Name: Utilisant conçus sur mesure galvanotaxie Chambers à étudier directionnel migration des cellules de la prostate (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Découvrez la galvanotaxie sur mesure pour étudier la migration directionnelle des cellules de la prostate. Cette méthode permet d'analyser le comportement cellulaire en réponse à un champ électrique physiologique appliqué.

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Les lignées de cellules de la prostate sont aimablement fournies par le Dr Ling-Yu Wang et le Dr Kung Hsing-Jien au Cancer Center, UC Davis. Ce projet est soutenu par le NIH galvanotaxie subvention 4R33AI080604.

1. Culture de cellules de la prostate <ol><li> Culture les PRNS-1-1 et PNT2 prostate cellules sur des boîtes de 100 mm de la culture dans un milieu RPMI 1640 complété avec 10% de FBS et antibiotiques antimycosique à 37 ° C avec 5% de CO 2. Actualiser le milieu de culture tous les jours jusqu'à ce que les cellules atteignent 80% de confluence pour les expériences de galvanotaxie. </li></ol> 2. Assemblage galvanotaxie Chambers <ol><li> Assemblage chambres inférieures <ol><li> Essuyer une chambre de galvanotaxie plastique avec du 2-propanol. Appliquer le scellant de silicium de qualité marine autour des ouvertures circulaires sur la face inférieure d'une chambre avec une seringue et attacher une grande lamelle (figure 1). Utilisez le côté arrière d'un applicateur de coton pour faire baisser la lamelle et essuyez l'excès de colle avec des cotons-tiges. Les ouvertures circulaires permettent au milieu et le courant électrique à se écouler sur les cellules se trouvant entre les deux réservoirs intérieurs moyennes. </li><li> Couper une petite lamelle de faire 6 mm x 25 mm entretoises avec un marqueur de pointe de diamant. </li><li> Retournez la chambre. Appliquer deux bandes de colle de silicium avec une seringue et / ou une spatule en métal pour créer une surface de canal de 25 mm x 10 mm pour la fixation des cellules entre les deux ouvertures circulaires sur la vitre inférieure. Coller deux morceaux de verre entretoise entre les deux ouvertures circulaires. Utilisez le côté arrière des applicateurs de coton pour faire baisser les entretoises et essuyez l'excès de colle avec des tampons et / ou des cure-dents coton. </li><li> Séchez la chambre pendant 24 heures jusqu'à ce que la colle de silicium est guéri. Faire tremper pendant une nuit dans la chambre de l'eau distillée pour éliminer le résidu de l'acide acétique à partir de la colle. Séchez la chambre pour une utilisation immédiate, ou de stocker la chambre pour une utilisation ultérieure dans un récipient propre. <img alt="Schéma de configuration de la chambre Galvanotaxi, assemblage détaillé avec entretoises en verre, couvercle inférieur, verre." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figure 1: Assemblée de la chambre du fond. A) Une grande lamelle est fixé sur le fond d'une chambre propre. B) TDeux morceaux de cales de verre sont collées entre les deux ouvertures circulaires pour créer un canal x 25 mm 10 mm pour cellules de se fixer. </li></ol></li><li> Ensemencement de cellules sur les chambres à galvanotaxie <ol><li> Préparer le nombre de chambres de nécessiter galvanotaxie nécessaires pour l'expérience. Chaque ligne ou cellule de traitement nécessite une chambre de galvanotaxie unique. Essuyer les chambres de galvanotaxie avec du 2-propanol. Laver les chambres stériles avec PBS trois fois et vérifier l'écoulement de liquide entre les deux ouvertures circulaires dans les chambres. </li><li> Joindre les chambres dans des boîtes de culture de cellules stériles et les laisser se équilibrer à 37 ° C pendant 15 min. Détacher les cellules de la prostate à partir de leur boîte de culture de 5 ml en utilisant 0,25% de trypsine-EDTA à 37 ° C pendant 5 min. Neutraliser la trypsine-EDTA avec 5 ml de 10% de FBS dans du PBS. </li><li> Transférer les cellules pour tubes de 15 ml et centrifuger les cellules pendant 5 min à 200 x g, 37 ° C. