Name: Régiosélective Biolistic ciblage dans les tranches de cerveau organotypique laide dun pistolet à gènes modifiés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Découvrez la transfection régiosélective par biolistique dans les tranches de cerveau organotypique à l'aide d'un pistolet à gènes modifié. Cette méthode permet de marquer et de manipuler génétiquement des régions cérébrales spécifiques avec précision.

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Les auteurs tiennent à remercier l’atelier MRC-LMB pour la production du canon de pistolet à gènes amélioré. Nous tenons également à remercier le Dr David R. Hampson de l’Université de Toronto pour l’utilisation de l’équipement et des ressources.

L’utilisation d’animaux et de tissus animaux doit strictement respecter l’approbation du comité d’éthique en vertu des règles et réglementations locales. Tous les tissus obtenus au cours de cette étude étaient conformes aux directives du MRC-LMB en matière d'expérimentation animale.
1. Préparation des matériaux et des milieux de culture
<ol>
	<li>Préparez toutes les solutions avec de l’eau Millipore ; utilisez uniquement des réactifs de qualité analytique. Préparez et stockez tous les réactifs chez RT (sauf indication contraire).</li>
	<li>Préparer 500 ml de solution saline tamponnée HEPES (10 mM HEPES, 120 mM NaCl pH 7,2). Filtrer à travers une unité de filtration stérile de 0,2 μm. Conserver à 4 °C.</li>
	<li>Préparez 500 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, pH 7,4). Stériliser à l’autoclavage.</li>
	<li>Préparez le milieu neuronal en complétant le DMEM (milieu d’aigle modifié de Dulbecco) avec 25 mM d’HEPES, 10 % de sérum de veau fœtal, 30 mM de glucose, un supplément de N2 1:100, 1 100 U/ml de pénicilline-streptomycine ; pH 7,2. Filtre avec une unité de filtration stérile de 0,2 μm. Conserver à 4 °C.</li>
	<li>Préparez une solution mère de polyvinylpyrrolidone (PVP) avec 20 mg de PVP dans 1 ml d’éthanol à 100 %. Aliquotez-le en quantités de 1 ml, congelez-le et conservez-le à -20 °C. La solution de travail est de 0,05 mg/ml, ajoutez donc 10 μl de solution mère PVP à chaque 4 ml d’éthanol à 100 %.</li>
	<li>Préparez une solution mère de spermidine 0,05 M dans de l’eau Millipore et ajustez le pH à 7,2.</li>
	<li>Préparez une solution d’agarose à 2 % dans du DMEM (2 g d’agarose de qualité électrophorèse dans 100 ml de DMEM dans un flacon à bouchon à vis stérilisé). Passez au micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose soit dissoute. Conserver au réfrigérateur à 4 °C pendant plusieurs semaines, si nécessaire.</li>
</ol>
2. Préparation des tranches organotypiques
<ol>
	<li>Euthanasier C57 Black 6 souris de l’âge désiré par asphyxie au CO2 suivie d’une décapitation. Retirez le cerveau à l’aide de coupes latérales du crâne commençant au foramen magnum et se terminant aux lobes olfactifs. Soulevez doucement le crâne par l’arrière pour exposer le cerveau.</li>
	<li>Coupe entre les lobes olfactifs et le cortex frontal, et rostrale au cervelet. Soulevez doucement la partie rostrale du cerveau et coupez les nerfs optiques. Enfin, retirez le cerveau et placez-le dans une boîte de Pétri remplie de solution saline glacée tamponnée à HEPES sur de la glace.</li>
	<li>À l’aide d’un microscope à dissection, retirez la lèvre à l’aide d’une pince fine ; retirez soigneusement les vaisseaux sanguins et les méninges autour du cerveau.</li>
	<li>Placez la cervelle fraîche dans un petit moule récepteur et couvrez-la avec la solution d’agarose refroidie légèrement au-dessus de RT. Refroidissez ensuite rapidement le moule à 4 °C en le posant sur de la glace. 
