Isolement des populations cellulaires distinctes du cervelet en développement par microdissection

L’objectif global de cette procédure est d’isoler des populations cellulaires spécifiques du cervelet en développement. Ceci est accompli en récoltant d’abord le cervelet de souris nouveau-nées porteuses de protéines fluorescentes. La deuxième étape de la procédure consiste à obtenir des coupes de tissus vivants à l’aide d’un vibrato.

La troisième étape consiste à microdisecter la couche germinale externe du cervelet sous un microscope à dissection fluorescente. Les dernières étapes consistent à dissocier le tissu en une suspension unicellulaire et à collecter les cellules par tri cellulaire activé par fluorescence. En fin de compte, les résultats peuvent montrer que des populations cellulaires spécifiques peuvent être isolées du cervelet.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la capture laser, la microdissection, est que les cellules sont vivantes et peuvent être cultivées. Pour une expérience plus poussée Pour cette procédure, stérilisez les outils chirurgicaux à l’aide d’un autoclave. Obtenez des aros frais ou réchauffés à 3 % de point de fusion bas prêts à l’emploi dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.

Composez les solutions requises pour la dissociation cellulaire basée sur la papaye. Préparez des milieux de culture NBB 27 frais. Ensuite, filtrez, stérilisez et stockez dans un incubateur.

Préparez la mémoire tampon de télécopie et préparez les bordereaux de protection en poly de lycine. La première couche de couverture de l’autoclave glisse avec 100 microgrammes de poly de lycine par millilitre d’eau stérile. Ensuite, incubez les lamelles pendant deux heures à 37 degrés Celsius ou toute la nuit à température ambiante.

Plus tard, lavez les lamelles avec de l’eau distillée puis un média NBB 27 avant d’utiliser les lamelles. Séchez-les complètement. Cela prendra au moins une heure avant de commencer.

Préparez d’abord la zone de dissection. Essuyez-le avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, couvrez-le d’un tampon absorbant.

Deuxièmement, retirez les outils de la poche de stérilisation et positionnez-les pour l’utilisation. Troisièmement, chargez un plat avec du DPBS stérile glacé avec une bande de stylo à 1 % et mettez-le sur de la glace. Disséquez le cerveau d’un chiot P quatre qui exprime des marqueurs fluorescents.

Transférez-le ensuite dans le plat préparé de DPBS. Utilisez des pinces pour séparer soigneusement le cervelet du reste du cerveau. Ces cervelets expriment les marqueurs mathématiques un, GFP, et s’imbriquent dans CFP dans lesquels l’EGL exprime GFP et la couche moléculaire est positive pour CFP.

Ensuite, remplissez un moule d’enrobage de deux centimètres de cube avec la solution agricole. Assurez-vous qu’il ne fait pas plus de 37 degrés Celsius. Prenez un cervelet à l’aide d’une cuillère perforée et séchez-le avec un léger tamponnement de tissu.

Ensuite, à l’aide d’une pince, placez-le dans le moule. Utilisez une aiguille pour amener le cervelet dans des orientations verticales. Une fois qu’environ quatre sont chargés dans le moule.

Placez le moule sur de la glace pour qu’il se solidifie rapidement à l’aide d’une lame de rasoir. Coupez le bloc pour réduire le temps de sectionnement. Collez ensuite le bloc sur la plaque orientée de manière à ce que les cervelets soient verticaux.

Chargez le plateau de remplissage avec du DPBS glacé avec une sangle pente à 1 % et mettez de la glace sous le plateau pour qu’il reste froid. Sectionnez maintenant les blocs avec un vibromasseur. Coupez et collectez des sections de 600 microns.

Retirez-les du bac à glaçons à l’aide d’une cuillère perforée et transférez-les dans un plat rempli A-D-P-B-S sur de la glace. Sous microscope à dissection fluorescente. Examinez les tranches le plus rapidement possible.

Séparez soigneusement l’EGL du reste de la section cérébelleuse. Utilisez une pince fine pour disséquer entre la couche moléculaire positive CFP et l’EGL GFP positive. Soyez très prudent lors de la microdissection pour éviter la contamination des régions adjacentes.

Transférez le tissu EGL positif à la GFP dans un nouveau plat rempli de DPBS sur de la glace. Évitez d’inclure tout tissu de couche moléculaire car cela contaminerait la culture avec une nidification exprimant la glie de Bergman. Ensuite, retirez les agros entourant le tissu EGL isolé.

L’EGL peut maintenant être dissocié à l’aide d’un protocole basé sur le paan pour une suspension de cellule unique. Une fois cette opération terminée, réactivez la suspension des cellules dans la mémoire tampon de télécopie. Procédez à la collecte des cellules CFP par télécopieur.

Triez-les à l’aide d’un cytomètre à grande vitesse et d’un filtre CFP et tirez-les dans une mémoire tampon de télécopie glacée. Environ 100 000 NPS doivent être obtenus par cervelet P quatre. Ensuite, centrifugez les cellules regroupées à 300 G pendant cinq minutes.

Utilisez immédiatement les cellules pour les cultiver résume. Suspendez-les dans un support NBB 27 préchauffé. Ensuite, chargez-les sur les lamelles enrobées de poly D lysine.

Des tranches de cellules bella ont été préparées à partir de P quatre mathématiques un nid GFP chez des souris CFP. L’EGL cérébelleuse contenait principalement des GFP exprimant des GMP et pouvait être facilement séparée de la couche moléculaire enrichie en CFP exprimant la glie. L’analyse des faits a montré que plus de 85 % des cellules de l’EGL étaient des GNP conventionnels. Les NEP ont été isolés des parties profondes de l’EGL par microdissection, suivie de faits.

Ces cellules représentaient environ 5 % des cellules de l’EGL pendant quatre jours de culture. Les faits isolés NPS ont donné naissance à des neurones exprimant la bêta-tubuline. Ceci est caractéristique des cellules progénitrices neuronales restreintes à la lignée.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de travailler rapidement et de garder le tissu sur la glace autant que possible.