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu de culture. </li><li> Prenez 20 μl de solution de cellule de charge à une chambre de comptage et calculer le nombre de cellules. Ajuster la concentration cellulaire à 8 x 10 4 cellules / ml avec du milieu de culture. </li><li> Prenez les chambres de galvanotaxie de la 37 ° C incubateur. Ensemencer 350 ul de la suspension cellulaire sur chaque chambre. </li><li> Incuber les cellules pendant une nuit dans les chambres dans la boîte de culture avec Kimwipe ou humide dans une chambre d'humidité à l'étuve à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li></ol></li></ol><img alt="Diagramme de migration des cellules de la prostate avec configuration d’incubateur pour une analyse expérimentale à 37°C, 5 % de CO2." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figure 2:. Ensemencement des cellules à la chambre La chambre inférieure est séché et nettoyé cellules A) de la prostate sont trypsinisées, comptées et transférés dans la chambre et incubées pendant une nuit B) Une lamelle supérieure est fixée à étanchéité de la chambre avant le tournage... <ol start="3"><li> Unssembling les meilleurs chambres <ol><li> Assemblez la chambre supérieure avant le tournage. Le microscope ne peut accueillir l'imagerie d'une chambre de galvanotaxie seul à la fois. Réchauffez-vous 10 ml de milieu de culture à 37 ° C pour chaque chambre de galvanotaxie. Transférer une chambre de galvanotaxie des incubateurs à une plaque C de réchauffement de 37 °. </li><li> Rincer les cellules avec un milieu de culture pour éliminer les cellules seules. Donner 400 pi de milieu dans la chambre. Utilisez une seringue pour appliquer de la graisse à vide élevé au-dessus de deux cales de verre. </li><li> Ajouter une petite lamelle pour sceller la chambre. Appuyez doucement la lamelle avec le côté arrière d'un applicateur de coton. Essuyez l'excès du milieu avec des cotons-tiges. </li><li> Séchez la surface de verre et appliquer de la graisse à vide élevé pour sceller l'écart entre la lamelle et la chambre. Utiliser une spatule en métal pour répartir la graisse. Ajouter 4 ml du milieu de culture pour les réservoirs intérieurs et vérifier l'écoulement de liquide entre les réservoirs. </li></ol></li><li> Assurez-agarponts <ol><li> Couper une paire de long tuyau de PVC de 2 pouces (503/16 ID x 5/16 x 1/16 OD mur), flip et les insérer dans un bécher de 100 ml. </li><li> Mesurer 200 mg de Bacto-Agar et l'ajouter à un ballon de 50 ml avec 10 ml de milieu de culture pour faire gel d'agar à 2%. Micro-ondes pendant 30 secondes. Chargez le gel d'agar à la tubulure en plastique avec une pipette de transfert. Laissez les ponts de gélose à la température ambiante pendant 10 minutes pour solidifier la gélose. </li><li> Ajouter 2 ml de milieu de culture dans les réservoirs extérieurs de la chambre de galvanotaxie. Insérer les ponts de gélose au milieu des réservoirs intérieur et extérieur pour conduire le courant. </li></ol></li></ol><img alt="Schéma d’expérience Galvanotaxis montrant la configuration de la chambre avec des ponts en gélose et une alimentation en courant continu pour la migration des cellules." fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig3highres.jpg" width="350" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figure 3:. Lieux les cellules de la chambre de mettre en évidence un schéma de l'assemblage final de la chambre de galvanotaxie. La chambre est complètement scellé avec de la graisse à vide élevé. Medium est t ajoutéo remplir les réservoirs, et deux ponts d'agar sont insérés dans la chambre. Ensuite, la chambre de galvanotaxie est transféré vers la platine du microscope et les électrodes sont fixées à appliquer le champ électrique. Vue latérale de la chambre de galvanotaxie assemblé est illustré pour démontrer que le courant électrique circule dans les cellules à travers les ponts de gélose et l'espace entre le verre de protection. 3. imagerie time-lapse <ol><li> Mettre en marche l'enceinte climatique à 37 ° C avec 5% de CO 2 dans l'air circulant deux heures avant l'imagerie. </li><li> Allumez le microscope et lancer le logiciel d'image-acquisition. Calibrer la platine du microscope et sélectionnez l'objectif 10X. </li><li> Transférez les chambres de galvanotaxie à la platine du microscope, sécuriser la chambre avec du ruban adhésif et de se concentrer sur les cellules. Insérer les électrodes du galvanotaxie aux réservoirs extérieurs à cathode sur le côté droit. Fixez le fil et les électrodes avec du ruban adhésif. </li><li> Allumez le bo de puissancex pour appliquer un champ électrique dans la chambre. Mesurer la tension de sortie avec le voltmètre à travers la chambre pour atteindre 2,5 volt pour la longue chambre 