Dissection et isolement de la glie murine de plusieurs régions du système nerveux central

Ce protocole est important car nous apprenons que les cellules gliales sont régionalement hétérogènes, morphologiquement, fonctionnellement et génétiquement. Le principal avantage de cette technique est que vous pouvez étudier trois sous-ensembles de cellules gliales distincts de quatre régions distinctes du système nerveux central. La démonstration de cette procédure sera faite par moi-même et Rachel Tinky, une étudiante diplômée de mon laboratoire.

À l’aide de ciseaux fins, coupez la couche cutanée le long de la ligne médiane de la tête du chiot, en commençant par la caudale et en se déplaçant vers le rostral jusqu’à ce qu’elle atteigne le museau. Évitez de couper profondément dans le crâne pour éviter tout dommage tissulaire. En inclinant la tête vers le bas, tirez la couche cutanée de chaque côté du crâne et utilisez des ciseaux à ressort pour faire une incision le long de la ligne médiane du crâne, en commençant par le foramen magnum.

Écartez les moitiés du crâne à l’aide d’une pince à pointe fine exposant le cortex, le cervelet et le tronc cérébral. Une fois exposé, soulevez doucement le cerveau du crâne et placez-le dans une boîte de Pétri de 10 centimètres avec 10 millilitres de PBS et une solution antibiotique. Assurez-vous que le cerveau reste intact avec le cerveau postérieur attaché.

Pincez le cervelet à l’aide d’une pince à pointe fine et incurvée. Placer dans un tube conique désigné de 15 millilitres sur de la glace. Séparez le mésencéphale du cortex.

Retirez les méninges corticales et placez-les dans un tube conique désigné. Le tissu doit être soigneusement examiné pour s’assurer de l’élimination complète des méninges. Si les cellules méningées restent dans la culture, elles peuvent nuire à la croissance des cellules gliales.

Pour disséquer la moelle épinière, placez-la ventrale vers le haut et utilisez des ciseaux à ressort fins pour couper les vertèbres, en alternant entre le côté gauche et le côté droit jusqu’à ce que le tissu de la moelle épinière soit exposé. Retirez délicatement la moelle épinière et les méninges et placez-les dans le tube conique désigné sur de la glace. Ajouter un millilitre de trypsine à 0,05 % avec 0,53 millimolaire d’EDTA dans chaque tube contenant du tissu.

Triturez le mélange avec une pipette de 10 millilitres environ 20 fois. Transférez ensuite la suspension cellulaire dans un tube conique vide de 50 millilitres. Incuber la solution à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 15 minutes.

Agiter doucement les lysats après huit minutes. Après l’incubation, ajoutez cinq millilitres de MGM et 200 microlitres de DNase I un dans chaque tube pour une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre. Triturez chaque lysat 10 fois avec une pipette de 10 millilitres.

Laissez ensuite la suspension cellulaire reposer pendant trois minutes à température ambiante pour permettre aux tissus non dissociés de se déposer au fond du tube. Transférez les suspensions cellulaires dans de nouveaux tubes coniques de 50 millilitres en laissant derrière eux le tissu non dissocié. Après la centrifugation, remettre en suspension la pastille cellulaire dans cinq millilitres de MGM et la triturer 20 fois Plaquez les suspensions cellulaires sur des flacons T25 enrobés et incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Changez de support après 24 heures pour éliminer les débris cellulaires. Pour effectuer l’isolement des cellules précurseurs d’oligodendrocytes, agitez les cellules pendant 15 heures, puis retirez le surnageant du ballon et placez-le sur une boîte de Pétri stérile. Incuber le surnageant à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes.

Agiter après 15 minutes pour éliminer la microglie restante. Retirez le surnageant cellulaire non adhérent, comptez les cellules et placez-les sur une surface recouverte de Poly-D-Lysine à la concentration souhaitée. Remettez les cellules dans l’incubateur pendant au moins une heure.

Ensuite, aspirez doucement 95 % du milieu et ajoutez lentement le milieu OPC chaud, en le pipetant contre la paroi du puits pour minimiser la perturbation des OPC. Cette méthode a été utilisée pour démontrer que la signalisation de l’interféron gamma influence la différenciation et la maturation des OPC. Sans le récepteur de l’interféron gamma, les OPC corticaux ne se différencient pas en oligodendrocytes myélinisants matures, ce qui est mis en évidence par l’absence de coloration MBP.

L’expression de GFAP a également été analysée. Les cellules déficientes en interféron gamma expriment fortement la GFAP, ce qui suggère qu’elles pourraient adopter un phénotype astrocytaire. L’hétérogénéité régionale des cellules du SNC est mise en évidence par la morphologie variable des astrocytes dans le cortex, le cervelet, le tronc cérébral et la moelle épinière.

Les astrocytes d’une même région peuvent également présenter une hétérogénéité morphologique, ce qui soutient l’idée que ce sous-type glial est très dynamique. Les réponses régionales des OPC à la stimulation différentielle des cytokines ont également été explorées. La signalisation des cytokines influence considérablement le comportement des cellules souches et immunitaires et peut avoir un impact sur la façon dont les OPC se différencient en oligodendrocytes myélinisants matures.

Suivant l’isolement régional des cellules gliales, les cellules peuvent être utilisées dans diverses conditions expérimentales et acides à l’aide de plusieurs techniques, notamment l’immunohistochimie, la PCR quantitative en temps réel et le Western blot.