Utilisant conçus sur mesure galvanotaxie Chambers à étudier directionnel migration des cellules de la prostate

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer Galvan Axxis, un test permettant d’évaluer la migration directionnelle des cellules dans un champ électrique appliqué. Pour ce faire, il faut d’abord assembler puis ensemencer une chambre Galvan axxis avec les cellules d’intérêt. Dans un deuxième temps, la chambre est scellée et un champ électrique est appliqué pour l’imagerie en accéléré.

Dans la dernière étape, la vitesse de migration des cellules individuelles et l’angle par rapport au champ électrique sont suivis. En fin de compte, cosigner. Le peut être utilisé pour montrer comment les cellules réagissent au champ électrique et si elles migrent dans le sens de la cathode.

Le principal avantage de cette technique est la facilité de récupération des cellules après le Texas donné pour l’analyse secondaire et la facilité avec laquelle la migration peut être filmée à fort grossissement et avec des cellules marquées par fluorescence. La visualisation de cette méthode est essentielle car les étapes d’assemblage d’une chambre sont difficiles à apprendre sans démonstration pour assembler les chambres inférieures. Commencez par essuyer une chambre en plastique galvan axxis avec deux propanol.

Ensuite, à l’aide d’une seringue, appliquez un scellant en silicone de qualité marine autour des ouvertures circulaires sur la face inférieure de la chambre. Disposez un grand verre de protection sur le scellant et pressez-le en place avec l’extrémité d’un applicateur de coton, en essuyant l’excès de colle avec le coton-tige. Ensuite, utilisez un marqueur à pointe de diamant pour couper un petit verre de protection pour faire des espaces de six par 25 millimètres et retournez la chambre.

Ensuite, à l’aide d’une seringue, appliquez deux bandes de silicone, créant une surface de canal de 10 x 25 millimètres pour la fixation des cellules entre les deux ouvertures circulaires du verre inférieur. Collez ensuite deux espaces vitrés entre les ouvertures circulaires, en enfonçant les espaces avec un applicateur en coton neuf et en essuyant l’excédent de colle comme nous venons de le démontrer. Essayez la chambre pendant 24 heures jusqu’à ce que la colle silicone soit durcie.

Le lendemain, trempez la chambre dans de l’eau distillée pendant la nuit pour éliminer les résidus d’acide acétique de la colle avant d’ensemencer les cellules dans la chambre. Séchez et essuyez les chambres avec deux propanol comme je viens de le démontrer. Lavez-les avec du PB S3 stérile plusieurs fois, puis vérifiez l’écoulement du liquide entre les deux ouvertures circulaires dans les chambres.

Après avoir vérifié que les chambres sont en bon état de fonctionnement, enfermez-les dans des boîtes de culture stériles et placez les chambres à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Pendant que les chambres s’équilibrent, détachez les cellules de la prostate de leur boîte de culture avec cinq millilitres de trypsine EDTA à 37 degrés Celsius. Après cinq minutes, neutralisez la réaction avec cinq millilitres de 10 % FBS.

Dans le PBS, transférez les cellules détachées dans des tubes de 15 millilitres, puis centrifugez pendant cinq minutes. À 200 fois, G, aspirez le fluide puis remettez le granulé en suspension dans un millilitre de milieu. Ensuite, après avoir compté les cellules, ajustez la concentration cellulaire à huit par 10 à quatre cellules par millilitre avec du milieu de culture et des graines.

350 microlitres de suspension cellulaire sur chaque chambre. Incuber les cellules dans la chambre pendant la nuit dans une boîte de culture avec une lingette humide Kim à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, commencez l’assemblage des chambres supérieures en réchauffant d’abord 10 millilitres de culture, à 37 degrés Celsius pour chaque chambre AXS.