25 mm (100 mV / mm). Maintenir l'intensité du champ au cours de l'expérience en ajustant le courant de sortie. </li><li> Sélectionnez 10 points à travers la chambre de filmer dans le logiciel pour générer des dix films time-lapse. Mettre en place les conditions d'acquisition à intervalles de 10 min pendant 2 heures. </li><li> Commencer à filmer et ajuster le courant de sortie en fonction des besoins. </li><li> A la fin de l'expérience, retirer la chambre de la scène et fixer les cellules avec 95% d'alcool. Casser la chambre avec une lame de rasoir pour nettoyer et re-utiliser. </li></ol> 4. Quantification des galvanotaxie <ol><li> Faites tourner les films de time-lapse et réorienter la cathode vers le haut des images. Exporter les films sur le logiciel de suivi de la cellule. </li><li> Suivre manuellement le (x, y) de 10 à 20 cellules à chaque point de temps de chaque film (Figure 4 A, B).Les distances de migration et les angles par rapport à la direction nord-sud, la même orientation du champ électrique, seront calculées dans le logiciel de suivi de la cellule (figure 4C). NOTE: La vitesse moyenne de migration est converti de la distance de migration totale et le temps de tournage totale. La directivité est converti à partir des angles par rapport à la valeur du cosinus. Si les cellules migrent avec directivité aléatoire, la moyenne des cosinus net sera proche de zéro. Si les cellules migrent directement vers la cathode, la valeur de cosinus sera une. Si les cellules migrer directement vers l'anode, la valeur de cosinus sera -1. </li></ol><img alt="Comparaison de la migration cellulaire, migration aléatoire vs galvanotaxie, schéma avec équation du cosinus pour la direction." fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig4highres.jpg" width="400" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figure 4: Suivi de la cellule à mesurer directivité A) Superposition des lignes de repérage des images de cellules.. Les positions (x, y) des cellules sont manually suivis dans les films time-lapse. . Si les cellules migrent de façon aléatoire, le cosinus moyen est proche de zéro B) Cependant, si les cellules migrent vers la cathode ou l'anode, la valeur du cosinus est proche de la moyenne + (cathode) ou -. (Anode) 1,0 C ) La directivité est présenté par la valeur du cosinus, qui est converti à partir des angles de migration (θ). Le cosinus (θ) est égal au rapport de la distance a (la distance de migration) à distance b (la distance projetée à la direction du champ électrique). <ol start="3"><li> Sauvegardez les mesures. Importez les données à une application de base de données pour calculer les résultats combinés. </li><li> Exporter les données combinées de vitesse de migration moyen et la valeur moyenne du cosinus à une feuille de calcul pour tracer les graphiques à barres (figure 5). </li></ol>

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<li>Mukerjee, E. V., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R., Collins, S. D., Smith, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedle+array+for+measuring+wound+generated+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Conf+Proc+IEEE+Eng+Med+Biol+Soc%22%5BJournal%5D)">Microneedle array for measuring wound generated electric fields.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 4326-4328 (2006).</li>
<li>Nuccitelli, R., Nuccitelli, P., Li, C., Narsing, S., Pariser, D. M., Lui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electric+field+near+human+skin+wounds+declines+with+age+and+provides+a+noninvasive+indicator+of+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Rep.+and+Reg%22%5BJournal%5D)">The electric field near human skin wounds declines with age and provides a noninvasive indicator of wound healing.</a> Wound Rep. and Reg. 19, 645-655 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L&#39;analyse de la réponse d&#39;une cellule de galvanotaxie a été un indicateur fonctionnel important pour un grand nombre de migration cellulaire ou la croissance des processus 27, 28. Ici, nous utilisons une chambre sur mesure avec la surface de verre à film à deux lignées de cellules de la prostate. Ces lignées cellulaires ont démontré des degrés différents de galvanotaxie, et nous avons spéculé que la localisation intracellulaire ou l&#39;activation des protéines de galvanotaxie-médiation pourraient int...