	REMARQUE : Traitez les tranches aussi rapidement que possible pour éviter la perte de viabilité.</li>
	<li>Lorsque l’agarose a pris (5 à 10 min), retirez le cerveau incrusté d’agarose du moule (coupez-le si nécessaire), puis collez-le sur la plate-forme du vibrosliceur. Placez-le dans une chambre de vibrotrancheuse contenant du PBS stérile glacé. Désinfectez la chambre de vibrotrancheuse avant de l’utiliser avec de l’éthanol à 70 % afin de minimiser les contaminations ultérieures.</li>
	<li>Coupez le cerveau à l’aide d’un vibrotrancheur construit sur mesure ou d’un équivalent commercial. Le concept du modèle était de concevoir une trancheuse à tissus capable de générer des mouvements de grande amplitude et à haute fréquence horizontalement jusqu’au bord de la lame tout en minimisant les vibrations verticales.</li>
	<li>Utilisez la fréquence d’oscillation de 90 Hz, à une amplitude de 1,5 à 2,0 mm, et la lame de coupe positionnée à un angle de 15° par rapport au plan horizontal ; réglez le bloc de montage tenant le cerveau nourri d’agarose pour qu’il se déplace à 1,7 mm/min vers la lame. Prélever des sections (150 μm) dans une chambre contenant un milieu de culture glacé (stylo DMEM/streptocoque + 10 % de FCS). Voir la coupe et la manipulation des coupes de tissu sous forme de vidéo supplémentaire dans Arsenault et O'Brien13.</li>
	<li>Placez délicatement les tranches dans des inserts de culture cellulaire (0,4 μm, 30 mm de diamètre) dans un plateau à 6 puits avec le milieu de culture à l’extérieur de l’insert, et incubez dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2, 
	REMARQUE : Pour une bonne viabilité des tissus, soyez extrêmement doux lors du transfert et de la manipulation des tranches. De plus, trop de liquide empêchera les tranches organotypiques d’adhérer à la membrane de l’insert filtrant. Si cela se produit, retirez à nouveau l’excès de liquide ou la plaque.</li>
	<li>Bien que les tranches organotypiques puissent être cultivées pendant quelques semaines, procéder à la transfection au plus tard 4 jours après le placage pour obtenir les meilleurs rendements de transfection. 
	REMARQUE : Pour éviter la prolifération gliale dans des conditions de culture à long terme, utilisez AraC ou un milieu sans sérum2.</li>
</ol>
3. Préparation de micro et nano-projectiles recouverts d’ADN
<ol>
	<li>Préparez des nano-projectiles à l’aide de particules d’or de 40 nm de diamètre. En bref, ajoutez 50 μl de spermidine 0,05 M et 10 μl d’ADN à 1 mg/ml (pEYFP-N1) à 10 mg de particules d’or.
	<ol>
		<li>Ajoutez du calcium et de la spermidine dans le mélange de solution pendant la préparation des microparticules d’ADN afin d’aider à la liaison des molécules d’ADN aux nanoparticules d’or. 
		REMARQUE : La quantité d’ADN utilisée par mg de supports d’or (DLR) doit se situer entre 1 et 5 μg d’ADN pour 1 mg d’or. De plus, la quantité de particules porteuses d’or qui seront tirées par cartouche (MLQ), devrait elle-même se situer entre 0,1 et 0,5 mg d’or. Le DLR et le MLQ doivent être essayés et optimisés pour chaque utilisateur en fonction du système particulier étudié ainsi que du type de pistolet à particules et de gènes utilisé.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mélanger à l’aide d’un vortex en ajoutant lentement 50 μl de 1 M de CaCl2 en fractions de 10 à 15 μl. Après 5 min de vortex occasionnel, centrifuger à 1 000 x g pendant 30 secondes puis retirer le surnageant. Remettre en suspension la pastille de particules d’or dans 3,5 ml de PVP 0,075 M.</li>
	<li>Aspirez cette suspension dans un tube (2,36 mm de diamètre intérieur) à l’aide d’une seringue. Placez le tube dans la station de préparation du tube. Laissez les particules d’or se déposer et éliminez le surnageant par aspiration à l’aide d’une seringue. Faites pivoter le tube pour répartir uniformément les particules d’or, qui ont ensuite été séchées sous un débit d’azote constant à raison de 5 L par minute.</li>
	<li>Pour créer des balles d’ADN, coupez le tube à l’aide d’un coupe-tube en longueurs de 1 cm. Insérez-le immédiatement dans la cartouche du pistolet à gènes ou conservez-le desséché (4 °C) jusqu’à ce que vous en ayez besoin.</li>
</ol>
4. Transfection biolistique sur tranches organotypiques
<ol>
	<li>Effectuez les étapes suivantes à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire stérile.</li>
	<li>Insérez une pile 9 V et un porte-cartouche vide dans le pistolet à gènes Helios.</li>
	<li>Fixez le pistolet à gènes au réservoir d’hélium avec le tuyau d’hélium. Tirez 2 à 3 blancs (fentes vides) à 50 psi pour pressuriser le tuyau d’hélium et les réservoirs du pistolet.</li>
	<li>Chargez les cartouches contenant l’or recouvert d’ADN dans les porte-cartouches et chargez le support dans le pistolet à gènes.</li>
	<li>Dévissez l’entretoise du pistolet à gènes et fixez le canon du pistolet à gènes modifiés au pistolet à gènes.</li>
	<li>À l’aide d’une pince stérile, placez un insert filtrant contenant la tranche organotypique dans un plat en plastique stérile.</li>
	<li>Retirer le milieu des tranches organotypiques.</li>
	<li>Réglez la pression du gaz à 50 psi. 
