Name: Identification par radiofréquence et vidéo Motion-sensible efficacement Automatiser enregistrement de récompense Choix Comportement par les bourdons (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Découvrez l'automatisation de l'observation du comportement de choix des bourdons à l'aide de RFID et de vidéo sensible au mouvement. Cette méthode permet d'étudier la pollinisation et les différences individuelles avec une grande précision.

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Les expériences ont été financées par une subvention du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada au CMSP. Nous remercions Koppert Canada pour ses dons de colonies de bourdons. Des parties de ce manuscrit, y compris certaines figures et tableaux, ont été publiées dans Naturwissenschaften11, et reproduites ici avec la permission de Springer.

Le Comité de l'Université d'Ottawa de protection des animaux a approuvé notre protocole expérimental, qui définit les procédures de sécurité pour le personnel travaillant avec des abeilles. 1. Environnement essais Préparation <ol><li> Préparer un espace vide (chambre isolée, ou écran métallique recouverte cage de vol) de 2 mx 2 mx 2 m. REMARQUE: Si la pièce est choisie comme espace de test, assurez-vous que les abeilles ne peuvent pas échapper à travers les fenêtres, les espaces sous les portes, et les conduits d'échange d'air. </li><li> Ajouter des points d'entrée (par exemple, les petits trous cm de diamètre environ. 2) pour le vol cage où les abeilles peuvent entrer et sortir de l'espace de test sans obstruction. Concevoir un mécanisme pour bloquer les points d'accès de garder les abeilles hors de l'espace de test pendant les périodes réservées à la maintenance et la configuration des équipements. NOTE: Nous avons utilisé Bombus impatiens Cresson travailleurs. </li><li> Connectez un ou deux boîtes de colonie de l'espace-test en utilisant un connecteur. Assurez-vous que une abeille morte ne peut pas block connecteur. NOTE: Ici, utiliser deux types de structures de connexion: un "pont" structure en bois avec un couvercle en verre haut, et un tube en treillis métallique. Ils sont faciles à nettoyer et ils fournissent la traction pour les abeilles. </li><li> Placez deux détenteurs de fleurs artificielles à l'intérieur de l'espace de test. <ol><li> De placer les titulaires de fleurs dans le centre de l'espace de test, ou les attacher à la paroi. </li><li> Connectez un "tête 2k6" lecteur RFID pour le haut de la partie cylindrique de la fleur artificielle en utilisant du ruban adhésif (voir la figure 1 pour le positionnement). Utilisez un support en bois de 1,2 m de hauteur à laquelle attacher fleurs artificielles. REMARQUE: Le haut de la tribune devrait figurer un mécanisme de fixation où les fleurs artificielles peuvent être connectés. Voir la Figure 2 pour un dessin schématique </li></ol></li><li> Ajouter à haute fréquence (min. 200 Hz) appareils d'éclairage fluorescent à la lumière de manière adéquate l'espace d'essai. Utilisation d'un ballast électronique à haute fréquence pour faire en sorte que light scintillement est au-dessus de scintillement visuel seuil de fusion de 6 bourdons. NOTE: Ici, utiliser 12 ampoules fluorescentes lumière du jour qui produisent environ 1.200 intensité lumineuse Lux pour un espace de 2 x 2 x 2 m. </li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52033/52033fig1highres.jpg"> Figure 1. RFID Design Fleur artificielle. Diagramme schématique de la fleur artificielle RFID utilisé dans l'expérience 1. Le lecteur RFID reposait sur ​​le dessus du cylindre ouvert à travers le centre de la fleur. Modèles stimuli et positions: a. périphérique concentrique, b. central concentrique, c. périphérique radiale et d. central radial. Ce chiffre a été modifié depuis Orbán et al. 11. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52033/52033fig2highres.jpg"> <strong figure stimulation pr un sch montrant la conception du stand fleur de relance artificielle et le clip fixation. fixation est coll utilis pour fixer rapidement d les stimuli des stands stimuli. cette configuration a dans l vid mouvement. href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52033/52033fig2highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 2. Bumblebee Colony Préparation <ol><li> À l'arrivée des colonies commandés commerce, connectez la boîte de colonie à la cage de vol. </li><li> Fournir pollen (recueilli par les abeilles à partir d'une variété de plantes) et le sucre dans l'eau (1: 1 en volume) ad libitum jusqu'à ce que le début des séances d'essais. <ol><li> Faire bouillir 1 litre d'eau, et mélanger dans le même volume de sucre pour créer la solution d'eau sucrée. </li><li> Achetez pollen d'un apiculteur ou la comfournisseur commercial de colonies de bourdons. Moudre le pollen avec un mortier et un pilon, et mélanger avec du miel et de l'eau (au besoin) pour en faire une pâte humide. </li></ol></li><li> Une fois l'expérience commence, fournir de 15 à 40 ml d'eau sucrée (quantité proportionnelle à la taille des colonies) par jour. Continuer à fournir pollen ad libitum. Adapter la quantité de sucre dans l'eau en fonction des niveaux de stockage dans les pots de miel. NOTE: Garder les niveaux de stockage des aliments à faible incite les travailleurs à quitter le nid pour chercher plus de nourriture. </li><li> Autoriser les abeilles d'entrer dans l'environnement de test via la structure de connecteur, comme décrit dans l'étape 1.3. NOTE: Les abeilles se déplacent librement entre le nid et l'environnement de test tout au long de l'expérience. </li></ol> 3. Préparation pour l'observation par Radio-Frequency Identification <ol><li> Commencer par coller des étiquettes RFID sur le thorax des travailleurs dès que la colonie arrive, et continuer tout au long de l'expérience, en tant que nouveau travailERS émergent. </li><li> Technique de collage <ol><li> Placez tous les travailleurs dans des récipients individuels pendant le marquage initial. Travailleurs refroidir pendant environ 1 heure au réfrigérateur (environ 7 ° C) pour les ralentir. REMARQUE: Refroidissement travailleurs à l'avance de l'étiquetage contribue à rendre colonies agressives plus gérable. Cela réduit le risque de piqûres. </li><li> En utilisant l'appareil de marquage et d'une colle non toxique (fourni par le fournisseur de balise), fixez l'étiquette RFID sur le thorax du travailleur. Les étiquettes RFID colle aux travailleurs tels qu'ils ressortent, alors qu'ils sont encore au stade de novice (avant qu'ils ne soient capables de