Pendant que le milieu se réchauffe, transférez une chambre Galvan axxis de l’incubateur sur une plaque chauffante à 37 degrés Celsius et rincez la chambre avec un milieu de culture. Pour retirer les cellules non attachées, laissez 400 microlitres de fluide dans la chambre, puis utilisez une seringue pour appliquer de la graisse sous vide poussé sur les deux espaces vitrés. Scellez la chambre avec un verre de couverture et un applicateur en coton, puis séchez la surface en verre.

Ensuite, appliquez la graisse sous vide poussé avec une seringue pour sceller l’espace entre le verre de protection et la chambre. Et puis ajoutez le milieu de culture dans les réservoirs internes. Éliminez les bulles et vérifiez l’écoulement du liquide entre les réservoirs.

Pour faire les ponts d’agar, coupez une paire de tubes en PVC de deux pouces, retournez-les, puis placez les morceaux dans un bécher de 100 millilitres. Ensuite, ajoutez 200 milligrammes de gélose aux orteils dans un flacon de 50 millilitres avec 10 millilitres de milieu de culture pour obtenir un gel de gélose à 2 %. Après avoir passé au micro-ondes pendant 30 secondes, utilisez une pipette de transfert pour charger le gel de gélose dans le tube en plastique et laissez les ponts de gélose à température ambiante pendant 10 minutes pour solidifier la gélose.

Ajoutez ensuite deux millilitres de milieu de culture dans les réservoirs extérieurs de la chambre gal, et insérez les ponts de gélose dans les réservoirs de milieu intérieur et extérieur pour conduire le courant afin d’effectuer une imagerie en accéléré de la migration. Commencez par transférer la chambre Galvan dans une chambre environnementale à 37 degrés Celsius sur la platine du microscope, en fixant la chambre avec du ruban adhésif et en vous concentrant sur les cellules sous un objectif 10x. Ensuite, insérez les électrodes Galvan Axxis dans les réservoirs extérieurs avec la cathode sur le côté droit, en fixant le fil et les électrodes avec du ruban adhésif.

Ensuite, allumez le boîtier d’alimentation pour appliquer un champ électrique à la chambre et utilisez un voltmètre pour mesurer la tension de sortie à travers la chambre afin d’atteindre 2,5 volts pour la chambre de 25 millimètres de long. Sélectionnez maintenant 10 points à travers la chambre pour générer 10 films en accéléré, et réglez les conditions d’acquisition sur des intervalles de 10 minutes pendant deux heures. Ensuite, commencez à filmer et ajustez le courant de sortie si nécessaire pour maintenir l’intensité du champ pendant l’expérience.

À la fin de l’expérience, retirez la chambre de la scène et fixez les cellules dans de l’alcool à 95 %. Ouvrez ensuite la chambre. Le bordereau de couverture peut être conservé pour plus tard.

Coloration et imagerie. Nettoyez la chambre pour les années à venir. Pour quantifier l’Axxis de Galvan, faites pivoter les films en accéléré pour orienter la cathode vers le haut des images.

Exportez les films vers le logiciel de suivi des cellules et suivez manuellement la position XY de 10 à 20 cellules à chaque point temporel de chaque film, les distances de migration et les angles par rapport à la direction nord-sud, la même orientation du champ électrique sera calculée dans le logiciel de suivi des cellules. Enfin, enregistrez les mesures et importez les données dans une application de base de données pour calculer les résultats combinés. Dans cette expérience représentative de Galvan Axxis, on a déterminé que des lignées de cellules de la prostate migraient à des vitesses similaires sur une période de deux heures.

Cependant, la directionnalité du champ électrique était de 0,7 plus moins 0,3 pour le PRNS une ligne, et de 0,2 plus moins 0,8 pour le PNT deux lignes, indiquant une différence significative dans l’axe de Galvan de ces deux lignées cellulaires, suggérant que leurs mécanismes de signalisation cellulaire dirigent les réponses de migration différentielle au champ électrique Après le développement de la méthode Govan Texas. Cette technique aide les chercheurs à explorer les mécanismes de migration directionnelle des cellules dans le champ électrique.