Les champs électriques endogènes sont détectés dans divers tissus tels que la peau, 1, 32, 33 et deux cerveau. Le champ électrique physiologique sert des fonctions biologiques spécifiques, y compris diriger le développement des embryons 3, 4, le guidage du prolongement de processus neuronaux 5, 6 et la promotion de l&#39;épithélium et la cornée plaie fermeture 1, 7. In vitro, l&#39;application d&#39;un champ électrique à courant continu à des cellules cultivées imite le champ électrique physiologique et induit la migration cellulaire directionnelle ou galvanotaxie. Galvanotaxie a été étudié dans des fibroblastes, des kératinocytes 8 9 de poisson, épithélial humain et les kératinocytes de la cornée 10 à 12, les lymphocytes 13, deux neuroblastes et les cellules progénitrices neuronales 14. Lorsqu&#39;il est exposé au champ appliqué, la majorité des cellules étudiées migrer de manière directionnelle vers l&#39;cathodique pôle (-). Cependant, plusieurs cellules cancéreuses, y compris hautement métastatiquecellules de cancer du sein humain et la lignée cellulaire de cancer de la prostate humain PC-3M, se déplacent vers le anodique pôle (+) 15, 16. Plusieurs mécanismes sont proposés à médiation galvanotaxie ou pour expliquer la capacité des cellules à détecter le champ électrique, y compris l&#39;activation récepteurs de l&#39;EGF 12, le canal sodique épithélial 17, PI3K et PTEN 18, et la libération des ions calcium 15, 19. Le mécanisme ne est pas encore entièrement compris et il est possible que de multiples voies de signalisation sont impliqués dans galvanotaxie. Procédé de galvanotaxie deux dimensions nous démontrons ici est utile pour caractériser la migration directionnelle de adhérente, cellules mobiles, que ce soit pour surveiller la migration individuelle des cellules 10, 12, 17 ou la migration d&#39;une feuille de cellules confluentes 18, 20. Cette technique est modifiée à partir de Peng et Jaffe 21 et Nishimura et al., avec 10 chambres de PVC transparent sur ​​mesure, avec coversl amovibleips permettant l&#39;extraction de cellules facile après galvanotaxie pour analyse secondaire, telles que l&#39;imagerie immuno-fluorescence. La surface de verre des chambres de galvanotaxie est optique compatible, ce qui permet le tournage à fort grossissement et avec des cellules marquées par fluorescence. Il permet également la conception expérimentale avec modification de la surface du verre, par exemple modifier le revêtement ou la surface des charges. Entretoise en une lamelle n ° sont utilisés dans les chambres afin de minimiser le flux de courant dans les cellules; par conséquent, le chauffage par effet Joule, qui est proportionnelle au carré du flux de courant, ne serait pas surchauffer les cellules pendant l&#39;expérience. Les ponts de liaison de gélose empêchent le contact direct des électrodes avec les cellules et empêchent le changement de pH du milieu ou de la concentration d&#39;ions pendant galvanotaxie. Deux lignes non-tumorigènes cellulaires prostate humaine ont été examinés pour leur réponse galvanotaxie dans cette étude. Les PRNS-1-1 22 et 23 sont à la fois PNT2 SV40 à immortalisation, les lignées cellulaires dépendantes de facteurs de croissance exprimant des marqueurs épithéliaux cytokératine 5, 8, 18 et 19 avec peu ou pas d&#39;expression de l&#39;antigène spécifique de la prostate (PSA). Les deux lignées cellulaires conservent la morphologie polygonale de cellules épithéliales normales, mais anomalie chromosomique a été observée dans le caryotype 22, 24. Bien que PRN-1-1 et PNT2 part des comportements similaires dans la plupart des expériences, elles montrent des différences dans la formation de la structure et dans acineuses galvanotaxie. Sur une matrice 3-D, Matrigel, les cellules PRN-1-1 