulièrement utilisés, à la fois pour le criblage à base de cellules et dans la clinique. Cependant, l&#39; accès à ces cellules est sévèrement limitée en raison de dons d&#39;organes insuffisants et la perte de phénotypes cellulaires post-isolement 1. hPSCs représentent une alternative prometteuse aux tissus primaires et de faciliter la génération de cellules somatiques humaines génétiquement définies et renouvelables. cellules hépatocytes-like (CLH) dérivés de hPSCs ont déjà montré des résultats prometteurs dans ce domaine. CLH ressemblent à des hépatocytes humains primaires dans divers aspects, y compris la morphologie des cellules, l&#39; expression du gène de l&#39; hépatocyte, la fonction métabolique et la sensibilité aux médicaments et aux virus 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. En outre, la prolifération illimitée etauto-renouvellement capacité des deux hPSCs cheurs et de qualité GMP facilite leur application 9, 10. Au cours d&#39; une décennie de recherche a produit un certain nombre de procédures de différenciation des hépatocytes efficace 2, 3, 5, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20. Cependant, la plupart de ces systèmes utilisent des composants non définis et / ou la transduction virale pour conduire la spécification hépatocellulaire. Afin d&#39;améliorer la fiabilité de la technologie à l&#39;échelle, il est important de développer une différenciation hépatocytaire robustesystème qui est vraiment défini, libre xéno-et GMP-compatible. Laminines (LNS) sont importantes protéines de matrice extracellulaire qui peuvent influer sur l&#39;adhérence cellulaire, la prolifération, la migration et la différenciation. Les laminines sont des glycoprotéines hétérotrimériques composées d&#39;une α, β une, et une chaîne γ. Récemment, laminines humaines recombinantes ont été produites et utilisées en biologie cellulaire. LN-511 a été montré pour soutenir le maintien de hPSCs 21, tandis qu&#39;un mélange de LN-521 et E-cadhérine permet la dérivation et l&#39;expansion clonale des cellules souches embryonnaires humaines 22. LN-111, d&#39;autre part, soutient le maintien des cellules hepatoblast comme provenant de hPSCs 23. Toutefois, avant notre rapport, laminines 521 et 111 n&#39;a pas été utilisé pour générer CLH avec des caractéristiques matures de hPSCs 10. Ici, nous procédures détaillées pour la culture hPSCs sur LN-521et les différenciant des deux LN-521 ou un mélange de LN-521 et LN-111 (LN-521 / LN-111). Nous avons optimisé le protocole de différenciation en utilisant l&#39; ensemencement à cellule unique pour générer une monocouche hautement reproductible et homogène de CLH dans de nombreux formats 14. Nous croyons que notre système de différenciation défini représente une méthode simple et rentable de fabriquer CLH actifs pour l&#39;application, ce qui représente une étape importante dans le domaine.

<table><tbody><tr><td>Laminine recombinante humaine 521</td><td>BioLamina</td><td>LN521-02</td><td></td></tr><tr><td>Laminine recombinante humaine 111</td><td>BioLamina</td><td>LN111-02</td><td></td></tr><tr><td>Souris recombinante Wnt3a</td><td>R& D Systems</td><td>1324-WN-500/CF</td><td></td></tr><tr><td>Activine humaine A</td><td>Peprotech</td><td>120-14E</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance des hépatocytes humains</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>Oncostatine humaine M</td><td>Peprotech</td><td>300-10</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la kinase associée à la rho (ROCK) Y27632&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone 21-hemisuccinate sel de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4881</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 moyen</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05850</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>HepatoZYME</td><td>Life Technologies</td><td>17705</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplément</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de remplacement knockout</td><td>Life Technologies</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol</td><td>Life Technologies</td><td>31350</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>DPBS avec Calcium et Magnésium</td><td>ThermoFisher</td><td>14040133</td><td></td></tr></tbody></table>

définition et génération évolutive des cellules hépatocytes-like de pluripotentes humaines cellules souches