voler). </li><li> Attendez un minimum de 10 minutes avant de placer le travailleur retour dans la colonie pour assurer l'étiquette RFID ne peut être enlevé par le travailleur. </li></ol></li><li> Éliminer des travailleurs qui ne sont pas marqués au cours de leur stade de novice, ou des travailleurs qui ont perdu leurs étiquettes RFID (comme on le voit par les résidus de colle ou de calvitie sur le thorax). NOTE: Ces abeilles peuvent avoir eu l'expérience outside la colonie. </li><li> Logiciel Lecteur RFID <ol><li> Utilisez un ordinateur personnel (PC) pour configurer le logiciel de lecteur RFID. Changer le format de la date du système d'exploitation à hh aaaa-mm-jj: mm: ss pour assurer que les données RFID téléchargés sont correctement encodés. Régler le programme fourni avec les lecteurs RFID en utilisant le langage de programmation C ++ pour permettre l'exportation des données sur le lecteur RFID Comma Separated Values ​​(CSV). </li><li> Connectez le lecteur de RFID à l'ordinateur via un connecteur RS-232 à USB. Télécharger les données au lecteur RFID périodiquement, avant que le lecteur atteint une capacité de stockage (jusqu'à 32 000 entrées). Utilisez lecteurs RFID à date, l'heure et une chaîne unique de treize caractère associé à chaque enregistrement d'étiquette. Importer le fichier CSV téléchargé dans un système de gestion de base de données relationnelle (SGBDR). </li></ol></li></ol> 4. Préparation Fleur artificielle pour les lecteurs RFID <ol><li> Achetez bleu et jaune cuire l'argile à partir d'un magasin d'artisanat local. </li><li> Créer un blue cylindre avec un diamètre de 1,5 cm, et un coupé 1,5 cm x 3 cm trou sur le côté. REMARQUE: le trou sur le côté du cylindre se servir de réceptacle pour le lecteur RFID. </li><li> Insérer un cône bleu d'un diamètre de 8 cm sur une extrémité, et 1,5 cm sur l'autre extrémité. </li><li> Fusionner le cylindre et le cône. </li><li> Créer un brin 20 cm de long et 0,5 cm de large d'argile jaune. </li><li> Couper le fil jaune de la taille, et de travailler dans le cône et le cylindre bleu. REMARQUE: formes radiales, il faudra de longues lignes droites 5 cm, et les formes concentriques, il faudra de longues lignes circulaires 4-8 cm. </li><li> Cuire au four d'argile à 130 ° F jusqu'à ce que complètement trempé. </li></ol> 5. Préparation pour l'observation par Motion-sensible enregistrement vidéo <ol><li> Commencer par coller des étiquettes numérotées plastique de couleur sur le thorax des abeilles ouvrières dès que la colonie arrive, et continuer tout au long de l'expérience que les nouveaux travailleurs émergent. </li><li> Retirez tous les travailleurs au cours de la première Tagging session pour veiller à ce que chaque individu reçoit une étiquette de numéro. La place des travailleurs de retour dans la colonie immédiatement après le marquage. NOTE: Contrairement étiquettes RFID, des étiquettes numériques sont plus difficiles pour les travailleurs à supprimer. </li><li> Comme de nouveaux travailleurs apparaissent, de les marquer alors qu'ils sont encore inexpérimenté. Marquage fréquence varie en fonction de l'état de cycle de colonie, mais les moyennes à environ 7-10 travailleurs tous les 2-3 jours. Éliminer des travailleurs qui ne sont pas marqués au cours de leur stade de novice parce qu'ils ne peuvent plus être fleur naïfs. </li><li> Système de marquage plus de travailleurs que les numéros d'étiquettes disponibles NOTE: Si l'expérience se poursuit pendant une période de plusieurs mois et plusieurs colonies sont impliqués, il ya une bonne chance que les numéros d'étiquettes disponibles épuisées. Il ya environ 7 couleurs d'étiquettes distinctes, chacune numérotée de 1 à 99, qui permet jusqu'à 693 travailleurs en même temps marqués. Une expérience en cours d'exécution pendant 3 mois en utilisant 3-4 colonies auront bien plus de 693 travailleurs au total, mais jamais en même temps vivant. &lt;ol&gt; </li><li> Assurez-vous que les numéros des balises sont placées systématiquement (par exemple, le côté supérieur du numéro de l'étiquette est toujours alignés avec la tête de l'abeille), surtout pour les numéros suivants: 6, 9, 66, 69, 99. </li><li> Retirer les travailleurs morts, et enregistrer leur numéro de l'étiquette comme «libéré». Maintenir une base de données de chiffres et de couleurs variables qui sont «disponibles» ou «utilisé» pour veiller à ce qu'une étiquette unique ne soit pas utilisé sur plusieurs abeilles en même temps. REMARQUE: les combinaisons de balises supplémentaires peuvent être produits en ajoutant des couleurs couleurs déjà existants. Par exemple, l'ajout d'un point jaune pour une étiquette bleue avec un stylo Sharpie peut créer de nouvelles combinaisons. </li></ol><li> Vidéo Traitement des données <ol><li> Placez deux de protocole Internet (IP) de caméscopes (1 Mp minimum de résolution de l'image) en face de chaque exposition florale, en dehors de l'environnement de test (voir Figure 3). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52033/52033fig3highres.jpg"> REMARQUE: Un diviseur de verre entre les caméscopes IP et les fleurs artificielles assure que les fleurs artificielles sont clairement visibles. Les caméscopes de propriété intellectuelle peuvent être jusqu'à 5 m de stimuli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52033/52033fig3highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> </li><li> Remplacer les actions lentilles avec 1,8 mm lentilles vari-focal. Ces lentilles permettent zoom suffisant et se concentrent sur les fleurs artificielles. </li><li> Passer une IP supplémentaire caméscope directement au-dessus de la fleur artificielle, en se concentrant sur une zone 1-2 m devant les fleurs artificielles. Ce caméscope capture des comportements de vol stationnaire et antennation. </li><li> Connectez les caméscopes IP à un PC via un contrôleur d'interface réseau secondaire (NIC), et un concentrateur Ethernet. </li><li> Configurer hôte dynamique de protocole de configuration de l'ordinateur (DHCP) pour distribuer dynamiquement les adresses IP aux caméscopes de propriété intellectuelle. </li><li> Configuration d'un protocole de transfert de fichiers (FTP) sur le PC. </li><li> Configurez un processus de client FTP pour déposer automatiquement les clips vidéo sur le PC. </li><li> Configurer le caméscope IP pour enregistrer un clip vidéo de 10 secondes à chaque fois qu'un mouvement est détecté. </li></ol></li><li> Analyse Vidéo Clip <ol><li> Ouvrez un clip vidéo, et afficher le contenu image par image en utilisant un lecteur de vidéo de choix. </li><li> Enregistrez