former des structures creuses avec des lumières acineuses ressemblant à la glande prostatique normale 25 tissu. Cependant, les cellules forment des sphéroïdes solides PNT2 sans une lumière polarisée ou 26 épithélium. Les cellules PRN-1-1 démontrent également une réponse plus élevée que la galvanotactic PNT2 dans la présente étude. La corrélation entre la formation de la structure acinaire et galvanotaxie dans PRNS-1-1 suggère que les signaux galvanotactic peuvent jouer un rôle dans l&#39;organisation de la prles mouvements des tissus de la glande ostate en réponse à des champs électriques endogènes et fournit d&#39;autres caractéristiques de discriminer entre ces deux lignées cellulaires.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Cells</td></tr><tr><td>pRNS-1-1 prostate cells</td><td></td><td></td><td>Lee, et al. (1994)</td></tr><tr><td>PNT2</td><td>prostate cells Sigma-Aldrich</td><td>95012613-1VL</td><td>Berthon, et al. (1995)</td></tr><tr><td colspan="4">Medium and solutions</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td>préchauffage jusqu’à 37 &deg ; C avant utilisation</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin - Premium</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>10 % en PBS, chauffer jusqu’à 37 &deg ; C avant utilisation</td></tr><tr><td>Antibiotique-Antimycosique (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>15240</td><td>ajouter 5 ml à 500 ml</td></tr> de <tr><td>2-propanol</td><td>moyen VWR</td><td>BDH1133-5GL</td><td></td></tr><tr><td>PBS-</td><td></td><td>-</td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO<>4 et 1,5 mM KH2PO4 dans 1 000 ml de H2 O, pH à 7,4 et autoclave, réchauffement à 37 &deg ; C avant utilisation</td></tr><tr><td>0,25 % Trypsine-EDTA&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td>préchauffage jusqu’à 37 &deg ; C avant utilisation, traiter les cellules pendant 3 à 5 min à 37 &deg ; C</td></tr><tr><td colspan="4">Galvanotaxis device</td></tr><tr><td>Galvanotaxis chambers</td><td>Precision Plastics Inc, CA</td><td></td><td>Chambres en PVC transparent et non toxiques (1/4 » x 2 ») conçues sur mesure. Veuillez contacter les auteurs pour les spécifications techniques.</td></tr><tr><td>Électrodes Galvanotaxis</td><td>UCD electric shop</td><td></td><td>Électrodes spiralées en platine avec cordons flexibles</td></tr><tr><td>Boîtier d’alimentation Galvanotaxis</td><td>Substrate Engineering, CA</td><td></td><td>Sortie d’alimentation DC conçue sur mesure avec voltmètre</td></tr><tr><td>Verre de protection de microscope, grand, 45 x 50 mm, n° 1.5</td><td>Fisher</td><td>12-544-F</td><td></td></tr><tr><td>Verre de protection de microscope, petit, 25 x 25 mm, n° 1</td><td>ThermoScientific</td><td>3307</td><td></td></tr><tr><td>Marqueur à pointe de diamant</td><td>ThermoScientific</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>Scelleuse silicone de qualité marine, transparent</td><td>3M</td><td>051135-08019</td><td></td></tr><tr><td>Graisse sous vide poussé</td><td>Dow Corning</td><td>2021846-0807</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 6 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-561-64</td><td></td></tr><tr><td>Seringue Nichiryo, 1,5 ml</td><td>Applicateurs en coton Nichiryo</td><td>SG-M</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Produits Médicaux Purtian</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Qtips</td><td>Johnson & Tube en PVC Johnson</td><td>729389</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 180</td><td>Nalgene</td><td>8000-9030</td><td>503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall</td></tr><tr><td>Bacto-Agar</td><td>Difco</td><td>0140-01</td><td>make 2 % agar</td></tr><tr><td>solution Razor