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) possèdent une grande valeur pour la recherche biomédicale. hPSCs peuvent être mises à l&#39;échelle et différenciée à tous les types de cellules présents dans le corps humain. La différenciation des hPSCs aux cellules hépatocytes comme humaines (CLH) a été largement étudiée, et des protocoles de différenciation efficaces ont été mis en place. La combinaison de la matrice extracellulaire et des stimuli biologiques, y compris les facteurs de croissance, des cytokines, et des petites molécules, ont permis de générer CLH qui ressemblent à des hépatocytes humains primaires. Cependant, la plupart des procédures emploient encore des composants non définis, ce qui donne lieu à une variation de lot à lot. Cela constitue un obstacle important à l&#39;application de la technologie. Pour faire face à ce problème, nous avons développé un système défini pour la différenciation des hépatocytes en utilisant laminines recombinants humains comme matrices extracellulaires en combinaison avec un processus de différenciation sans sérum. Très spécification hépatocytes efficace a été obtenue, avec demonstrated améliorations à la fois la fonction HLC et le phénotype. Surtout, ce système est facile à l&#39;échelle à l&#39;aide de lignes de HPSC recherche et de qualité GMP avancées prometteuses dans la modélisation et les thérapies à base de cellules.

Différenciation hépatocellulaire de hPSCs Une lignée humaine embryonnaire de cellules souches, H9, et une lignée de cellules souches pluripotentes humaines induites, 33D6, ont été utilisés pour la différenciation des hépatocytes. Les résultats présentés dans les figures 1-3 sont des cellules H9, alors que celles de la figure 4 sont des cellules 33D6. Les cellules individuelles ensemencées sur laminines établies contact cellule-cellule après 24 h. Après que les cellules ont atteint environ 40% de confluence, le processus de différenciation a été initiée (figure 1A et figure 4A). Sur laminines (deux LN-521 et LN-521 / LN-111), ces cellules ont subi des changements morphologiques séquentielles et ont donné lieu à CLH polarisées (Figure 1 et Figure 4A). Hépatocytes comme la caractérisation des cellules Day CLH 18 ont été recueillis et évalués pour l&#39;expression de marqueurs d&#39;hépatocytes, représentant HNF4A et ALB (figure 2A). Immunocoloration du jour 18 CLH a montré que près de 90% des cellules exprimé HNF4α (figure 2B). Ces cellules polarisées sur laminines et présentaient un aspect polygonal, comme indiqué par la Cadherine E et F-actin expression (figure 2B). Cytochromes P450 (CYP) L&#39;activité a également été évaluée. Les CYP450 effectuent une fonction métabolique importante des hépatocytes. Jour 18 CLH dérivées d&#39;un mélange de protéines, telles que gélatineux Matrigel, LN-521 ou LN-521 / LN-111, ont été testés pour l&#39;activité de CYP3A. CLH a démontré une activité significativement plus élevée CYP3A sur des substrats de laminine que sur matrigel (figure 3). Il est important, par rapport aux hépatocytes primaires humains commerciaux (HU1339) re-plaqué sur ces substrats, CLH ont près de 10 fois plus hauts niveauxde l&#39; activité de CYP3A 10. La différenciation des hiPSCs était similaire à celle de hESC. Les cellules ont présenté des changements séquentiels dans l&#39; apparence (figure 4A). CLH dérivés ont exprimé un facteur de transcription hépatocytes clé, HNF4α (figure 4B), et possédaient une activité de CYP3A et de l&#39; albumine sécrétée (figure 4C et D). Notamment, CLH dérivés de 33D6 affichés réduits CYP3A par rapport aux cellules H9 dérivées CLH (Figure 3), mais il était encore comparable à hépatocytes primaires humains 10. Cependant, la sécrétion d&#39;albumine de ces CLH était beaucoup plus faible que dans les hépatocytes primaires 10. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig1.jpg" /> Figure 1: Les séquentiels morphologiques Modifications au cours de la différenciation hépatique. &lt;/ strong&gt; (A) CSEh indifférenciées ensemencées comme des cellules individuelles ont atteint environ 40% de confluence 24 h après l&#39; ensemencement. (B) Après amorçage, les cellules présentaient la morphologie typique endodermique le jour 4. (C) Après avoir atteint le stade de la hepatoblast-like, ils ont montré une forme polygonale clairement le jour 9. (D) Après la phase de maturation, CLH polarisés étaient prêts pour une caractérisation plus poussée montré ici au jour 18. barre d&#39;échelle = 200 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55355/55355fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig2.jpg" /> Figure 2: Caractérisation de CLH. (A) L&#39; expression des gènes de marqueurs spécifiques hépatocytes, HNF4A ( à gauche) et ALB ( à droite). Le niveau d&#39;expression a été analysée à l&#39;aide le jour 18 CLH dérivésde CSEh à la fois sur LN-521 et LN-521 / LN-111, et il a été normalisée à la GAPDH de gène de ménage et exprimé par rapport à CSEh. Les résultats représentent trois répétitions biologiques, et les barres d&#39;erreur représentent l&#39;écart-type (SD). * P &lt;0,05, ** p &lt;0,01; apparié t-test. (B) Protéine expression d&#39;un marqueur clé hépatique, HNF4α et les marqueurs de polarisation, la E-cadhérine et la F-actine. Jour 18 CLH sur LN-521 et LN-521 / LN-111 ont été colorées pour les marqueurs ci-dessus et de contraste avec Hoechst 33342. Un témoin négatif a été réalisée avec l&#39;immunoglobuline G (IgG) correspondante. Le pourcentage de cellules HNF4α-positives et le SD est affiché. Cela a été calculé à partir de quatre champs aléatoires de vue. Les images ont été prises à un grossissement de 20x. Barre d&#39;échelle = 100 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55355/55355fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Figure 3: Metabolic Caractérisation des fonctions de CLH. Cytochrome P450 activité du CYP3A des cellules cultivées sur Matrigel (MG), LN-521 ou LN-521 / LN-111 a été testé. Les données représentent trois répétitions biologiques, et les barres d&#39;erreur représentent SD. ** P &lt;0,01; ANOVA à une voie avec le test post-hoc de Tukey. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55355/55355fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig4.jpg" /> Figure 4: Caractérisation standard de CLH. hiPSCs cultivées sur LN-521 ont été différenciées en CLH. tests de caractérisation standard ont été effectués le jour 17 CLH. (A) La morphologie des cellules séquentielle au cours de la différenciation hépatique; r points de temps indiqué<html> cellules epresent les jours 1, 4, 9, et 17. (B) immunocoloration d&#39;expression HNF4α. Le pourcentage de cellules positives et le SD est affiché sur la base de quatre champs aléatoires de vue. Les images ont été prises à un grossissement de 20x. Barre d&#39;échelle = 100 um. (C) l&#39; activité du CYP3A le jour 17 CLH. Les données représentent six répétitions biologiques, et la barre d&#39;erreur représente le SD. (D) Albumine sécrétion de CLH dérivés de plus de 24 h dans la culture. Les données représentent quatre répétitions biologiques, et la barre d&#39;erreur représente SD. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55355/55355fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/55355/55355fig5.jpg" /> Figure 5: Chronologie schématique du protocole de différenciation.t = &quot;_ blank&quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