étiquette en plastique numéro, la date d'une abeille et l'heure de l'enregistrement dans une feuille de calcul ou un SGBDR. Ici, définir un atterrissage comme les jambes d'une abeille entrer en contact avec la fleur artificielle. REMARQUE: Jeter les choix qui sont socialement influencés (atterrissage tout autre abeille est présente sur le stimulus). </li></ol></li>e "&gt; 6. Préparation de fleurs artificielles pour l'observation de la vidéo <ol><li> Concevoir propriétés visuelles à l'aide d'un logiciel d'édition graphique. REMARQUE: Assurez-vous que le motif imprimé peut être découpée et pliée en forme de cône. Utilisation des calculs géométriques pour produire la forme de la découpe qui se traduit par un cône avec un diamètre de 8 cm. </li><li> Imprimez, découpez et plier la propriété visuelle dans un cône. </li><li> Clips de fixation colle à un stimulus (voir Figure 2). </li></ol> 7. Analyse statistique <ol><li> Dans les deux expériences, calculer une proportion pour chaque choix d'abeille (par exemple, une abeille particulier x a une fleur de choix, sur un total de y). </li><li> Analyser ces proportions avec une bonté répliqué de test d'ajustement 7. REMARQUE: Un G-test reproduit calcule une valeur d'hétérogénéité (G h) qui indique la quantité de variabilité de répétitions (chaque abeille), et une valeur mise en commun (G p) qui indique l'importance globale detoutes les proportions de choix. Les valeurs G sont comparés à χ 2 valeurs dans les tests de signification. </li></ol> 8. stimuli Présentation Séquence <ol><li> Fixez fleurs artificielles sur les stands de fleurs à l'intérieur de l'espace de test. Changer la combinaison et l'emplacement des stimuli présentés à des intervalles de temps réguliers (par exemple, tous les jours) pour éviter les effets de localisation. </li></ol> Résiliation 9. Etude <ol><li> Placez les colonies dans le congélateur à -10 ° C pendant 3 jours pour tuer les abeilles. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

La technologie RFID permet étudient des centaines de travailleurs individuels avec une facilité et une grande précision, mais les caractéristiques du comportement enregistré est différent à partir d&#39;observations par des humains et des enregistrements vidéo. Le comportement de choix enregistrée par RFID peut être décrit comme l&#39;exploration floral. Ceci est un critère de préférence très stricte par rapport aux critères utilisés dans d&#39;autres études, comme approche 8, l&#39;entrée dans un labyrinthe à bras 9,10, la réaction antennaire 8, ou à l&#39;atterrissage sur un modèle 11,12. Afin de comparer la validité des définitions de comportement de choix, et de valider la nouvelle méthode de RFID pour comportement récompense, des enregistrements vidéo de l&#39;atterrissage ont été observés dans l&#39;expérience 2. Toutes les mesures de choix ne sont pas égaux: le critère de la RFID telle que mesurée par l&#39;entrée floral, ont indiqué que la propriété visuelle de positionnement de motif est plus important pour le choix d&#39;abeilles, tandis que les données vidéo ont indiqué que la propriété visuelle du type de motif qui est plus important pour le choix d&#39;abeille. L&#39;un des défis généraux dans l&#39;étude du comportement de choix désappris est qu&#39;il est très difficile d&#39;attirer des fleurs naïves, les abeilles non formés à fleurs artificielles qui ne proposent pas de pollen ou de nectar. En effet, la plupart des expériences précédentes ont eu recours à la formation des abeilles dans l&#39;environnement de test sur des stimuli qui sont censés être rien à voir avec le comportement de choix à des stimuli de test. RFID et des enregistrements vidéo sensibles au mouvement à surmonter cet obstacle en permettant l&#39;enregistrement en continu, 24 heures par jour, sans la surveillance constante du chercheur, et en augmentant la taille de l&#39;échantillon de 15 à 20 abeilles à plusieurs centaines d&#39;abeilles. Bien que les choix non récompensées par les abeilles non formés restent un phénomène rare, ces nouveaux paramètres de conception expérimentales font l&#39;observation possible. D&#39;autres améliorations offertes par ces deux techniques comprennent l&#39;élimination des biais d&#39;échantillonnage, l&#39;amélioration de la validité externe, et le suivi des différences individuelles. Sample biais peut être introduit lorsque que l&#39;étude d&#39;une dizaine d&#39;abeilles dans une colonie. Il existe des différences significatives dans les particularités de comportement entre les travailleurs individuels, même au sein de la même colonie qui sont probablement raté parce que les travailleurs sont observées que cela se produise à &quot;coopérer&quot; avec le chercheur à un moment donné. Etudier 15-20 abeilles dans une colonie de 300 ou plus d&#39;abeilles, représente aussi peu que 5% de la colonie totale, dont les préjugés cas d&#39;échantillonnage peut être importante. Le marquage et l&#39;observation du comportement de tous les travailleurs élimine cette question tout à fait. Le nombre de choix de stimuli simultanés peut également être manipulé. Nous avons offert des choix binaires dans notre expérience pour des raisons techniques, mais le choix unique ou plusieurs modèles de choix sont également possibles. En termes de validité externe, l&#39;étude des abeilles dans un environnement de laboratoire a toujours été très artificielle, qui a empêché la généralisation des résultats. Par exemple, les chercheurs ont dû être prESENT pour la collecte des données, les abeilles a au fourrage dans un environnement de test une par une, et le test a été limité à une petite fenêtre de temps. Les nouvelles techniques décrites dans le présent document supprimer ces limites artificielles en faisant l&#39;observation sans surveillance et sans restriction. Enfin, les différences individuelles de comportement peuvent être documentés parce que nous pouvons vérifier si ces choix ont été répétées par une seule abeille ou de plusieurs abeilles. Sensible au mouvement, les caméscopes haute résolution spatiale ont l&#39;avantage sur les techniques de RFID en termes de flexibilité de dessins stimuli: l&#39;apparition d&#39;un stimulus visuel peut être presque aucune forme aussi longtemps que l&#39;identification de l&#39;objet peut être capturée sur au moins un quelques images. Traitement des vidéos est un peu plus de temps que le traitement des données RFID, car l&#39;identification doit être lu par le chercheur, qui nécessite une inspection manuelle de chaque clip vidéo. Si la conception du stimulus