	REMARQUE : La protection oculaire est essentielle et la protection auditive conseillée.</li>
	<li>Placez le pistolet à gènes à la distance appropriée à l’aide du support mesuré à 10 mm. Dirigez soigneusement le centre du canon sur la région souhaitée pour l’administration génétique.</li>
	<li>Après la cuisson, replacez les inserts dans leur plat avec un milieu frais et remettez-les dans des conditions de croissance normales, c’est-à-dire 37 °C avec un incubateur à 5 % de CO2.</li>
	<li>Une fois terminé, fermez le réservoir d’hélium, relâchez la pression du pistolet à gènes et détachez le pistolet à gènes du réservoir d’hélium.</li>
	<li>Retirez le porte-cartouche et jetez les cartouches et nettoyez le pistolet à gènes.</li>
	<li>Vérifiez la morphologie du tissu et la pénétration réussie en visualisant les coupes à l’aide d’un microscope inversé. Si vous utilisez des microparticules, dispersez uniformément l’or ; Il ne doit pas y avoir de zones denses de particules d’or visibles sur la tranche. Les nanoparticules, en raison de leur petite taille, ne peuvent pas être considérées comme des unités uniques par les techniques de microscopie conventionnelles.</li>
	<li>Après l’intervalle de temps approprié (généralement 1 à 2 jours), fixez les tranches dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pour l’observation microscopique. 
	REMARQUE : La fixation en PFA n’est pas toujours souhaitée. Pour l’imagerie de cellules vivantes, évitez cette étape.</li>
</ol>
5. Fixation et visualisation des tranches de cerveau
<ol>
	<li>Après la transfection biolistique, laver les tranches deux fois dans du PBS pendant 2 min.</li>
	<li>Fixez les tranches en les incubant dans du PFA 4 % de PFA fraîchement préparé et glacé dans du PBS pendant 20 min.</li>
	<li>Lavez les tranches deux fois dans du PBS pendant 2 min.</li>
	<li>Découpez doucement autour des supports membranaires à l’aide d’un scalpel, sans déranger les tranches qui y sont montées. À l’aide d’une pince, placez chaque support de membrane/tranche sur une lame de microscope. Posez les tranches organotypiques sur la membrane sur la lame de verre.</li>
	<li>Ajoutez une goutte de support de montage sur le dessus de la tranche et ajoutez une lamelle doucement sans aucune force directement en contact avec la tranche organotypique.</li>
	<li>Fixez la lamelle avec une fine couche de vernis à ongles.</li>
	<li>Visualisez les coupes sur un microscope approprié.</li>
</ol>
6. Applications confocales
<ol>
	<li>Visualisez les coupes à l’aide d’un microscope confocal laser à balayage vertical équipé d’un objectif à immersion dans l’huile à ouverture numérique (NA) 60X/1,4. 
	REMARQUE : La caractéristique la plus problématique du microscope confocal est la taille du sténopé (fixée à 1 UA) qui est capable d'isoler et de collecter un plan de foyer, éliminant ainsi la « brume » floue normalement observée avec un échantillon fluorescent. Les détails fins sont souvent obscurcis par cette brume et ne peuvent pas être détectés par un microscope non confocal.</li>
	<li>Réglez le laser à argon sur une longueur d’onde d’excitation de 488 nm et optimisez la collecte de la lumière émise dans la bande de 500 à 520 nm. En règle générale, collectez des images à 1 024 x 1 024 pixels et avec des piles de sections z à des intervalles de 0,5 μm pour englober toute la largeur de chaque cellule nerveuse analysée.
	<ol>
		<li>Pour observer la morphologie du noyau, contre-colorez ces cellules avec du DAPI (longueur d’onde d’excitation fixée à 405 nm et lumière d’émission collectée entre 420 - 4 40 nm). Enfin, pour examiner la fluorescence rouge, réglez le laser à 561 nm pour l’excitation et à 565 - 620 nm pour l’émission.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>En règle générale, l’acquisition d’images à l’aide d’un zoom de balayage 4X couvrant une zone de 57,6 μm2 ; la taille des images était de l’ordre de 1 024 x 1 024 pixels. Enregistrez des piles de sections z à des intervalles de 0,5 μm et des projections de 5 à 8 images combinées.</li>
</ol>

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<li>Arsenault, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stapling+of+the+botulinum+type+A+protease+to+growth+factors+and+neuropeptides+allows+selective+targeting+of+neuroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Stapling of the botulinum type A protease to growth factors and neuropeptides allows selective targeting of neuroendocrine cells.</a> Journal of Neurochemistry. 126, 223-233 (2013).</li>
</ol>

Le Dr John A. O’Brien détient des brevets pour le canon amélioré du pistolet à gènes. Brevet américain numéro 10/380,452 et brevet européen numéro 01974517.3.

