Hydrogel nanoparticelle raccolta di plasma o nelle urine per il rilevamento di proteine ​​a basso Abbondanza

L'obiettivo generale di questa procedura è raccogliere, concentrare e conservare biomarcatori a bassa abbondanza e basso peso molecolare da fluidi biologici a concentrazioni appropriate. Per i saggi proteici standard, ciò si ottiene aggiungendo prima nanoparticelle di idrogel chimicamente funzionalizzate al fluido biologico, a basso peso molecolare. Gli analiti entrano nel nucleo della nanoparticella e vengono catturati da diversi coloranti chimici organici, che agiscono come esche proteiche ad alta affinità.

Il secondo passo consiste nel separare le particelle dal biofluido mediante centrifugazione. Le nanoparticelle concentrano le proteine di interesse di diversi ordini di grandezza. Le nanoparticelle vengono quindi lavate con acqua per rimuovere le proteine estranee.

Il passaggio finale consiste nell'eluire le proteine catturate dalle nanoparticelle. In definitiva, il western blotting, la spettrometria di massa o i saggi amminometrici vengono utilizzati per mostrare la presenza e/o la concentrazione dei biomarcatori di bassa abbondanza raccolti precedentemente non rilevabili. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché le nanoparticelle devono essere lavate e sospese.

Senza ostruire la punta della pipetta, le nanoparticelle non si sospendono facilmente come una cellula P.So è necessario pipettare vigorosamente su e giù per sospendere adeguatamente le nanoparticelle dopo la prima incubazione. Con le nanoparticelle, è importante sciacquare le pareti del tubo per raccogliere eventuali residui di nanoparticelle che potrebbero aderire al tubo. Per eseguire l'elaborazione di nanoparticelle di campioni di siero, diluire 500 microlitri di siero umano uno a due con tris da 50 millimolari, HCL pH sette in una provetta da microcentrifuga.

Aggiungere 500 microlitri di poli e isop propil acrilammide o poli nipam co monomeri di nanoparticelle di acido acrilico e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi centrifugare il campione a 16, 100 volte G e 25 gradi Celsius per 10 minuti. In una centrifuga dotata di rotore ad angolo fisso, rimuovere e scartare il natina SUP prima di aggiungere 500 microlitri di tiocianato di sodio all'ato al pellet, risospendere le nanoparticelle pipettando energicamente su e giù più volte.

Centrifugare il campione come prima e scartare il surnatante prima di aggiungere 500 microlitri di milli Q di acqua al pellet di nanoparticelle. Ancora una volta, sospendere le nanoparticelle pipettando vigorosamente su e giù più volte. Dopo aver girato nuovamente il campione, avevo 300 microlitri di elucian fresco, tamponare e risospendere utilizzando la tecnica dimostrata.

Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo una centrifuga finale del campione, rimuovere e conservare l'EIT in una provetta da microcentrifuga con etichetta pulita. Eluire una seconda volta e combinare i due EIT in un'unica microcentrifuga. Due.

Quindi, asciugare gli EIT sotto il flusso di azoto e un collettore dell'evaporatore di azoto a 42,1 gradi Celsius con flusso d'aria impostato su sei. Conservare l'EIT essiccato a temperatura ambiente per la conservazione durante la notte o aggiungere 20 gradi Celsius negativi per la conservazione a lungo termine prima della spettrometria di massa, del Western blotting o dei saggi EISA per eseguire l'elaborazione di nanoparticelle di campioni di urina. Raccogliere un volume minimo di 22 millilitri e conservare i campioni a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius fino al momento dell'analisi.

Scongelare l'urina congelata a temperatura ambiente o a quattro gradi Celsius durante la notte. Una volta scongelato, mescolato brevemente su un miscelatore a vortice. Quindi versare almeno 22 millilitri di urina in un tubo di polipropilene a fondo conico da 50 millilitri.

Quindi, centrifugare l'urina in una centrifuga con rotore oscillante a 3, 700 volte G per 15 minuti senza disturbare il pellet. Decantare l'urina in una provetta di polipropilene pulita da 50 millilitri a fondo conico e gettare il pellet. Eseguire l'analisi delle urine utilizzando una striscia reattiva con stick di urina multianalita.

Appoggiare la striscia di reagenti a faccia in su su un tovagliolo di carta pulito e asciutto. Utilizzare una pipetta usa e getta per aspirare un millilitro di urina. Erogare rapidamente una o due gocce di urina su ciascun tampone reattivo della striscia reattiva.

