Croissance dosage à base de Reporter-une analyse systématique de la dégradation des protéines

L’objectif global de cette procédure est de déterminer les variations des taux de dégradation des protéines de manière systématique en les couplant à la cinétique de croissance de la levure en culture liquide. Ceci est accompli par la première croissance de cellules exprimant une protéine rapporteure composée d’un signal de dégradation couplé à un marqueur métabolique pendant la nuit jusqu’à la phase stationnaire dans un milieu sélectif approprié. Ensuite, la densité optique des cellules est mesurée pour déterminer la cinétique de croissance des cellules, puis le temps de doublement minimal des cellules pendant la phase logarithmique est calculé à partir de la cinétique de croissance à l’aide d’un logiciel désigné.

En fin de compte, le temps de doublement minimal calculé peut être utilisé pour définir les variations de la cinétique de dégradation des protéines. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les tests de dégradation du cyclamate ou de la poursuite d’impulsions ont ajouté que notre technique est simple à mettre en place. L’acquisition et l’analyse des données sont simples, et la conception de l’essai est extrêmement modulaire.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la dégradation des pots, telles que les éléments nécessaires à la reconnaissance des pots mal pliés par le système de pots d’ubiquitine. J’ai d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque j’ai voulu faire un criblage pour identifier les protéines impliquant l’élimination de l’ubiquitine de leur sous-ensemble. J’ai donc établi un moyen simple de comparer plusieurs échantillons pour préparer les cellules à l’analyse.

Commencez par transformer les cellules de levure atrophique d’œuf appropriées, telles que TRY 4 67, avec un plasmide contenant une fusion U trois Deron et un marqueur métabolique supplémentaire pour la sélection et l’entretien du plasmide. Pour la sélection et l’entretien des plasmides, cultivez les cellules sur des plaques de gélose sous un milieu synthétique défini approprié, sans marqueurs de sélection d’acides aminés, transférez les colonies survivantes dans des patchs, transférez les cellules des patchs dans un milieu liquide et incubez pendant la nuit à 30 degrés Celsius jusqu’à ce qu’une phase stationnaire soit atteinte. Ensuite, pour 15 échantillons ou moins, diluez 50 microlitres de cellules de la culture de nuit avec 150 microlitres de milieu synthétique défini par puits.

Dans une plaque à fond transparent à 96 puits, utilisez un lecteur de microplaques pour déterminer les valeurs OD 600 des échantillons. Ensuite, après avoir calculé le volume exact nécessaire pour obtenir des cellules de levure à une quantité équivalente à une DO 600 de 0,25, faites tourner les cellules pendant une minute à 12 000 fois G et à température ambiante, remettez les cellules en suspension dans un millilitre du milieu sélectif approprié pour obtenir une DO 600 de 0,25 et transférez 200 microlitres de la souche diluée dans un puits d’une nouvelle plaque à 96 puits lorsqu’elle est supérieure à 15 Des échantillons doivent être analysés. Transférez 10 microlitres de cellules stationnaires cultivées pendant la nuit dans un puits d’une nouvelle plaque de 96 puits contenant 190 microlitres de milieu sélectif approprié pour mesurer la cinétique de croissance des cellules de levure transformées dans des conditions sélectives.

Ensuite, réglez un lecteur de microplaques multimode sur une température d’incubation de 30 degrés Celsius, des intervalles de mesure OD 600 de 15 minutes et des cycles d’agitation orbitale et linéaire d’une minute toutes les sept minutes. Ensuite, incubez les cellules à 30 degrés Celsius dans le lecteur de microplaques pendant 12 à 24 heures. Lorsque les cellules ont atteint la phase stationnaire, exportez les données brutes dans un fichier tableur pour déterminer la cinétique de croissance de la levure à l’aide de MDT Calc.

Assurez-vous que le fichier de la feuille de calcul contenant les données de croissance est enregistré et fermé. Ouvrez ensuite le programme d’application MDT Calc sous le chemin du fichier. Cliquez sur le rectangle pour localiser le fichier de la feuille de calcul sous le nom de la feuille.

Entrez le nom de la feuille de calcul où se trouvent les données brutes sous la position de départ. Entrez la coordonnée temporelle de la feuille de calcul, zéro du premier échantillon sous la colonne de temps. Entrez la lettre définissant l’emplacement de la colonne de point temporel en secondes sous colonne vide, entrez la lettre définissant l’emplacement de la colonne vide.

Par exemple, le puits A de la plaque à 96 puits. Prochain. Sous Valeur OD, choisissez la valeur OD 600 transformée minimale requise pour le lancement du calcul MDT. Généralement de 0,15 à 0,25 pour s’assurer que le MDT n’est calculé que pour les échantillons qui atteignent la valeur D 600 définie ou supérieure.

Une fois la dernière valeur saisie, cliquez sur le bouton calculer et vérifiez que la barre de progression à droite passe progressivement au vert. Enfin, exportez les deux ensembles de données qui apparaissent automatiquement à l’écran à la fin du calcul MDT dans une nouvelle feuille de calcul. Vérifiez que les données incluent la valeur MDT pour chaque puits qui réussit le test de valeur OD minimale et l’heure de début de l’intervalle à partir duquel MDT a été calculé dans cette expérience représentative.

Les différences relatives dans la cinétique de dégradation des protéines entre le type sauvage et diverses souches mutantes ont été comparées : d’abord les cellules sauvages de type U, BBC six, delta, UBC sept, delta ou DOA 10 delta exprimant D, un, VMAU, trois, ont été cultivées sur un milieu complet défini synthétique. Ensuite, pour mesurer les branchies, les cellules ont été lavées et incubées dans des milieux synthétiques définis. Des courbes de croissance similaires à l’uracile moins et la MDT calculée ont été observées pour toutes les souches cultivées dans un milieu complet défini synthétique, excluant la possibilité que la délétion de l’un des gènes examinés affecte la croissance cellulaire.

En revanche, l’incubation dans des milieux synthétiques définis sans uracile a entraîné une faible croissance des cellules de type sauvage, alors que seul un défaut de croissance mineur a été observé dans les souches mutantes. UBC sept est absolument nécessaire pour la dégradation de DEG un VMAU trois, permettant une évaluation précise des effets même partiels de divers mutants E deux. En conséquence, une cinétique de croissance rapide est observée dans les cellules exprimant UBC sept avec les mutants du site actif, C 89 s et N 81 A.In de plus, deux mutants dont on a prédit qu’ils entravent indirectement la dégradation de DEG un VMA ETH trois V 20 5G et H 90 4K ont également amélioré la croissance cellulaire par rapport au type sauvage UBC sept, bien qu’à un degré moindre que les mutants du site actif.

Ainsi, la méthode des branchies peut être utilisée pour mesurer avec précision la contribution relative de divers facteurs de dégradation à la stabilité d’un substrat rapporteur. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que le protocole est sensible aux petites différences dans les taux de dégradation des protéines. C’est un avantage, mais cela signifie également qu’il faut être prudent dans la conception et la vérification du Deron à utiliser en suivant cette procédure.

D’autres méthodes, comme la microscopie à fluorescence à haut débit, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que la propension à l’agrégation des protéines rapporteures. Pour cette raison, c’est une bonne idée d’inclure également une balise GFP dans le rapporteur. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de déterminer les changements dans le taux de dégradation des protéines de manière systématique à l’aide d’un lecteur de MICROPLAQUES et de notre logiciel désigné.