Le protocole décrit des approches pour administrer des colorants et du matériel génétique dans des coupes organotypiques adultes à l’aide d’un canon à gènes amélioré. Essentiellement, les types de colorants et la variété des gènes possibles rendent cette méthode multiforme et apte à répondre à un large éventail de questions biologiques. La méthode d'administration régiosélective utilisée, dans ce cas, à une région spécifique du cerveau, ouvre de nouvelles voies d'expérimentation, car la modulation génique hétérologue de zones localisées au sein d'une architecture biologiquement pertinente n'a pas été facilement réalisable auparavant. Nous avons précédemment déterminé que cette méthode peut être utilisée sur des coupes organotypiques adultes, où les synapses matures sont complètement formées, car elle a montré une amélioration de la survie cellulaire et de l’expression génique hétérologue pendant de nombreuses semaines13. Avec l’avènement de conditions de culture nouvelles et améliorées pour le cerveau des mammifères ainsi que pour d’autres tissus, l’utilisation de modulations génétiques régiosélectives deviendra de plus en plus utile pour une grande variété d’analyses biochimiques.
Comme nous le soulignerons ici et comme d’autres l’ont déjà mentionné24, de nombreux facteurs différents peuvent facilement affecter la précision et la fiabilité de l’administration biologique. Tout d’abord, la préparation de la particule d’or liée aux colorants ou à l’ADN doit être équilibrée de manière adéquate pour éviter l’agrégation et faciliter l’expulsion de la cargaison de la cartouche. Le calcium et la spermidine dans la solution de microparticules d’ADN-or peuvent aider à la liaison des molécules d’ADN aux nanoparticules d’or. La capacité des nanoparticules à pénétrer dans les cellules sous une pression réduite a été précédemment déterminée17. Deuxièmement, le pistolet à gènes doit être monté aussi stable que possible avec l’angle et la distance corrects. Un manomètre fiable est également nécessaire pour la reproductibilité, pour maintenir l’intégrité des tissus et pour accélérer correctement les particules d’or vers leurs cibles prévues. En effet, la distance, l’orientation et la stabilité de l’équipement sont également des facteurs cruciaux pour le ciblage et la précision de la livraison régiosélective. Comme ces structures cérébrales sont très petites, des variations mineures de l’angle de tir pourraient facilement rendre l’ensemble de la procédure moins fiable. Enfin, la préparation et la maintenance de coupes organotypiques viables ont été semées d’embûches pendant de nombreuses décennies, mais des protocoles abondants et fiables pour différents animaux, régions du cerveau, âges et cocultures sont actuellement disponibles2,4,25,26. Ces procédures doivent être optimisées pour l’utilisateur avant de soumettre les tissus à des procédures biolistiques. Cela permettra plus facilement à l’utilisateur de déterminer de manière impartiale l’impact des particules biolistiques et l’effet du gène hétérologue sur ses propres cultures. À cette fin, l’utilisation de gènes fluorescents tels que EYFP et EGFP peut à la fois permettre à un nouvel utilisateur de tester la précision du ciblage et de suivre la viabilité cellulaire par l’expression de gènes hétérologues sur une période prolongée13. De nombreuses étapes critiques pour une utilisation fiable et reproductible de ce protocole sont mises en évidence dans les trois paragraphes suivants.
Pour une transfection efficace, la concentration d’ADN doit être appropriée. Des concentrations trop faibles entraveraient le rendement de transfection, tandis que des concentrations trop élevées peuvent provoquer une agglomération des nanoparticules. Les agrégats d’or peuvent réduire considérablement l’efficacité de la transfection, provoquer des distributions inégales et entraîner une augmentation de la cytotoxicité et du stress oxydatif. Les problèmes d’efficacité de l’enrobage sont probablement dus à l’expiration de la solution de spermidine (doit être remplacée tous les 2 à 3 mois). Pour une propagation biologique adéquate, l’étiquetage doit être uniforme. Un marquage non homogène de la suspension de nanoparticules d’or/ADN peut être dû à la solution PVP. Il faut également le remplacer tous les 2 à 3 mois. Le revêtement des nanoparticules d’or peut être observé sur l’électrophorèse sur gel d’agarose comme une bande MW supérieurede 27.
Chaque système biologique étudié ainsi que chaque instrument utilisé peuvent nécessiter de petits changements de pression de gaz pour atteindre des niveaux optimisés de transfection et de propagation biologique. Le paramètre critique est la pression de l’impulsion d’hélium nécessaire pour extraire les micro ou nano-supports de la cartouche en plastique et les propulser dans le tissu. Une pression de gaz élevée affectera la survie cellulaire, car elle créera des ondes de choc à travers la cible et perturbera ou détachera le tissu de la matrice17. Il est important de viser le canon du pistolet à gènes et d’avoir l’appareil exactement perpendiculaire au tissu pour une administration biolistique précise. La zone sélectionnée doit être placée au centre direct du canon à précisément 10 mm de l’ouverture extérieure. Il en résulte un diamètre de 3 mm de livraison de particules d’or autour de l’épicentre. Le canon du pistolet à gènes doit être nettoyé avec de l’éthanol à 70 % après chaque utilisation. Pour protéger le tissu des gros agrégats de particules, le canon contient également une maille en nylon qui doit être remplacée régulièrement pour maintenir des performances optimales. Afin de remplacer la maille, dévissez le capuchon puis insérez une nouvelle maille en nylon entre le capuchon et le joint torique.
