Un tissu microarray de nouvelle génération (ngTMA Protocol) pour les études de biomarqueurs

L’objectif de la procédure suivante est de construire des microréseaux de tissus optimaux ou ciblés pour une utilisation ultérieure dans la recherche de biomarqueurs. Tout d’abord, une archive numérique de lames est générée à partir de lames de tissus représentatives. Les zones d’intérêt histologique sont annotées sur les lames numériques pour spécifier les régions exactes des blocs donneurs correspondants à transférer dans le bloc microradiographique tissulaire.

Une fois la conception et la disposition des microréseaux de tissus créées, les blocs donneurs sont automatiquement poinçonnés et la cause est chargée dans les microréseaux de tissus. Grâce à cette approche de nouvelle génération précise, rapide et automatisée, des zones histologiques précises ou même des groupes particuliers de cellules peuvent être capturés avec précision et transférés à une puce à tissus. Le principal avantage de notre technique par rapport aux méthodes existantes de micro-anneau tissulaire, comme l’utilisation d’un appareil fait maison ou semi-automatisé, est clairement la précision histologique.

Ceci est accompli en combinant les forces de la pathologie numérique avec l’expertise histologique et également le micro-anneau tissulaire automatisé démontrant la procédure aujourd’hui par Kalin Hamman et Jose Galvan. Deux assistance technique de notre laboratoire à l’aide du logiciel de numérisation. Sélectionnez d’abord le mode automatique pour la numérisation en fond clair.

Cliquez ensuite sur les options de numérisation pour ajuster les paramètres de qualité de la diapositive. Choisissez maintenant d’enregistrer les numérisations de diapositives localement ou sur le Web en cliquant sur les paramètres du serveur et de définir la destination de numérisation au centre du boîtier. Maintenant, préparez les diapositives avant de les charger dans le magasin Pour le scanner, vérifiez que les diapositives sont propres.

Si nécessaire, nettoyez-les Avec de l’éthanol, jusqu’à 25 lames peuvent être chargées dans chaque magasin et le scanner peut être chargé avec jusqu’à 10 magasins. Plusieurs chargeurs sont empilés lorsqu’ils sont chargés. Une fois les diapositives chargées, donnez toutes les diapositives, les noms de fichiers et définissez le dossier d’enregistrement au centre du dossier.

Commencez maintenant à scanner la diapositive en cliquant sur la flèche verte. Dans cette section, les emplacements à partir desquels les échantillons de tissus sont perforés sur la lame sont définis par des annotations sur la lame numérique. Commencez par ouvrir le dossier de diapositives numériques.

Dans le logiciel de visualisation, des modifications peuvent être apportées au dossier lui-même. Des notes peuvent être ajoutées, les diapositives peuvent être réorganisées et les privilèges de l’utilisateur peuvent être définis, tout comme les pièces jointes. Commencez maintenant à annoter les diapositives en cliquant sur l’une d’elles.

Il apparaîtra dans le visualiseur. Dans le visualiseur. Utilisez l’outil d’agrandissement pour évaluer la diapositive et trouver les zones d’intérêt à intégrer dans la prochaine génération de TMA.

À l’aide de l’outil d’annotation TMA, sélectionnez la taille du noyau souhaité et la couleur de l’annotation. Joignez cette annotation à une diapositive en cliquant sur celle-ci. Ensuite, déplacez l’annotation vers les structures histologiques souhaitées.

Ces annotations marquent les emplacements des poinçons sur le bloc de tissu correspondant. Répétez ce processus jusqu’à ce que toutes les diapositives soient annotées. Une autre option pour la cause tissulaire est de les envoyer dans un tube PCR de 0,2 millilitre pour une analyse moléculaire.

Annotez les diapositives à l’aide d’une marque de couleur différente pour distinguer ces points de ceux qui sont le TMA. Une fois toutes les annotations effectuées, enregistrez un fichier de feuille de calcul contenant une liste de toutes les diapositives avec leurs annotations correspondantes et les couleurs d’annotation. Commencez la microreconstruction tissulaire en récupérant les blocs de tissu de paraffine correspondants pour toutes les lames numériques annotées, et ainsi de suite.

Appelez les blocs de donateurs. Triez les blocs dans le même ordre que les diapositives numériques. Vérifiez que chaque bloc a une épaisseur d’au moins quatre millimètres.