visuel peut répondre aux contraintes de RFID lecteur (à savoir les étiquettes RFID sur l&#39;abeille doivent provenir d&#39;au moins 3-4 mm du lecteur RFID), puis la technologie RFID a l&#39;avantage sur la collecte de données automatisé à grande échelle. La recherche qualitative serait probablement continuer à être favorisé par l&#39;analyse vidéo. Comme le montre cette expérience, les lecteurs RFID peuvent accumuler de très grands ensembles de données qui ne nécessite aucun codage manuel. Les légèrement différents avantages associés à chacune de ces techniques donnent à penser que dans l&#39;avenir, ils pourraient être utilisés d&#39;une manière complémentaire. L&#39;avenir des deux technologies réside peut-être dans la quantification précise des comportements qui se produisent rarement. Par exemple, une possibilité distincte pour de futures applications est d&#39;utiliser ces techniques dans les serres et autres environnements plus naturalistes. La combinaison de naturalisme et de contrôle expérimental pourrait permettre d&#39;aborder des questions qui ne sont pas possible de répondre avant. D&#39;une manière générale, ces techniques offrent deux nouvelles façons d&#39;observer le comportement d&#39;une manière rigoureusemanière efficace e. RFID et vidéo à détection de mouvement sont une étape importante non seulement pour les chercheurs qui étudient les pollinisateurs et les insectes, mais ces techniques peuvent également faire appel à d&#39;autres spécialistes du comportement.

Un problème clé dans l&#39;étude du comportement de choix désappris par les bourdons et les abeilles est que, les travailleurs non qualifiés de fleurs naïfs ne pénètrent pas facilement l&#39;espace de test où les préférences peuvent être mesurés. En conséquence, de nombreux chercheurs se fondent sur un peu moins de technique idéale: les travailleurs de pré-formation pour alimenter l&#39;intérieur de l&#39;espace de test à partir de stimuli neutres en apparence que les chercheurs considèrent comme différents des stimuli expérimentaux. Cependant, des expériences récentes ont montré que les stimuli que l&#39;on croyait être neutre (c.-à-stimuli qui ne influencent le comportement de choix ultérieur dans une session de test) ont influencé les préférences de manière inattendue une. Les systèmes automatisés qui comprennent l&#39;identification par radiofréquence (RFID) et 2 enregistrements vidéo sensibles au mouvement peuvent offrir une occasion de résoudre ce problème. L&#39;objectif de l&#39;étude était double: (1) principalement à contribuer à la littérature sur les préférences florales ignorants par les bourdons, (2) et secondairement à EValuate deux systèmes de mesure de choix, tel qu&#39;enregistré par deux appareils d&#39;enregistrement automatisés différents. Deux systèmes automatisés 3 ont été appliquées dans la présente étude pour observer le comportement de choix ignorants: RFID et des enregistrements vidéo sensibles au mouvement. Deux éléments essentiels des deux systèmes sont que les choix ne sont pas récompensés, et l&#39;affichage des différents indices visuels peuvent être manipulés. Sensible au mouvement vidéo (haute définition, enregistrement à une résolution de 1 MP) non seulement permet l&#39;observation continue des travailleurs à explorer librement dans une chambre de vol, mais il est essentiel pour l&#39;observation efficace des événements relativement rares 4. La question de la recherche dans l&#39;expérience 1 se rapporte à la façon dont différents propriétés visuelles interagissent lorsqu&#39;ils sont affichés ensemble. Cette étude vise à explorer l&#39;importance relative de positionnement de motif en fonction du type de modèle. En utilisant un modèle 2 x 2, radiale (ie, rayon de soleil) et concentrique (e Bullye) types de motifs sont placés soit centrale ou périphérique sur une fleur artificielle (voir la figure 1 pour des exemples de stimuli). Les lecteurs RFID sont intégrés dans ces stimuli de fleurs artificielles spécialement conçus, et les bourdons reçoivent RFID permis balises qui nous permettent d&#39;enregistrer chaque travailleur marqué qui entre dans la fleur stimulus artificiel. observation RFID fonctionne par le mécanisme de lecture (intégré dans les fleurs artificielles) envoyant des signaux à des fréquences radio (13,56 MHz dans ce cas), qui sont modulées par la présence d&#39;étiquettes passives. Le lecteur peut détecter et enregistrer ces modulations de signaux, qui varient légèrement selon les balises permettant étiquette d&#39;identification unique. Les questions de l&#39;expérience 2 sont de trois ordres. Tout d&#39;abord, sont-fleur entrée, telle que mesurée par la RFID, et à l&#39;atterrissage, telle que mesurée par les enregistrements vidéo des critères de choix équivalents? Le choix est mesurée en différents points (atterrissage pour la vidéo, et l&#39;entrée de fleur pour la RFID), qui peut se traduire par différentes mesuresde préférence. Deuxièmement, quel est l&#39;effet de la centrale vs positionnement périphérique? On ne sait pas si oui ou non les travailleurs choisissent un motif central si une combinaison composée de deux modèles radiaux dans des positions différentes ont été présentées (voir figure 4b). Troisièmement, quelle est l&#39;importance relative de la position de modèle vs type de motif? En d&#39;autres termes, les bourdons se poser sur les modèles du type de modèle préféré, ou la position du modèle préféré? Les abeilles pourraient préférer central radial à une configuration périphérique concentrique, mais la préférence peut être dû à la configuration ou le type de sa position centrale. Dans cette expérience, deux variables ont été montés les uns contre les autres 5 (voir la figure 4c, d). Dans l&#39;expérience 2, nous avons utilisé des enregistrements vidéo à détection de mouvement sur des stimuli ressemblant à des fleurs. Fleurs artificielles ont été placés dans une cage de vol, et les caméscopes haute définition sensibles au mouvement étaient braqués sur ces fleurs de la front et le sommet. Plus précisément, deux caméscopes ont été positionnés de façon à capturer la vue de face de chacune des deux stimuli dans l&#39;espace de test. Un caméscope supplémentaire a été placé entre les stimuli pour enregistrer planant comportement d&#39;en haut, et le comportement de deux fleurs artificielles capturé. Les bourdons ont été identifiés par des étiquettes numériques qui pourraient être lus en haute définition des clips vidéo. Survoler, les comportements de antennation et d&#39;atterrissage ont été observés.