Blade</td><td>Personna</td><td>74-0001</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipements et logiciels</td></tr><tr><td>Centrifugeuse de paillasse</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>fonctionnant avec un rotor A-4-62</td></tr><tr><td>Cellomètre Auto T4</td><td>Nexcelom</td><td>Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>Cellomètre chambres de comptage</td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-SD100-002</td><td>charge 20 &#956 ; l solutions cellulaires pour compter</td></tr><tr><td>la plaque de réchauffement de la température de culture</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>370150000</td><td>pour maintenir les chambres de galvanatoxie à 37 &deg ; C&nbsp ;</td></tr><tr><td>Microscope Eclipse TE-2000 avec platine motorisée et chambre environnementale</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Fluor 10X/0.30 objectif len</td><td>Caméra</td> CCD Nikon <td></td><td></td></tr><tr><td>Retiga EX&nbsp ;</td><td>Qimaging</td><td></td><td>Caméra CCD refroidie, monocolore, 12 bits</td></tr><tr><td>Air comprimé avec 5 % de CO2</td><td>Airgas</td><td></td><td>commande spéciale</td></tr><tr><td>Volocity 6.3</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Logiciel d’acquisition d’images</td></tr><tr><td>Improvision OpenLab 5.5.2</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Logiciel de suivi des cellules et personnalisé pour mesurer les angles de migration</td></tr><tr><td>FileMaker Pro Advanced, 8.0</td><td>FileMaker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2008 pour Mac</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

utilisant conçus sur mesure galvanotaxie chambers à étudier directionnel migration des cellules de la prostate

Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells

Le champ électrique physiologique sert des fonctions biologiques spécifiques, telles que diriger la migration des cellules dans le développement embryonnaire, l&#39;excroissance neuronale et la cicatrisation epitheliale. L&#39;application d&#39;un champ électrique à courant continu à des cellules cultivées in vitro induit la migration des cellules directionnel, ou galvanotaxie. Procédé de galvanotaxie deux dimensions nous démontrons ici est modifiée avec sur mesure poly (chlorure de vinyle) (PVC) chambres, la surface de verre, des électrodes en platine et l&#39;utilisation d&#39;une platine motorisée à laquelle les cellules sont imagés. Les chambres de PVC et des électrodes de platine présentent une faible cytotoxicité et sont abordables et ré-utilisable. La surface du verre et la platine du microscope motorisée améliorer la qualité des images et permettent d&#39;éventuelles modifications de la surface du verre et des traitements aux cellules. Nous avons filmé l&#39;galvanotaxie de deux, les lignées cellulaires non-tumorigènes SV40 immortalisé la prostate, PRNS-1-1 et PNT2. Ces deux lignées cellulaires montrent des vitesses de migration à la fois similaires et migrent versla cathode, mais ils montrent un degré différent de directivité dans galvanotaxie. Les résultats obtenus par l&#39;intermédiaire de ce protocole suggérer que les PRNS-1-1 et les lignées cellulaires PNT2 peuvent avoir des caractéristiques intrinsèques qui régissent leurs réponses migrateurs directionnelles.

Deux lignes de cellules de la prostate (PRN-1-1 et PNT2) ont été étudiés avec cette méthode. Les cellules dans les deux lignes migrent à des vitesses similaires de 1,0 +/- 0,3 microns / min au cours de 2 heures (figure 5A). Cependant, la directivité du champ électrique est de 0,7 +/- 0,3-PRN pour la ligne 1-1, et 0,2 +/- 0,8 pour la ligne de PNT2 (figure 5B). Les résultats montrent une différence significative dans la galvanotaxie de ces deux lignées cellulaires (p &lt;0,01, les cellule...