Les cellules marquées par fluorescence doivent être visibles au moins 1 à 2 jours après la transfection autour de l’épicentre. L’absence ou le désalignement de l’étiquetage peut résulter d’une préparation inadéquate et d’une instabilité du montage du canon à gènes. L’observation des cellules à l’aide de la microscopie confocale dépend d’un certain nombre de facteurs : la longueur d’onde de la lumière d’excitation/émission, la taille du sténopé, l’ouverture numérique de la lentille de l’objectif, l’indice de réfraction des composants dans le trajet de la lumière, la profondeur du tissu et l’alignement de l’instrument. Ces facteurs doivent être optimisés pour chaque système à l’étude.
Les progrès récents de la biolistique ont été exploités pour le succès de cette méthode. Le canon du pistolet à gènes utilisé dans cette étude a été modifié afin de réduire la pression nécessaire ainsi que de canaliser le modèle de diffusion biolistique dans une zone plus contrainte et spécifique17,19. D'autres modifications du canon ont tenté de restreindre la propagation biologique et de réduire la pression d'écoulement28 , mais ce canon de pistolet à gènes conçu sur mesure et conçu par le Dr O'Brien est un seul composant monté sur le pistolet à gènes Helios standard. Par la suite, des particules d’or submicrométriques ont été utilisées pour réduire le caractère invasif des particules micrométriques qui, selon nous, causaient des dommages cellulaires et, finalement, une perte d’expression génique hétérologue soutenue. Ces modifications apportées à la procédure biologique ont amélioré la faisabilité et la reproductibilité globales de la méthode13. D’autres améliorations apportées à la préparation des tranches, telles que le dépannage approfondi de la procédure de tranchage, l’utilisation d’une matrice DMEM-Agarose pour préserver le cerveau, et de nombreuses autres avancées utiles dans la préparation de coupes de cerveau organotypiques précédemment signalées13 nous ont permis d’explorer l’utilisation de tranches adultes qui ont développé des réseaux synaptiques matures.
Dans notre étude, nous avons principalement utilisé des colorants et des gènes hétérologues fluorescents pour visualiser la morphologie cellulaire comme une lecture de l’efficacité de la transfection et une capacité à imager les caractéristiques morphologiques des neurones dans les tissus cérébraux de souris. Le rapport signal sur bruit de la livraison stochastique dans un rayon défini nous a permis d'isoler complètement le port denttritique d'une seule cellule dans son contexte natif. Étant donné que de nombreux efforts sont déployés pour étudier ces caractéristiques morphologiques, cartographier la connectomique ou pour marquer des cellules uniques pour diverses analyses, cette méthode pourrait facilement être combinée avec des protocoles existants tels que l'électrophysiologie et les mesures de neurites29,30. De toute évidence, les combinaisons de gènes hétérologues fluorescents pourraient permettre une délimitation beaucoup plus robuste des cellules uniques comme la distribution stochastique des protéines fluorescentes, et leur combinaison déterminerait la couleur des cellules individuelles31,32. L’utilisation de promoteurs cellulaires spécifiques tels que la synapsine et la protéine d’acide fibrillaire glial en amont de l’exon du gène hétérologue peut également restreindre l’expression aux sous-populations33. En effet, la variété infinie du matériel génétique pourrait également être délivrée de manière régiosélective par des nanoparticules d’or en utilisant ce même procédé. Les régions transfectées totales pourraient ainsi être analysées avec des méthodes traditionnelles, telles que la dissection et la soumission de cette région à l’immunoblot occidental pour analyser l’effet localisé du gène hétérologue.
L’amélioration des procédures de coupe organotypique permettra également une utilisation plus large des tissus cérébraux pour l’expérimentation à long terme, ainsi que l’utilisation d’autres tissus et cocultures et facilitera les procédures de transfection. Il a déjà été rapporté que la transfection des lipides et des polymères affecte l’homéostasie membranaire, l’internalisation, la perméabilité aux protéines34 et montre souvent une très faible efficacité pour transfecter les neurones différenciés en phase terminale. Le ciblage de la cargaison spécifique aux cellules ne se prête également qu’aux cellules qui expriment les récepteurs de surface cellulaire nécessaires à l’internalisation, et bien que cette méthode puisse être très sélective, elle peut manquer de régiosélectivité ciblée35. Par ailleurs, les vecteurs viraux sont souvent difficiles et coûteux à produire, nécessitent des réglementations strictes et ont parfois démontré des problèmes de sécurité. L’administration biolistique a donc une capacité inégalée à transfecter de manière régiosélective des neurones et d’autres types de cellules dans des tissus viables. Comme l’or n’est pas toxique, d’autres progrès dans l’utilisation de la biolistique pourraient ouvrir la voie à des utilisations biomédicales telles que l’administration pharmaceutique transdermique, l’administration non invasive de gènes in vivo , ainsi que les thérapies géniques non virales localisées.

