Isolement de cellules souches du cervelet de souris postnatal et différenciation en cellules neurales

Prenez des cellules isolées d’un cervelet de souris nouveau-né contenant des cellules souches, des neurones et des cellules gliales.

Ajoutez des microbilles magnétiques enrobées d’anticorps qui se lient à une glycoprotéine de surface spécifique aux cellules souches.

Centrifugez, retirez les billes non liées et remettez les cellules en suspension dans un tampon.

Chargez les cellules sur une colonne de séparation placée dans un séparateur magnétique, qui retient les cellules souches liées aux microbilles pendant que d’autres cellules circulent.

Ajoutez un milieu neurosphérique pour éluer les cellules et les transférer dans une microplaque. Incuber pour induire la formation de neurosphères primaires, colonies de cellules souches qui s’auto-renouvellent.

Centrifugez et jetez le fluide. Remettre les neurosphères en suspension dans un milieu contenant des enzymes pour digérer les protéines d’adhésion cellulaire.

Centrifugez et retirez les enzymes. Ajoutez le milieu neurosphérique et dissociez mécaniquement les cellules.

Incuber pour permettre la prolifération des cellules souches et la formation de la neurosphère secondaire, tandis que les cellules différenciées dépourvues de caractéristiques de cellules souches ne prolifèrent pas.

Transférez les neurosphères dans un milieu de différenciation et incuberez, favorisant la différenciation en neurones et glie.

Placez les tubes à centrifuger sur de la glace, puis filtrez les cellules dissociées à travers une crépine de 40 micromètres dans un tube de 50 millilitres. Remplissez le filtre de 10 millilitres de solution HBSS glacée, pour vous assurer que les cellules passent à travers le maillage.

Transférez les cellules filtrées dans un tube à centrifuger frais de 15 millilitres et centrifugez la suspension à 300 fois g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Ensuite, utilisez un aspirateur pour éliminer complètement le surnageant.

Remettez en suspension la pastille de cellule dans 160 microlitres de tampon de colonne magnétique glacé. Ajoutez 40 microlitres de microbilles d’anti-prominin-1 à la suspension cellulaire. Ensuite, incubez les tubes dans un réfrigérateur pendant 15 minutes, pour permettre à l’anticorps de se lier aux cellules exprimant la prominine-1.

Lavez les cellules avec 1 à 2 millilitres de tampon en colonne X, et centrifugez-les à 300 fois g pendant 10 minutes. Aspirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 1 millilitre de tampon de colonne X. Placez les colonnes magnétiques sur le support magnétique et rincez-les une fois avec 500 microlitres de tampon X. Appliquez la suspension cellulaire étiquetée sur la colonne et collectez le flux dans des tubes frais de 15 millilitres.

Lavez la colonne trois fois avec 500 microlitres de tampon X. Ensuite, retirez les colonnes du champ magnétique et placez-les dans des tubes de 1,5 millilitre. Ajoutez 1 millilitre de milieu de culture et enfoncez le piston dans la colonne pour rincer les cellules marquées avec des billes de prominin-1.

Pour faire passer les neurosphères, transférez-les avec le milieu de culture dans un tube à centrifuger stérile de 15 millilitres. Granulez les neurosphères par centrifugation à 300 fois g pendant 5 minutes et jetez le surnageant.

Remettez la pastille en suspension dans 5 millilitres de milieu de dissociation avec de la papaïne ou une solution de trypsine à 0,05 %, et incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Centrifugez à nouveau la suspension cellulaire. Ensuite, mettez les cellules en suspension dans 5 millilitres de milieu neurosphérique, et dissociez-les en les pipetant lentement de haut en bas 10 fois avec une pipette de pâturage. Plaquez les cellules dans des milieux neurosphériques comme décrit dans le protocole textuel, et enrichissez-les avec des neurosphères secondaires après 7 à 10 jours de culture comme décrit précédemment.