Nous présentons une méthode pour appliquer un champ électrique physiologique à des cellules prostatiques migratrices et immortalisées dans une chambre de galvanotaxie sur mesure. En utilisant cette méthode, nous démontrons que 2 lignées de cellules prostatiques non tumorigènes présentent différents degrés de directionnalité de migration sur le terrain.

Utilisant conçus sur mesure galvanotaxie Chambers à étudier directionnel migration des cellules de la prostate

The physiological electric field serves specific biological functions, such as directing cell migration in embryo development, neuronal outgrowth and ...

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer Galvan Axxis, un test permettant d’évaluer la migration directionnelle des cellules dans un champ électrique appliqué. Pour ce faire, il faut d’abord assembler puis ensemencer une chambre Galvan axxis avec les cellules d’intérêt. Dans un deuxième temps, la chambre est scellée et un champ électrique est appliqué pour l’imagerie en accéléré.Dans la dernière étape, la vitesse de migration des cellules individuelles et l’angle par rapport au champ électrique sont suivis. En fin de compte, cosigner. Le peut être utilisé pour montrer comment les cellules réagissent au champ électrique et si elles migrent dans le sens de la cathode.Le principal avantage de cette technique est la facilité de récupération des cellules après le Texas donné pour l’analyse secondaire et la facilité avec laquelle la migration peut être filmée à fort grossissement et avec des cellules marquées par fluorescence. La visualisation de cette méthode est essentielle car les étapes d’assemblage d’une chambre sont difficiles à apprendre sans démonstration pour assembler les chambres inférieures. Commencez par essuyer une chambre en plastique galvan axxis avec deux propanol.Ensuite, à l’aide d’une seringue, appliquez un scellant en silicone de qualité marine autour des ouvertures circulaires sur la face inférieure de la chambre. Disposez un grand verre de protection sur le scellant et pressez-le en place avec l’extrémité d’un applicateur de coton, en essuyant l’excès de colle avec le coton-tige. Ensuite, utilisez un marqueur à pointe de diamant pour couper un petit verre de protection pour faire des espaces de six par 25 millimètres et retournez la chambre.Ensuite, à l’aide d’une seringue, appliquez deux bandes de silicone, créant une surface de canal de 10 x 25 millimètres pour la fixation des cellules entre les deux ouvertures circulaires du verre inférieur. Collez ensuite deux espaces vitrés entre les ouvertures circulaires, en enfonçant les espaces avec un applicateur en coton neuf et en essuyant l’excédent de colle comme nous venons de le démontrer. Essayez la chambre pendant 24 heures jusqu’à ce que la colle silicone soit durcie.Le lendemain, trempez la chambre dans de l’eau distillée pendant la nuit pour éliminer les résidus d’acide acétique de la colle avant d’ensemencer les cellules dans la chambre. Séchez et essuyez les chambres avec deux propanol comme je viens de le démontrer. Lavez-les avec du PB S3 stérile plusieurs fois, puis vérifiez l’écoulement du liquide entre les deux ouvertures circulaires dans les chambres.Après avoir vérifié que les chambres sont en bon état de fonctionnement, enfermez-les dans des boîtes de culture stériles et placez les chambres à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Pendant que les chambres s’équilibrent, détachez les cellules de la prostate de leur boîte de culture avec cinq millilitres de trypsine EDTA à 37 degrés Celsius. Après cinq minutes, neutralisez la réaction avec cinq millilitres de 10 % FBS.Dans le PBS, transférez les cellules détachées dans des tubes de 15 millilitres, puis centrifugez pendant cinq minutes. À 200 fois, G, aspirez le fluide puis remettez le granulé en suspension dans un millilitre de milieu. Ensuite, après avoir compté les cellules, ajustez la concentration cellulaire à huit par 10 à quatre cellules par millilitre avec du milieu de culture et des graines.350 microlitres de suspension cellulaire sur chaque chambre. Incuber les cellules dans la chambre pendant la nuit dans une boîte de culture avec une lingette humide Kim à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, commencez l’assemblage des