À l’origine, la technique biolistique, une tournure de phrase pour « balistique biologique », a été établie pour le transfert de gènes médié par des particules dans les cellules végétales1. Cette méthode physique de transformation cellulaire accélère les micro ou nanoparticules à grande vitesse pour surmonter les barrières physiques des membranes cellulaires imperméables afin de livrer des cargaisons telles que de l’ADN ou des colorants. Parce qu’il ne dépend pas de ligands-récepteurs spécifiques et/ou des propriétés biochimiques à la surface des membranes cellulaires, le transfert de gènes médié par les particules peut être facilement appliqué à une variété de systèmes biologiques tels que les coupes de cerveau organotypiques.
L’utilisation de coupes organotypiques présente des avantages par rapport aux autres plateformes in vitro car elles conservent de nombreuses propriétés anatomiques et biochimiques pertinentes pour la biologie in vivo 2-4. Les tranches conservent principalement les caractéristiques architecturales locales d’où elles proviennent et préservent l’activité neurochimique et la connectivité des synapses. L’utilisation de coupes de cerveau pour la recherche fondamentale et dans les entreprises pharmaceutiques a augmenté en même temps que le nombre de manipulations biotechnologiques possibles pour mesurer et surveiller les comportements neurobiologiques du cerveau dans un contexte de type in vivo 3,5-7. Les principaux avantages de l’utilisation de systèmes de dosage organotypiques basés sur des tranches sont qu’ils permettent un contrôle expérimental facile et des manipulations précises des environnements extracellulaires.
De manière fructueuse, des systèmes de culture en tranches organotypiques ont été établis à partir d’une variété de régions cérébrales telles que, mais sans s’y limiter, le cortex, la moelle épinière et le cervelet8-10. De plus, un certain nombre de cocultures ont été mises en évidence, qui permettent d’évaluer la communication intercellulaire entre les régions distales du cerveau ainsi qu’entre les neurones et les cellules pathologiques11,12. De nombreux protocoles ont déjà été établis pour cultiver avec succès des coupes organotypiques et peuvent maintenir la viabilité à long terme, et de nombreuses études récentes utilisent maintenant les méthodes d’interface membranaire et diverses modifications de celles-ci13. Ce principe permet de maintenir les tranches organotypiques à l'interface entre le milieu et l'atmosphère humidifiée de l'incubateur en plaçant les tranches sur un filtre à membrane poreuse. Le milieu peut ainsi fournir suffisamment de nutriments pour nourrir les tranches organotypiques par capillarité. Généralement, les tranches ont été préparées à partir d’animaux postnatals précoces (âgés de 3 à 9 jours ; P3 à 9). Cependant, les tissus cérébraux de ces tranches présentent un niveau élevé de plasticité cellulaire et une résistance inhérente aux stress mécaniques, ce qui est utile pour obtenir des cultures viables, mais les synapses matures et les circuits neuroanatomiques ne se sont pas complètement développés in vivo avant 2 à 3 semaines del’âge de 14 ans. Par exemple, des observations antérieures avaient montré que les coupes d’hippocampe obtenues à partir de nouveau-nés P0-1, bien que très viables après préparation, perdaient progressivement certaines caractéristiques morphologiques. Essentiellement, ils se sont révélés inadaptés aux cultures à long terme, ce qui suggère que les cellules immatures étaient plus susceptibles de se dédifférencier par rapport aux cultures organotypiques d’animaux plus âgés15,16. Pour cette raison, notre méthode a été optimisée pour les coupes de cerveau organotypiques adultes où la maturation et le développement architectural ont atteint leurs stades terminaux13,17-21. Néanmoins, cette méthode convient également aux tranches organotypiques de nouveau-nés et de juvéniles.