Si ce n’est pas le cas, le tissu devra être réinventé à l’ordinateur. Ouvrez la micropuce à tissus du logiciel et donnez un nom au projet. Allez dans le changement d’outil et sélectionnez le diamètre d’outil requis.

Chargez maintenant jusqu’à 12 blocs de destinataires dans la machine. Prenez note des noms des blocs. Ils doivent tous être étiquetés à l’aide du même système de numérotation pour plus de cohérence.

Ensuite, dans le logiciel, attribuez le nom approprié à chacun des blocs pour créer une mise en page TMA. Tout d’abord, créez un nouveau design TMA en attribuant le nombre de lignes, de colonnes, de lignes vides et l’espacement des poinçons. Enregistrez la mise en page et attribuez-la au bloc.

Répétez ensuite le processus pour le bloc suivant. Avec une nouvelle mise en page ou la même mise en page, les tailles de noyau peuvent varier entre les blocs de destinataires. Ensuite, chargez jusqu’à 60 blocs donneurs dans la machine.

Jusqu’à 10 blocs s’insèrent dans chaque rangée. A à F.Les blocs donateurs restants seront chargés ultérieurement dans le logiciel. Donnez à chaque bloc donateur un nom d’identification.

Une image de chaque bloc sera acquise automatiquement. Alignez maintenant les diapositives numériques avec les blocs donateurs correspondants. Tout d’abord, sélectionnez un bloc.

Cliquez ensuite sur la diapositive et comparez la diapositive et les images de bloc côte à côte. Sélectionnez des points de référence sur l’image du bloc donneur qui correspondent à des points spécifiques sur la diapositive numérique correspondante. Cliquez ensuite sur suivant et les annotations se déplaceront sur l’image du bloc donneur.

Si les annotations sont correctes, cliquez sur chacune d’elles pour confirmer son emplacement. Cliquez ensuite sur démarrer. Cela incite la puce à percer un trou au point de référence dans le bloc récepteur, puis à percer un trou à partir du bloc donneur au même endroit et à transférer le noyau au bloc récepteur.

Pour collecter des carottes dans un tube PCR, cliquez sur l’outil PCR du bloc. Jusqu’à quatre annotations peuvent être utilisées pour alimenter le tube en tissu. Une fois qu’ils sont définis, cliquez sur démarrer et le donneur sera appelé et le tube chargé.

Une fois que la machine a foré et poinçonné, carotte, mis à jour l’image du bloc donneur. Répétez l’alignement et annotez pour le bloc suivant. Ensuite, le noyauter.

Continuez à faire cela pour chaque bloc de donateurs. Ce sera dans la TMA. Lorsque le premier ensemble de 60 blocs donneurs est terminé, déchargez-les et chargez 60 blocs supplémentaires.

Continuez le processus jusqu’à ce que tous les blocs donneurs soient disposés. Après avoir prélevé environ 500 carottes, nettoyez la perceuse et l’outil de poinçonnage xle. Une fois les tableaux terminés, exportez le projet.

Un fichier tableur contenant les données du projet se trouvera dans le dossier d’exportation. Il indique l’emplacement de chaque échantillon dans chaque bloc TMA. Enregistrez ensuite les images du bloc donneur avec les annotations superposées sous forme de fichiers JPEG dans le dossier d’exportation.

Le processus de génération du bloc TMA est terminé. Cette disposition TMA montre six blocs TMA NG qui ont été construits en deux copies pour 12 blocs finaux pour remplir le réseau. Chaque bloc tumoral contenait 402 taches tissulaires et chaque bloc de tissu normal contenait 268 taches.

Après que 60 blocs de donneurs aient été annotés, la cause a été poinçonnée. Le temps de transfert du noyau était d’environ 12 secondes. La perte de noyau a été minime, et le temps total pour un réseau, ce projet, était d’environ 24 heures.

Cela comprenait le temps nécessaire pour poinçonner la cause de l’analyse moléculaire ultérieure après le processus de N-G-T-M-A. D’autres méthodes telles que l’immunohistochimie dans l’hybridation cyto et même des colorations spéciales peuvent être appliquées à ces microréseaux tissulaires afin de répondre à certaines questions telles que les gènes ou les protéines qui sont exprimés ou même modifiés dans différents tissus.