<table><tbody><tr><td>Étiquettes miniaturisées mic3</td><td>Microsensys</td><td>mic3 TAG 64 bits RO</td><td>Étiquettes RFID à coller à l’abeille</td></tr><tr><td>Lecteur RFID 2k6 tête</td><td>Microsensys</td><td>2k6</td><td>Lecteurs RFID intégrés dans des fleurs artificielles</td></tr><tr><td>Caméscopes IP</td><td>Vivotek</td><td>IP8161</td><td>Enregistreurs vidéo sensibles au mouvement</td></tr><tr><td>Opalith Plattchen Étiquettes numériques et colle non toxique</td><td>Beeworks.com</td><td>n/a</td><td>Étiquettes numériques à coller aux abeilles</td></tr><tr><td>Bumblebee Colony for Research</td><td>Koppert Canada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fleurs artificielles</td><td>N/A</td><td></td><td>Développé par le magasin de biologie du campus</td></tr><tr><td>Support de fleurs artificielles</td><td>N/A</td><td></td><td>Développé par le magasin de biologie du campus</td></tr><tr><td>Salle de vol</td><td>N/A</td><td></td><td>Développé par le magasin de biologie du campus</td></tr><tr><td>Ordinateur portable avec Windows</td><td>Matériel générique / Logiciel Microsoft</td><td></td><td>Utilisé pour télécharger des données RFID</td></tr><tr><td>Convertisseur RS 232 vers USB</td><td>Générique</td><td></td><td>Connecter le lecteur RFID à l’ordinateur</td></tr><tr><td>de bureau IBM</td><td></td><td></td><td>Utilisé pour transmettre des données vidéo</td></tr><tr><td>Deuxième carte réseau</td><td>Générique</td><td>10/100M NIC PCI</td><td>Utilisé pour transmettre des données vidéo</td></tr><tr><td>Concentrateur réseau</td><td>Générique</td><td>à 4 ports</td><td>Utilisé pour transmettre des données vidéo</td></tr><tr><td>Pince à épiler de haute précision</td><td>SPI</td><td></td><td>Utilisé pour coller des numéros et des étiquettes RFID sur les abeilles</td></tr><tr><td>Sucre</td><td>Générique</td><td></td><td>Utilisé pour mélanger avec de l’eau pour créer de l’eau sucrée</td></tr><tr><td>Pollen</td><td>Tout apiculteur</td><td></td> local <td>Nourri aux bourdons</td></tr><tr><td>Marquage cage avec piston</td><td>Beeworks.com</td><td></td><td>Facilite le processus de marquage</td></tr><tr><td>Miel</td><td>Générique</td><td></td><td>Utilisé pour mélanger avec de l’eau pour créer de la pâte de pollen</td></tr><tr><td>Cuire l’argile</td><td>Sculpey</td><td></td><td>Stimulus pour</td></tr><tr><td>les outils de façonnage de l’argile</td><td>RFID Stimulus générique</td><td></td><td>pour</td></tr><tr><td>le livre blanc</td> RFID <td>Stimulus générique</td><td></td><td>pour</td></tr><tr><td>l’imprimante laser</td> vidéo <td>Stimulus générique</td><td></td><td>pour</td></tr><tr><td>le bois</td><td>vidéo Stimulus générique</td><td></td><td>pour la vidéo -- clip de fixation</td></tr></tbody></table>

identification par radiofréquence et vidéo motion-sensible efficacement automatiser enregistrement de récompense choix comportement par les bourdons

Radio Frequency Identification and Motion-sensitive Video Efficiently Automate Recording of Unrewarded Choice Behavior by Bumblebees

Nous présentons deux méthodes pour observer le comportement de choix de bourdon dans un espace de test ci-joint. La première méthode consiste à identification par radiofréquence (RFID) des lecteurs intégrés dans les fleurs artificielles qui affichent différents repères visuels, et des étiquettes RFID (c.-à transpondeurs passifs) collées sur le thorax des travailleurs de bourdons. La nouveauté dans notre mise en œuvre est que les lecteurs RFID sont intégrés directement dans les fleurs artificielles qui sont capable d&#39;afficher plusieurs propriétés visuelles distinctes telles que la couleur, le type de modèle, la fréquence spatiale (ie, &quot;agitation&quot; du modèle), et la symétrie (fréquence spatiale et symétrie n&#39;a pas été manipulé dans cette expérience). En outre, ces affichages visuels, en collaboration avec les systèmes automatisés sont capables d&#39;enregistrer le comportement de choix sans récompense et sans formation. La deuxième méthode consiste comportement de choix d&#39;enregistrement à l&#39;aide de fleurs artificielles caméscopes haute définition sensibles au mouvement. Bumblebees possèdent des étiquettes numériques collés à leurs thorax pour l&#39;identification unique. L&#39;avantage de cette mise en œuvre sur la RFID est que, en plus de l&#39;observation du comportement d&#39;atterrissage, d&#39;autres mesures de préférence tels que le vol stationnaire et antennation peuvent également être observés. Les deux méthodes d&#39;automatisation augmentent contrôle expérimental, et la validité interne en permettant des études à plus grande échelle qui prennent en compte les différences individuelles. La validité externe est également améliorée parce que les abeilles peuvent librement entrer et sortir de l&#39;environnement de test sans contraintes telles que la disponibilité d&#39;un assistant de recherche sur le site. Par rapport à l&#39;observation humaine en temps réel, les méthodes automatisées sont plus coût-efficace et peut-être moins d&#39;erreurs.