Avviare immediatamente un timer precedentemente impostato per due minuti all'ora indicata sul contenitore della striscia di reagenti. Registrare i risultati qualitativi per i vari analiti nella striscia di reagenti confrontando il colore delle singole strisce di reagenti con i corrispondenti indicatori di codice colore sul contenitore del reagente. I risultati tipici delle urine normali sono caratterizzati da un pH compreso tra 5,5 e 7,0 e un peso specifico compreso tra 1,001 e 1,020.

L'urina deve essere negativa per le proteine del sangue, i leucociti, i nitriti, il glucosio, i chetoni, la bilirubina e l'urobilinogeno. Quindi, trasferire 20 millilitri di urina chiarificata in una provetta pulita di polipropilene a fondo conico da 50 millilitri. Non disturbare eventuali detriti che potrebbero trovarsi sul fondo del tubo dell'urina da cui si sta rimuovendo l'urina.

Aggiungere 200 microlitri di nanoparticelle al campione di urina da 20 millilitri e mescolare brevemente su un miscelatore a vortice. Quindi incubare la miscela di nanoparticelle di urina per 30 minuti a temperatura ambiente senza oscillare o mescolare. Far girare la sospensione di nanoparticelle di urina in una centrifuga dotata di rotore oscillante a 3, 700 volte G per 10 minuti.

Dopo aver rimosso e scartato il surnatante, aggiungere 500 microlitri di acqua Milli Q al pellet di nanoparticelle. Risospendere le nanoparticelle pipettando energicamente su e giù più volte. Trasferire la soluzione di nanoparticelle in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 millilitri.

Successivamente, far girare le nanoparticelle in una centrifuga dotata di un rotore ad angolo fisso a 16, 100 volte G per 10 minuti. Rimuovere ed eliminare il surnatante prima di ripetere questi passaggi con acqua. Per lavare le nanoparticelle, aggiungere 20 microlitri di tampone di eluizione fresco al pellet di nanoparticelle e risospendere le nanoparticelle pipettando energicamente su e giù più volte.

Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare nuovamente i campioni di nanoparticelle prima di rimuovere la trappola senza interrompere il pellet di nanoparticelle e conservando il surnatante in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 millilitri. Gettare il pellet nella spazzatura a rischio biologico.

Collocare i campioni in un rack in una cappa chimica. Aprire i tappi e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. In alternativa, posizionare i campioni sotto il flusso di azoto a 40 gradi Celsius fino a quando non sono asciutti.

Aggiungere 15 microlitri di tampone per campioni SDS di tris glicina ai campioni. Riscaldare a 100 gradi Celsius in un blocco di calore secco per cinque minuti con i tappi aperti o fino a quando il volume rimasto nel tubo non supera i 20 microlitri. Posizionare il tappo sui tubi e rimuovere i tubi dal blocco termico.

Il campione può essere conservato a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius o utilizzato immediatamente per l'analisi Western blot a valle. L'elettroforesi su gel 1D con colorazione d'argento dimostra la cattura delle nanoparticelle e la concentrazione del fattore di necrosi tumorale alfa dal plasma umano. La banda che rappresenta il fattore di necrosi tumorale alfa è presente solo nelle EIT delle nanoparticelle designate con la lettera P per le particelle, ma non nelle nanoparticelle surnatanti Funzionalizzate con due diverse esche chimiche, l'acido acrilico o il guscio centrale VSA sono in grado di raccogliere varie concentrazioni di IL 17 dal western blotting al plasma del surnatante e della nanoparticella.

EIT dimostra chiaramente la presenza di IL 17 nella banda di 17,5 kilodalton nell'eit, ma non nella nanoparticella surnatante. La raccolta di campioni di urina può rivelare antigeni batterici e citochine in questa pagina SDS colorata d'argento. Analisi di campioni di urina, i campioni nelle corsie U quattro e U sei sono EIT di nanoparticelle da campioni di urina contenenti RET, ESAT sei, una proteina associata a mycobacterium tuberculosis, e IL due, una citochina.

Queste proteine sono rappresentate dalle bande prominenti a 15 kilodalton. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come le nanoparticelle di gel possono essere utilizzate per raccogliere, concentrare e conservare biomarcatori a basso abbandono nei fluidi biologici, escludendo contemporaneamente le molecole abbandonate indesiderate, aumentando così notevolmente la sensibilità di rilevamento degli attuali metodi analitici.