Isolation des corticale microglie avec immunophénotype préservée et fonctionnalité De murins nouveau-nés

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des microglies corticales à partir de souriceaux. Cela est réalisé en effectuant d'abord une microdissection de tissu cérébral cortical provenant de souriceaux. La deuxième étape consiste à cultiver des cellules gliales mixtes pendant 17 à 21 jours in vitro.

Ensuite, les microglies sont isolées à partir de ces cultures gliales mixtes. La dernière étape consiste à ensemencer les cellules microgliales dans des plaques de culture cellulaire pour des expérimentations ultérieures. En fin de compte, la microscopie par immunofluorescence et le test Eliza sont utilisés pour démontrer que ce protocole d'isolement préserve le phénotype immunitaire et la fonctionnalité des microglies.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes impliquées dans la microdissection sont difficiles à réaliser. La réussite de cette procédure exige à la fois rapidité et précision. En effet, travailler trop lentement réduira le rendement cellulaire, tandis qu'une élimination incomplète des méninges contaminera la culture de cellules gliales et entravera leur croissance.

Commencez par préparer le milieu complet pour microglies, appelé par la suite MCM. Préparez un flacon par sourisuse et incubez-les pendant au moins une heure. Cette étape d'équilibration est essentielle pour réussir.

Ensuite, préparez des aliquotes et refroidissez-les sur de la glace. Pour chaque souriceau, prélevez une aliquote de six millilitres de MCM et réchauffez-la dans un bain-marie à 37 °C avant la dissection. Nettoyez la station de travail à flux laminaire et le microscope de dissection avec de l'éthanol à 70 %.

Placez ensuite les instruments chirurgicaux stérilisés nécessaires à la procédure dans la zone de travail. Préparez un plat stérile contenant un milieu de dissection pour recueillir la tête et un autre pour la dissection. Distribuez le milieu de hachage dans un plat séparé destiné au hachage du tissu cérébral.

Après la décapitation et l'extraction du cerveau, placer le cerveau fraîchement isolé sous un microscope stéréoscopique afin de visualiser les structures, en veillant à maintenir la face dorsale vers le haut et au sec. Fixer le cerveau en insérant les pointes de la pince dans l'intersection entre le mésencéphale et le cortex. Une fois en place, retirer complètement les méninges corticales dorsales.

Ensuite, retirez les méninges ventrales afin de maximiser la pureté et le rendement des microglies. Il est essentiel d'éliminer complètement tous les tissus méningés. Séparez les cortices du reste du cerveau.

Veillez à retirer toute méninge corticale résiduelle pouvant être présente sur la face ventrale ou médiale des corticaux. Une fois les tissus méningés retirés, placez les corticaux dans la boîte de hachage préparée précédemment. En travaillant dans une hotte de sécurité biologique de classe deux, utilisez des ciseaux pour hacher le tissu cérébral.

Transférez le tissu haché dans un tube conique de 15 millimètres. Rincez les ciseaux et le plat de hachage avec un millilitre de milieu de hachage chacun afin de maximiser les rendements. Récupérez et ajoutez ces rinçages dans le tube conique de 15 millilitres contenant le tissu haché.

Laisser le culot de tissu au repos pendant une à deux minutes, afin que le tissu haché sédimente au fond du tube. Au terme de ce temps, retirer soigneusement et jeter deux millilitres du surnageant, en prenant soin de ne pas perturber le tissu haché déposé. Ajouter trois millilitres du MCM préalablement réchauffé au tissu haché, puis homogénéiser vigoureusement le tissu.

Aucun tissu solide discernable ne devrait subsister une fois le tri terminé. Ajouter trois millilitres supplémentaires de MCM en utilisant la même pointe de pipette afin de recueillir l'échantillon triturer résiduel présent sur la pointe. Une fois recueilli, centrifuger le tissu haché pour former un culot cellulaire.

Lorsque l'opération est terminée, ramenez les cellules en culot dans la hotte de sécurité biologique. Retirez et jetez soigneusement le surnageant. Resuspendez délicatement.

Suspendre le culot cellulaire avec deux millilitres de MCM tiède, puis ajouter la suspension de cellules resuspendues au flacon préparé précédemment. Incuber les cellules pendant 24 heures. Après 24 heures, taper doucement le flacon contre la paume de la main pour rompre les débris tissulaires.

Vérifiez les cellules avant et après le tapotement pour vous assurer que les débris sont complètement éliminés. Ensuite, remplacez le milieu par du MCM frais et replacez le flacon dans l'incubateur. Vérifiez les cellules quotidiennement afin de surveiller la croissance et la contamination.

Après environ 17 à 21 jours, les cellules microgliales seront prêtes à être récoltées ; pour déterminer si les cellules sont prêtes, examinez-les au microscope inversé à contraste de phase. Les microglies sont prêtes à être récoltées lorsqu'elles ont atteint une confluence d'environ 40 %. Elles apparaissent alors comme de petites cellules sphériques brillantes, formant une monocouche au-dessus des autres cellules.

Pour isoler les microglies, tapez énergiquement le flacon contre le banc de laboratoire. Cette agitation aide à séparer les microglies des autres cellules gliales en raison des propriétés de faible adhérence des microglies. Scellez les bouchons du flacon avec du paraforme et faites tourner les cultures gliales mixtes à l’aide d’un agitateur rotatif non humidifié à température contrôlée pendant cinq heures.

Après ce délai, vérifiez visuellement que les microglies se sont détachées de la surface du flacon. Au microscope inversé à contraste de phase, les microglies apparaissent comme des cellules sphériques brillantes et en suspension libre. Une couche résiduelle d'astrocytes et d'oligodendrocytes adhérera au fond du flacon.

Ensuite, recueillir le surnageant contenant les microglies dans un tube conique stérile pour centrifugeuse et palette. Resus. Suspendre le culot de microglies dans un milieu de croissance chaud pour microglies et déterminer la concentration cellulaire à l’aide d’une lame de cytomètre sanguin. Les cellules sur un format de plaque 24 puits sur du plastique ou des lamelles en verre stériles 24 heures plus tard.

Remplacez le milieu par du MGM frais et tiède afin d'éliminer les cellules en suspension et les débris. Cette étape est essentielle à la survie cellulaire et au maintien des microglies quiescentes ; les cellules microgliales sont prêtes pour l'expérimentation immédiatement après cette relance pour évaluer la pureté microgliale. Les cultures cellulaires provenant de microglies exprimant endogènement la GFP ont été marquées pour l'antigène macrophagique IBA1 et contre-marquées avec le DAPI.

Afin de visualiser le noyau cellulaire, plus de 95 % des cellules ont présenté une colocalisation de la GFP IBA un et dpi. Après stimulation des cellules par le LPS, les microglies ont adopté un changement morphologique marqué, passant d'un phénotype bi de petite taille à une forme semblable à celle d'un amiboïde. La coloration immunohistochimique pour la P 65 montre que, dans des conditions normales, la P 65 est localisée de manière diffuse dans tout le cytoplasme.

Alors qu'après une exposition de deux heures à Pam P, l'immunoréactivité 65 a considérablement changé de localisation en se déplaçant vers le noyau cellulaire, confirmant ainsi que les microglies isolées conservaient leur fonctionnalité immuno-biochimique. La sécrétion de la cytokine pro-inflammatoire TNF alpha a été déterminée après exposition à PAM ou à LPS. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la méthode d'isolement des microglies corticales à partir de nouveau-nés, afin d'obtenir les meilleurs résultats.

Il est important de maintenir une technique stérile et d'éliminer complètement le tissu méningé de la région corticale disséquée.