Expérience 1: données RFID Tous les 375 ouvrières de la colonie ont été étiquetés RFID, et 318 de ces travailleurs (85%) sont entrés dans la cage de vol à un moment donné au cours de l'étude. Un total de 197 (62% des abeilles qui ont quitté la colonie) ont visité au moins un des quatre stimuli de fleurs artificielles. Définition d'un choix Un choix a été défini comme un travailleur entrant dans la fleur artificielle (voir Figure 1). Nous avons étiqueté ce comportement comme «exploration floral.» Cette définition d'un choix est plus stricte que celles utilisées dans la littérature, qui, selon l'étude, l'utilisation d'une combinaison de vol stationnaire, antennation ou à l'atterrissage. Exploration Floral est une définition plus stricte de choix car il faut que les abeilles non seulement assister à un stimulus par planant, antennating, et l'atterrissage sur elle, mais aussi par l'explorer. La gestion des données <p class="jove_content" techniques rfid ont la capacit de recueillir une quantit donn par rapport d m cette exp a produit dossiers. un programme comme base mysql est outil indispensable pour stocker et sont les requ sql tout aussi importantes utilis des r aux questions recherche. exemple probl choix. lecteurs configur enregistrer pr tous ms ce qui dans le cas abeilles s l fleurs artificielles minutes voire quelques heures peut se traduire plusieurs milliers notre choix visite dur au moins mais nouvelle ne serait pas compt jusqu que cha en cours interrompue pause min.> Résumé de l'expérience Bonté quatre répliqué de tests d'adéquation ont été effectuées sur tous les choix de «session naïf» d'abeilles à comparer choix proportions à une valeur théorique de hasard 7. Séance naïve d'une abeille se réfère à la première condition de test dans lequel l'abeille "participé". Le G-tests révèlent une préférence pour le positionnement central (voir le tableau 1) et radial type de motif. La figure 4b montre que la préférence de tendance est inversée lorsque le motif concentrique est positionnée au centre et le modèle radial est positionné en périphérie. Cependant, si le positionnement est maintenue constante comme dans la figure 4a et d, de préférence tendance est vers le motif radial. La figure 4 montre que les proportions relatives de premier choix pour chaque modèle de chaque combinaison ont été comparables pour les proportions indiquées pour tous les choix. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52033/52033fig4highres.jpg"> Figure 4. RFID résultats expérimentaux. De fréquences Choice à tes quatre combinaisons de fleurs différentes dans l'expérience 1. Les sombres graphiques à barres brunes montrent tous les choix de la session naïf de l'abeille (axe des y gauche), et les barres brun clair indiquent le premier choix de chaque travailleur (axe des y-droite ). «Tous les choix" Afficher les modèles comparables de «premier choix», mais avec une plus grande puissance statistique. Les graphiques indiquent que le positionnement des motifs est plus important que le type d'un motif. Un modèle en position centrale a été préféré même si le type de modèle affiche un motif concentrique autrement moins préférable. Les astérisques indiquent une proportion de choix qui est significativement différente de hasard. Remarque. * P &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001. Ce chiffre a été modifié depuis Orbán et al. 11. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Conditions </td><td colspan="3"> Pooled </td><td colspan="3"> Hétérogénéité </td><td></td></tr><tr><td> Gp </td><td> df </td><td> p </td><td> Gh </td><td> df </td><td> p </td><td></td></tr><tr><td> Central-Radial vs centrale concentrique </td><td> 3.96 </td><td> 1 </td><td> 0,047 </td><td> 197,55 </td><td> 41 </td><td> 0.000 </td><td></td></tr><tr><td> Périphérique-Radial vs centrale concentrique </td><td> 33.77 </td><td> 1 </td><td> 0.000 </td><td> 210,81 </td><td> 42 </td><td> 0.000 </td><td></td></tr><tr><td> Central-Radial vs périphériques concentriques </td><td> 508,31 </td><td> 1 </td><td> 0.000 </td><td> 345,78 </td><td> 30 </td><td> 0.000 </td><td></td></tr><tr><td> Périphérique-Radial vs périphériques concentriques </td><td> 7.42 </td><td> 1 </td><td> 0.000 </td><td> 84.06 </td><td> 24 </td><td> 0.000 </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1. Estimations de données RFID. __gVirt_NP_NN_NNPS&lt;__ expérience 1. Ce tableau a été modifié depuis Orbán et al. (2013) 11. G p se réfère à la déviation significative de la proportion de groupe du hasard, et G h se réfère aux tests de différences individuelles ( à savoir, l'hétérogénéité). Se il vous plaît se référer au manuscrit pour plus de détails sur les tests statistiques. Expérience 2: données vidéo Un total de 264 choix ont été enregistrés dans les quatre conditions sur trois séances d'essais. Le tableau 2 montre le nombre de travailleurs et les choix ont contribué de chaque colonie. Définition d'un choix Les données vidéo permet l'enregistrement de trois types de comportements de choix: planant, antennation et d'atterrissage. Bien que les trois types de comportements peuvent être observés, planant et antennation sont difficuLT à associer à un numéro de l'étiquette en raison de mouvements rapides que les caméscopes avec une faible résolution, ou à faible vitesse ne peut pas enregistrer. Il est crucial d'utiliser un caméscope