Isolation des corticale microglie avec immunophénotype préservée et fonctionnalité De murins nouveau-nés

L’objectif global de cette procédure est d’isoler la microglie corticale des nouveau-nés murins. Ceci est accompli en disséquant d’abord le tissu cérébral cortical des nouveau-nés de Muren. La deuxième étape consiste à cultiver des cultures mixtes de cellules gliales pendant 17 à 21 jours in vitro.

Ensuite, les microglies sont isolées de ces cultures gliales mixtes. La dernière étape consiste à placer des cellules microgliales dans des plaques de culture cellulaire pour des expériences ultérieures. En fin de compte, la microscopie d’immunofluorescence et Eliza sont utilisées pour montrer que ce protocole d’isolement préserve l’immunophénotype et la fonctionnalité de l’immunofluorescence microgliale.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les SEP impliqués dans la micro-microdissection sont difficiles à réaliser. L’exécution réussie de cette procédure nécessite à la fois rapidité et précision. C’est-à-dire qu’être trop lent réduira votre rendement cellulaire tandis qu’une élimination incomplète des méninges contaminera la culture gliale et entravera la croissance gliale.

Commencez par préparer le milieu complet de la microglie appelé MCM ci-après. Préparez une fiole par chiot et incubez-les pendant au moins une heure. Cette étape d’équilibrage est essentielle à la réussite.

Ensuite, préparez l’aliquote et réfrigérez sur de la glace. Tous les milieux requis aliquotent six millilitres de MCM pour chaque petit et réchauffent dans un bain-marie à 37 degrés Celsius avant la dissection. Essuyez le poste de travail à flux d’air horizontal et le microscope de dissection avec de l’éthanol à 70 %.

Ensuite, placez les outils chirurgicaux stérilisés nécessaires à la procédure dans la zone de travail. Préparez une boîte stérile avec un milieu de dissection pour capturer la tête et une autre pour la dissection. Versez le milieu de hachage dans son propre plat pour hacher le tissu cérébral.

Après la décapitation et l’extraction du cerveau, placez le cerveau fraîchement isolé sous un microscope de dissection pour visualiser les courtoisies, en vous assurant de garder le côté dorsal vers le haut et sec. Sécurisez le cerveau en insérant les pointes des pinces à l’intersection du mésencéphale et du cortex. Une fois en place, retirez complètement les méninges corticales dorsales.

Ensuite, retirez les méninges ventrales pour maximiser la pureté et le rendement de la microglie. Il est essentiel d’enlever complètement tout le tissu méningé. Séparez les cortex du reste du cerveau.

Assurez-vous d’enlever toutes les méninges corticales résiduelles qui peuvent être présentes sur la face ventrale ou médiale des cortex. Une fois le tissu méningé retiré, placez les cortex dans le plat de hachage préparé précédemment. En travaillant dans une enceinte de sécurité biologique de classe deux, utilisez des ciseaux pour hacher le tissu cérébral.

Transférez le tissu haché dans un tube conique de 15 millimètres. Rincez les ciseaux et le plat à hacher avec un millilitre de hachoir chacun pour maximiser les rendements. Prélevez et distribuez ces rinçages dans le tube conique de 15 millilitres contenant le tissu haché.

Laissez la suspension tissulaire intacte pendant une à deux minutes, permettant au tissu haché de se déposer au fond du tube. Après ce temps, retirez et jetez soigneusement deux millilitres de surnageant, en prenant soin de ne pas perturber le tissu haché déposé. Ajoutez trois millilitres de MCM préalablement chauffé au tissu haché, puis tripâtez le tissu avec force.

Aucun tissu solide discernable ne doit rester une fois l’analyse terminée. Ajoutez trois autres millilitres de MCM à l’aide de la même pointe de pipette pour prélever un échantillon trituré résiduel de la pointe. Une fois collectés, centrifugez le tissu haché pour granuler les cellules.

Une fois terminés, renvoyez les cellules granulées dans l’enceinte de sécurité biologique. Retirez et jetez soigneusement le surnageant. Ressuscite doucement.

Mettez en suspension la pastille cellulaire avec deux millilitres de MCM chaud, puis ajoutez la suspension cellulaire dans la fiole préparée précédemment. Incuber les cellules pendant 24 heures. Après 24 heures, tapotez doucement le flacon contre la paume de la main pour perturber les débris tissulaires.

Vérifiez les cellules avant et après le tapotement pour vous assurer que les débris sont complètement éliminés. Ensuite, remplacez le support par du MCM frais et remettez le flacon dans l’incubateur. Vérifiez les cellules quotidiennement pour surveiller la croissance et la contamination.

Après environ 17 à 21 jours, les cellules microgliales seront prêtes à être récoltées pour déterminer si les cellules sont prêtes, examinez-les sous un microscope à contraste de phase inversé. Les microglies sont prêtes à être récoltées. Lorsqu’elles ont atteint une fluidité d’environ 40 %, elles apparaissent sous la forme de petites cellules sphériques brillantes qui se développent comme une monocouche sur les autres.

Pour isoler, les microglies tapotent vigoureusement le ballon contre la paillasse du laboratoire. Cette agitation aide à séparer la microglie des autres cellules gliales en raison des faibles propriétés d’adhérence de la microglie. Scellez les bouchons du ballon avec du paraform et faites pivoter les cultures gliales mixtes à l’aide d’un agitateur rotatif non humidifié à température contrôlée pendant cinq heures.

Après ce temps, vérifiez visuellement que les microglies se sont détachées de la surface du flacon. À l’aide d’un microscope à contraste de phase inversé, les microglies sont des cellules brillantes, sphériques, flottantes librement. Il y aura une couche résiduelle d’astrocytes et d’oligodendrocytes adhérant au fond du flacon.

Ensuite, collectez le surnageant contenant la microglie dans un tube à centrifuger conique stérile et le palais. Resus. Suspendez la pastille microgliale dans un milieu de croissance microgliale chaud et déterminez la concentration cellulaire à l’aide d’une plaque d’hémocytomètre. Les cellules sur un format de plaque de 24 puits sur du plastique ou du verre stérile se recouvrent 24 heures plus tard.

Remplacez le support par du MGM frais et chaud pour éliminer les cellules flottantes et les débris. Cette étape est essentielle à la survie cellulaire et pour maintenir la microglie quiescente, les cellules microgliales sont prêtes à être expérimentées immédiatement après cette étape de réalimentation pour évaluer la pureté microgliale. Des cultures cellulaires dérivées de microglies exprimant de manière endogène la GFP ont été colorées pour l’antigène de macrophage IBA one et contre-colorées avec du dapi.

Afin de visualiser le noyau cellulaire, plus de 95 % des cellules présentaient une colocalisation de la GFP IBA one et du dpi. Après avoir défié les cellules avec le LPS, la microglie a adopté un changement morphologique brutal, passant d’un petit biphénotype à une forme amiboïde. La coloration immunophytochimique du P 65 met en évidence que, dans des conditions normales, le P 65 est localisé de manière diffuse dans tout le cytoplasme.

Alors qu’après une exposition de deux heures à Pam P 65, l’immunoréactivité a considérablement déplacé la localisation dans le noyau cellulaire pour confirmer que les microglies isolées conservaient leur fonctionnalité immunitaire biochimique. La sécrétion de la cytokine pro-inflammatoire TNF alpha a été déterminée après exposition au PAM ou au LPS. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler la microglie corticale des nouveau-nés miroirs pour obtenir les meilleurs résultats.

Il est important de maintenir une technique stérile et d’enlever soigneusement le tissu méningé de la région corticale disséquée.