Une fois que les tranches organotypiques viables ont été produites, la plaque entière contenant les tranches peut être amenée à la monture biolistique et soumise à une administration régiosélective et à une transfection. Le montage correct du canon à gènes (tel que décrit à la figure 1), orienté à 90° à une distance de 10 mm directement au-dessus des tranches (de l’ouverture au tissu), permet l’administration biolistique rapide des cargaisons recouvertes de particules d’or de 40 nm. Ces cargaisons telles que les colorants et les vecteurs d’ADN fluorescents, ainsi que tout gène d’intérêt, sont facilement délivrées dans les tranches viables. Cette méthode décrit ainsi le protocole nécessaire pour livrer, de manière régiosélective, des nanoparticules d’or enrobées de cargaison en tranches de cerveau organotypiques viables. Le canon du pistolet à gènes et le montage optimal peuvent être vus sur la figure 1. Pour plus d'informations sur le canon amélioré et la balistique des nanoparticules, veuillez consulter O'Brien, et al.17. Aéroport
Les raffinements ultérieurs sont également indiqués à l’utilisateur pour optimiser des conditions telles que la quantité appropriée d’or délivrée par zone cible, définie comme la quantité de charge de microporteur (MLQ), et pour déterminer la quantité d’ADN chargée par mg d’or, définie comme le taux de charge d’ADN (DLR). Avant de précipiter l'ADN sur des particules d'or et de les charger dans le tube de Tefzel qui comprend les véritables « cartouches » du pistolet à gènes, il est nécessaire de calculer la quantité d'ADN et d'or nécessaire pour chaque transfection qui peut différer légèrement selon les tissus et les conditions (le rapport doit être maintenu entre 1 mg d'or et 1 μg d'ADN à 1:5). Il est essentiel de préparer la proportion appropriée de MLQ par rapport au DLR, sinon les particules d’or recouvertes d’ADN pourraient adhérer ensemble pour former une agglomération plus grande que prévu, ce qui pourrait réduire l’homogénéité globale de la propagation biologique et augmenter les lésions tissulaires et la cytotoxicité.
Cette méthode montre les améliorations récentes de l’administration biolistique, qui ont été testées et jugées acceptables pour les coupes de cerveau organotypique néonatal, juvénile et adulte. De plus, en exploitant la propagation biolistique réduite du canon du pistolet à gènes, l'utilisateur est désormais capable de transfecter sélectivement une région ponctuelle du cerveau. Après le temps d’incubation approprié, l’expression des protéines fluorescentes, qui atteint ses taux maximaux entre 24 et 48 heures, peut être visualisée par épifluorescence et microscopie confocale. Ces fluorophores permettent l’analyse morphologique et la localisation de cellules individuelles dans des structures biologiquement pertinentes. Cependant, la modulation régiosélective des coupes organotypiques par d’autres gènes hétérologues peut également être surveillée par tout autre test se prêtant à ces préparations. Les stratégies de travail possibles pour l’administration localisée des gènes sont présentées à la figure 2.

<table><tbody><tr><td>Système de pistolet à gènes Helios</td><td>Bio Rad</td><td>165-2431</td><td>Station de préparation de pistolets à gènes et de tubes</td></tr><tr><td>HEPES&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>83264-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-250G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S7907-100G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P9791-100G</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &micro ; m unité de filtration stérile</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>à média filtrant</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Gibco</td><td>10270-098</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Sigma</td><td>p4333</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidone</td><td>Sigma</td><td>856568-100G</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>277649-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bio Rad</td><td>161-3100EDU</td><td></td></tr><tr><td>Vibroslicer</td><td>Laica</td><td>VT1200</td><td>Nous avons utilisé une conception personnalisée</td></tr><tr><td>Support</td><td></td><td></td> de pistolet à gènes <td>Construit en interne à l’Université de Toronto</td></tr><tr><td>Incubateur de culture cellulaire humidifié Nanoparticules</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>d’or</td><td>cytodiagnostic</td><td>G-40-20</td><td></td></tr><tr><td>pEYFP-N1</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coupe-tube</td><td>Bio Rad</td><td>165-2422</td><td></td></tr><tr><td>Tube en tefzel</td><td>Bio Rad</td><td>165-2441</td><td></td></tr><tr><td>Cylindre</td><td></td><td></td><td>Fabriqué sur mesure par le LMB</td></tr><tr><td>Insert de culture cellulaire</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>76240 Fluka</td><td></td></tr><tr>Microscope <td></td><td></td><td>de dissection</td><td>pour plus de commodité</td></tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td></td> confocal <td>défini par l’utilisateur pour l’utilisation</td></tr><tr><td>Lame de verre</td><td>VWR</td><td>2588-CA48323-185</td><td></td></tr><tr><td>Verre Microcover</td><td>VWR</td><td>2448-CA48366-067-1</td><td></td></tr><tr><td>Média de montage Vectashield</td><td>Vector laboratories</td><td>H-1400&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td></tr></tbody></table>

régiosélective biolistic ciblage dans les tranches de cerveau organotypique l&#39;aide d&#39;un pistolet à gènes modifiés

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Transfection d&#39;ADN a été inestimable pour les sciences biologiques et les progrès récents à organotypiques préparations de tranches de cerveau, l&#39;effet de divers gènes hétérologues pourrait donc être étudiée facilement tout en conservant de nombreux aspects de la biologie in vivo. Il a un intérêt croissant pour la transfection de neurones différenciées pour lesquels les méthodes classiques de transfection ont été nombreuses difficultés telles que de faibles rendements et des pertes importantes de viabilité. Transfection biolistique peut contourner la plupart de ces difficultés encore que récemment a été modifié cette technique de sorte qu&#39;il se prête à une utilisation dans des tissus de mammifères. Les nouvelles modifications apportées à la chambre de l&#39;accélérateur ont amélioré la précision de tir du canon à gènes et l&#39;augmentation de ses profondeurs de pénétration tout en permettant l&#39;utilisation de basse pression de gaz (50 psi) sans perte d&#39;efficacité de transfection ainsi que de permettre une propagation régiosélective ciblée de la paARTICLES à moins de 3 mm. En outre, cette technique est simple et rapide à réaliser que microinjections fastidieuses. Les deux transitoire et l&#39;expression stable est possible avec des nanoparticules bombardement où l&#39;expression épisomique peut être détecté dans les 24 heures et la survie des cellules a été montré pour être supérieur ou au moins égal à des méthodes classiques. Cette technique présente cependant un avantage essentiel: il permet la transfection d&#39;être localisées dans un seul rayon de retenue permettant ainsi à l&#39;utilisateur d&#39;isoler les effets de l&#39;anatomie du gène hétérologue. Nous présentons ici un protocole en profondeur pour préparer adultes viable tranches organotypiques et les soumettre à RÉGIOSÉLECTIVE transfection en utilisant un canon à gènes améliorée.