haute définition (même si cela n'a pas été mis à notre disposition, idéalement une haute fréquence d'image caméscope doit être utilisé pour minimiser le flou) pour assurer un nombre de balises qui peuvent figurer que sur un petit nombre d'images pouvant être lu . Cette méthode a également été utilisée pour comparer les profils de choix avec la technique RFID, qui détecte exploration floral. considérations de sensibilité de mouvement L'une des questions clés dans la production d'une expérience réussie est la configuration des caméscopes à détection de mouvement. Un caméscope qui est trop sensible enregistre trop de données qui est peu pratique et peut devenir très coûteux à traiter. Par exemple, au début de notre caméscope a été déclenchée par les vibrations régulières dans le bâtiment (par exemple, les gens qui passent par le couloir, climatiseur, etc.), ce qui a entraîné 1R11; 2 points de données valables pour tous les 150-200 clips vidéo enregistrés. D'autre part, une erreur encore plus grave est une configuration de faible sensibilité, ce qui peut manquer données clés. Il est essentiel de configurer tous les caméscopes de la même façon, sinon, les erreurs d'échantillonnage peuvent fausser les résultats. Résumé de l'expérience Quatre bonté répliqué de tests d'adéquation trouvé trois proportions de groupe qui est écarté sensiblement de la chance, et une proportion globale non significative (voir le tableau 3 et la figure 5). (1) Le motif est importante: une préférence marquée pour le centre-radial sur le motif central concentrique a été trouvé (voir le tableau 3). (2) la position du motif radial est moins importante: la présentation de l'ensemble central et périphérique radial radial n'a pas montré de différence significative de hasard. (3) Le centre-radiale et la combinaison périphérique-concentrique entraîné une forte préférence pours le motif central radiale. La combinaison central concentrique et périphérique radiale suscité préférence significative vers le modèle périphérique radiale. Motif éclipsé emplacement. Les différences individuelles étaient non significatifs dans les quatre combinaisons (voir le tableau 3). <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52033/52033fig5highres.jpg"> . Figure 5. Résultats de la vidéo à détection de mouvement fréquences Choice aux quatre combinaisons de fleurs différentes dans l'expérience 2. Les résultats montrent l'importance du type de motif sur le positionnement de modèle: les modèles radiales ont été préférés, même si les modèles ont été placés en périphérie. Les valeurs indiquent le nombre de choix de la configuration affichée. Les astérisques indiquent une proportion de choix qui est significativement différente de hasard. Remarque. ** P &lt;0,01, *** p &lt;0,001. Ce chiffre a été modifié depuis Orbán 11. <table border='"0"' cellpadding="cellspacing"><tr><td rowspan="2"> Conditions </td><td> Session 1 </td><td colspan="2"> Session 2 </td><td colspan="2"> Session 3 </td></tr><tr><td> Colony 1 </td><td> Colony 2 </td><td> Colony 3 </td><td> Colony 4 </td><td> Colony 5 </td></tr><tr><td> Nombre de travailleurs </td><td> 45 </td><td> 7 </td><td> 2 </td><td> 8 </td><td> 23 </td></tr><tr><td> Nombre de choix </td><td> 151 </td><td> 25 </td><td> 2 </td><td> 20 </td><td> 65 </td></tr></table> Tableau 2. Statistiques descriptives des données sensibles au mouvement vidéo. Nombre total de choix enregistrées aux fleurs artificielles dans l'expérience 2 pour chaque colonie, et le nombre de travailleurs qui font ces choix. Ce tableau a été modifié depuis Orbán et al. 11. Se il vous plaît se référer au manuscritpour plus de détails. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Conditions </td><td colspan="3"> Commun </td><td colspan="3"> Hétérogénéité </td></tr><tr><td> Gp </td><td> df </td><td> p </td><td> Gh </td><td> df </td><td> p </td></tr><tr><td> Central-Radial vs centrale concentrique </td><td> 17.98 </td><td> 1 </td><td> 0.000 </td><td> 40.72 </td><td> 29 </td><td> 0,073 </td></tr><tr><td> Central-Radial vs périphériques radiales </td><td> 1.85 </td><td> 1 </td><td> 0,173 </td><td> 53.63 </td><td> 39 </td><td> 0,060 </td></tr><tr><td> Périphériques radiales vs concentrique centrale </td><td> 6.57 </td><td> 1 </td><td> 0,010 </td><td> 26.31 </td><td> 27 </td><td> 0,500 </td></tr><tr><td> Radial centrale vs périphérique concentrique </td><td> 18.18 </td><td> 1 </td><td> 0.000 </td><td> 41.92 </td><td> 37 </td><td>0,256 </td></tr></tbody></table> Les données vidéo Tableau 3. Estimations sensible au mouvement. Expérience 2. Ce tableau a été modifié depuis Orbán et al. 11. G p se réfère à la déviation significative de la proportion de groupe du hasard, et G h se réfère aux tests de différences individuelles ( à savoir, l'hétérogénéité). Se il vous plaît se référer au manuscrit pour plus de détails sur les tests statistiques.

Cette vidéo décrit l’identification par radiofréquence (RFID) et les méthodes d’enregistrement vidéo sensibles au mouvement pour surveiller le comportement de choix des bourdons.

Identification par radiofréquence et vidéo Motion-sensible efficacement Automatiser enregistrement de récompense Choix Comportement par les bourdons

We present two methods for observing bumblebee choice behavior in an enclosed testing space. The first method consists of Radio Frequency Identification ...