chambres supérieures en réchauffant d’abord 10 millilitres de culture, à 37 degrés Celsius pour chaque chambre AXS.Pendant que le milieu se réchauffe, transférez une chambre Galvan axxis de l’incubateur sur une plaque chauffante à 37 degrés Celsius et rincez la chambre avec un milieu de culture. Pour retirer les cellules non attachées, laissez 400 microlitres de fluide dans la chambre, puis utilisez une seringue pour appliquer de la graisse sous vide poussé sur les deux espaces vitrés. Scellez la chambre avec un verre de couverture et un applicateur en coton, puis séchez la surface en verre.Ensuite, appliquez la graisse sous vide poussé avec une seringue pour sceller l’espace entre le verre de protection et la chambre. Et puis ajoutez le milieu de culture dans les réservoirs internes. Éliminez les bulles et vérifiez l’écoulement du liquide entre les réservoirs.Pour faire les ponts d’agar, coupez une paire de tubes en PVC de deux pouces, retournez-les, puis placez les morceaux dans un bécher de 100 millilitres. Ensuite, ajoutez 200 milligrammes de gélose aux orteils dans un flacon de 50 millilitres avec 10 millilitres de milieu de culture pour obtenir un gel de gélose à 2 %. Après avoir passé au micro-ondes pendant 30 secondes, utilisez une pipette de transfert pour charger le gel de gélose dans le tube en plastique et laissez les ponts de gélose à température ambiante pendant 10 minutes pour solidifier la gélose.Ajoutez ensuite deux millilitres de milieu de culture dans les réservoirs extérieurs de la chambre gal, et insérez les ponts de gélose dans les réservoirs de milieu intérieur et extérieur pour conduire le courant afin d’effectuer une imagerie en accéléré de la migration. Commencez par transférer la chambre Galvan dans une chambre environnementale à 37 degrés Celsius sur la platine du microscope, en fixant la chambre avec du ruban adhésif et en vous concentrant sur les cellules sous un objectif 10x. Ensuite, insérez les électrodes Galvan Axxis dans les réservoirs extérieurs avec la cathode sur le côté droit, en fixant le fil et les électrodes avec du ruban adhésif.Ensuite, allumez le boîtier d’alimentation pour appliquer un champ électrique à la chambre et utilisez un voltmètre pour mesurer la tension de sortie à travers la chambre afin d’atteindre 2,5 volts pour la chambre de 25 millimètres de long. Sélectionnez maintenant 10 points à travers la chambre pour générer 10 films en accéléré, et réglez les conditions d’acquisition sur des intervalles de 10 minutes pendant deux heures. Ensuite, commencez à filmer et ajustez le courant de sortie si nécessaire pour maintenir l’intensité du champ pendant l’expérience.À la fin de l’expérience, retirez la chambre de la scène et fixez les cellules dans de l’alcool à 95 %. Ouvrez ensuite la chambre. Le bordereau de couverture peut être conservé pour plus tard.Coloration et imagerie. Nettoyez la chambre pour les années à venir. Pour quantifier l’Axxis de Galvan, faites pivoter les films en accéléré pour orienter la cathode vers le haut des images.Exportez les films vers le logiciel de suivi des cellules et suivez manuellement la position XY de 10 à 20 cellules à chaque point temporel de chaque film, les distances de migration et les angles par rapport à la direction nord-sud, la même orientation du champ électrique sera calculée dans le logiciel de suivi des cellules. Enfin, enregistrez les mesures et importez les données dans une application de base de données pour calculer les résultats combinés. Dans cette expérience représentative de Galvan Axxis, on a déterminé que des lignées de cellules de la prostate migraient à des vitesses similaires sur une période de deux heures.Cependant, la directionnalité du champ électrique était de 0,7 plus moins 0,3 pour le PRNS une ligne, et de 0,2 plus moins 0,8 pour le PNT deux lignes, indiquant une différence significative dans l’axe de Galvan de ces deux lignées cellulaires, suggérant que leurs mécanismes de signalisation cellulaire dirigent les réponses de migration différentielle au champ électrique Après le développement de la méthode Govan Texas. Cette technique aide les chercheurs à explorer les mécanismes de migration directionnelle des cellules dans le champ électrique.

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