La méthode présentée ici décrit une solution évolutive et de bonnes pratiques de fabrication (BPF) système de différenciation -ready pour générer des cellules hépatocytes humains comme à partir de cellules souches pluripotentes. Il sert comme un système rentable et standardisée pour générer des cellules hépatocytes comme humains pour la recherche fondamentale et appliquée foie humain.

Définition et génération évolutive des cellules hépatocytes-like de pluripotentes humaines Cellules souches

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

L'objectif général de ce protocole est de produire des cellules hépatocytes humaines à partir de cellules souches pluripotentes en utilisant des matrices de laminine recombinante dans des conditions définies. Cette méthode permet à l'utilisateur de fabriquer sur mesure des hépatocytes humains fonctionnels pour étudier la biologie du foie in vitro. Le principal avantage de cette technique réside dans son caractère défini, qui permet une production à grande échelle d'hépatocytes avec un haut degré de reproductibilité expérimentale. Pour commencer l'expérience, décongeler un stock de laminine-521 recombinante, ou LN-521, à 100 microgrammes par millilitre à quatre degrés Celsius. Diluer la LN-521 décongelée dans du DPBS 1x froid avec calcium et magnésium afin d'obtenir une solution à cinq microgrammes par millilitre. Ajouter un millilitre de la solution de LN-521 à cinq microgrammes par millilitre pour recouvrir une cavité d'une plaque à six puits, puis agiter doucement la plaque afin de répartir uniformément la solution dans la cavité. Incuber ensuite les plaques dans une étuve à cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant au moins deux heures pour une utilisation urgente. Retirer la plaque recouverte de l'étuve et la placer dans la hotte de culture tissulaire. Aspirer soigneusement la solution de LN-521 de revêtement sans endommager la surface recouverte. Puis ajouter immédiatement un millilitre de mTeSR préchauffé

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

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