Les objectifs globaux de ces procédures sont d’automatiser l’observation du comportement de choix des abeilles sur les fleurs artificielles. Pour ce faire, il suffit d’abord de coller une étiquette d’identification sur toutes les abeilles à l’intérieur d’une colonie à l’aide d’étiquettes numériques en plastique ou d’étiquettes RFID, selon le protocole. La deuxième étape consiste à installer des caméscopes sensibles au mouvement ou des lecteurs RFID dans l’espace de test.Ensuite, les fleurs artificielles ont leur place dans l’espace d’essai. La dernière étape consiste à donner aux colonies B l’accès à l’espace d’essai. En fin de compte, une grande base de données de documents est générée, composée de l’heure et du lieu de chaque visite florale.Le principal avantage de ces techniques par rapport à d’autres méthodes, telles que l’enregistrement manuel des observations en temps réel, est qu’elles nous permettent d’étudier le comportement d’abeilles qui n’ont encore jamais connu de récompenses sur les fleurs. Les abeilles mettent du temps à découvrir les fleurs, parfois même des jours. Nos méthodes nous permettent de capturer ces événements très rares.Nous pouvons enregistrer les activités d’une colonie entière de bourdons en continu sur une longue période de temps, et avec une grande précision. Cela peut nous aider à répondre à des questions clés sur le comportement des insectes sur les origines des différences individuelles. L’environnement d’essai pour ce protocole doit être une pièce isolée ou une cage de vol à écran métallique de deux mètres cubes sur la cage de vol.Un petit trou, d’un diamètre d’un nickel ou d’environ deux centimètres, sert de point d’entrée et de sortie pour les abeilles. Abeille. Les colonies sont reliées à l’espace d’essai à l’aide d’un conduit suffisamment large pour permettre à plusieurs abeilles de circuler simultanément. Les conduits de tube de tamisage sont idéaux car ils offrent une bonne traction pendant ces expériences.Les abeilles se déplacent librement entre la cage de vol et la boîte de colonie via ces conduits à l’intérieur de l’espace d’essai se trouvent deux supports pour le placement de fleurs artificielles. Il s’agit de supports en bois de 1,2 mètre de haut placés au centre de l’espace ou fixés au mur. Le haut du support est doté d’un mécanisme qui sert à maintenir les fleurs.Tout au long de l’expérience, les emplacements des supports sont déplacés périodiquement pour éviter l’introduction d’artefacts d’effet de position. Pendant les expériences RFID, une tête 2K six est installée sur une fleur artificielle conçue sur mesure pour les expériences d’étiquettes de couleur. Des caméscopes sensibles au mouvement sont placés à deux mètres des fleurs artificielles.L’espace d’essai est éclairé par des lampes fluorescentes générant un minimum de 1 200 lux d’intensité, car les abeilles peuvent détecter le scintillement des lumières fluorescentes ordinaires, des ballasts spécialisés à haute fréquence scintillant à plus de 200 hertz doivent être utilisés pendant l’expérience. Les travailleurs sont étiquetés sur le thorax avec des étiquettes RFID, les élisent dans des conteneurs individuels lorsqu’ils sortent de leurs cocons et, alors qu’ils sont encore en phase de repos et incapables de voler, les appellent pendant environ une heure dans un réfrigérateur réglé à sept degrés Celsius. Cela minimisera le risque d’être piqué lors du marquage.Une fois refroidi, appliquez une étiquette RFID unique sur chaque travailleur à l’aide d’une colle non toxique. Laissez sécher la colle pendant au moins 10 minutes avant de réintroduire l’ouvrière dans la colonie. Tous les travailleurs qui échappent à l’étiquetage ou qui ont perdu leur RFID doivent être expulsés.Lorsque l’expérience peut être fabriquée par un atelier d’usinage, elles sont ensuite doublées d’argile de couleur. Une fleur artificielle bleue unie est le modèle de base sur lequel différentes caractéristiques visuelles sont ajoutées. L’une des caractéristiques visuelles est un dessin utilisant une fine doublure d’argile jaune.La fente sur la partie cylindrique de la fleur artificielle s’enclenche facilement sur le lecteur RFID. La conception du stimulus floral est cruciale. L’espace intérieur doit être suffisamment grand pour que tous les morceaux de bourdon puissent grimper à l’intérieur, mais suffisamment petit pour que l’étiquette sur le bourdon se trouve à moins de trois à quatre millimètres du lecteur.De plus, la fleur artificielle doit être conçue pour afficher des propriétés visuelles de manière à ce qu’il n’y ait pas de perturbation entre le cylindre et les parties de raton laveur. Les étiquettes numérotées colorées constituent une alternative aux étiquettes RFID. Ces étiquettes sont également appliquées aux abeilles ouvrières peu de temps après leur sortie de leur cocon.L’un des avantages par rapport aux étiquettes RFID est qu’elles sont plus difficiles à déloger pour les abeilles. Comme pour le marquage RFID, retirez toutes les ouvrières de la colonie et appelez-les avant le marquage. Plus tard. Une fois que l’expérience a commencé et que le comportement des abeilles est enregistré, de nouvelles ouvrières apparaîtront et devront être marquées.En règle générale, sept à dix nouvelles ouvrières émergent tous les deux à trois jours pour enregistrer les données des abeilles marquées en couleur. Les caméras vidéo sensibles au mouvement doivent être dirigées vers chaque fleur depuis l’extérieur de l’environnement d’essai. Il peut s’agir de caméras de protocole Internet avec une résolution d’au moins un mégapixel et une modification de la lumière.Remplacez l’objectif d’origine par un objectif très focal de 1,8 millimètre pour offrir une meilleure mise au point et la possibilité de zoomer sur la fleur. Concentrez un autre appareil photo pour capturer la zone devant les deux fleurs. Cette caméra est positionnée à environ un demi-mètre au-dessus des fleurs.Il capture les comportements qui se produisent avant l’atterrissage, notamment l’approche, le vol stationnaire et même l’activation. Une colonie de 375 ouvrières a été étiquetée avec des RFID. 85 % sont entrés dans la cage de vol pendant l’étude, et 62 % de ces abeilles ont également exploré l’un des quatre stimuli floraux.Cela a été noté comme planant au-dessus de l’atterrissage et de l’exploration. L’expérience a produit environ 300 000 événements enregistrés, qui ont tous été stockés dans une base de données du monde des souris. Une préférence a été manifestée pour un motif radial par rapport à un motif concentrique.Le motif radial s’est inversé, cependant, lorsque le motif concentrique était positionné au centre de la fleur et que le motif radial était périphérique. Dans une deuxième expérience, des abeilles ont été marquées avec des chiffres colorés et filmées avec des caméscopes sensibles au mouvement. Dans cette expérience, il y avait une préférence pour les fleurs à motif radial positionnées au centre par rapport aux motifs concentriques positionnés au centre. Fleur.La position d’un motif sur la fleur n’a pas fait de différence. Ces procédures nous permettent de tester empiriquement les prédictions théoriques offertes par la modélisation computationnelle et l’intelligence artificielle sur les caractéristiques du traitement de l’information visuelle par les petits cerveaux. Par exemple, des réseaux neuronaux non supervisés ont été utilisés pour générer des prédictions concernant les préférences en matière de symétrie, que nous avons testées à l’aide de nos méthodes automatisées.Le comportement des bourdons quittant leur colonie pour la toute première fois est un domaine d’étude négligé, et certains des obstacles à la recherche ont été méthodologiques. Les techniques que nous avons décrites dans cette vidéo sont particulièrement bien adaptées pour étudier le comportement des bourdons qui quittent leur colonie et cherchent de la nourriture pour la toute première fois. RFID. Les psychologues et les biologistes utilisent actuellement le marquage et les enregistrements vidéo sensibles au mouvement pour étudier de nouvelles questions qui, jusqu’à récemment, étaient hors de portée.

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