La viabilité des tranches organotypiques peut être surveillée par l'activité de la lactate déshydrogénase, l'étiquetage par l'iodure de propidium et la coloration au dUTP, comme cela a été rapporté précédemment13,22. Il est évident que la viabilité et l'intégrité des tranches sont importantes pour l'expression prolongée du matériel génétique transféré. Après la livraison biobalistique dans les tranches organotypiques, l'expression du gène hétérologue fluorescent a été suivie par microscopie confocale. La précision du dépôt biobalistique obtenue avec le barillet modifié est visible sur la figure 3A. La figure 3B montre une image représentative de la région de l'hippocampe transfectée à l'aide de nanoparticules d'or revêtues d'ADN. La figure 4 présente des images représentatives de tranches organotypiques adultes de souris transfectées. Comme on peut le voir sur la figure 4A, un neurone de Purkinje doté d'un arborisation dendritique remarquable, localisé à l'interface entre la couche des cellules de Purkinje et la couche moléculaire du cervelet, présente une marquage intense après une transfection biobalistique transitoire avec le vecteur pEGFP-N1. La figure 4B montre un agrandissement de ces dendrites, où l'on peut observer des épines dendritiques. La figure 4C illustre une cellule pyramidale située dans la région CA1 de l'hippocampe après livraison biobalistique de nanoparticules d'or revêtues de pDSredFP.
Des colorants, au lieu de cargaisons d'ADN marqués par fluorescence, peuvent également être utilisés de manière similaire pour visualiser les caractéristiques morphologiques dans des tranches organotypiques. Le DiO, qui marque les membranes plasmiques, permet de délimiter plus rapidement les morphologies cellulaires individuelles ou peut être utilisé conjointement avec un vecteur biolistique revêtu d'ADN délivré à la même région afin de confirmer la sélection régionale. Comme on peut le voir dans Figure 5A, un neurone marqué au DiO dans l'hippocampe présente également de longs dendrites dotés de nombreuses épines. Une flèche indique l'axone, identifié par la présence de boutons synaptiques, en comparaison avec les épines dendritiques présentes sur les autres neurites. Figure 5B montre un autre exemple dans le CA1, mettant en évidence de nombreuses projections hippocampiques avec une contre-coloration au DAPI afin de marquer le noyau. Figure 5C présente une amplification plus élevée de ce type de dendrites parallèles portant de nombreuses épines.
Il est évident que ces images illustrent les caractéristiques morphologiques après l'étiquetage cellulaire. Rien n'empêche d'appliquer la même méthodologie pour délivrer un nombre quelconque de gènes exogènes revêtus de nanoparticules d'or. Afin de permettre une confirmation visuelle d'une transfection réussie, un seul plasmide peut être conçu pour coexprimer à la fois le gène d'intérêt et une protéine rapporteur fluorescente sur le même vecteur.
<img alt="Installation de forage ultrasonique ; schéma et expérience ; traitement des échantillons minéraux ; forage de précision." src="/files/ftp_upload/52148/52148fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1. Canon du gène et montage. (A) Le canon amélioré mis au point par le Dr O'Brien au MRC-LMB, qui présente une dispersion biobalistique restreinte permettant de minimiser les dommages tissulaires en réduisant la pression nécessaire à l'accélération des particules. (B) Vue latérale d'un montage optimisé de canon à gènes conçu par le Dr Henderson et le Dr Andras Nagy à l'Université de Toronto. Ce support maintient le canon à gènes exactement à 90˚, perpendiculairement aux tranches organotypiques, tout en permettant à l'utilisateur de contrôler précisément la distance de livraison biobalistique. Pour des conditions biobalistiques optimales, l'ouverture du canon doit être placée directement au-dessus de la région d'intérêt, à une distance de 10 mm des tranches organotypiques. (C) Vue arrière du montage du canon à gènes. La région d'intérêt à transfecter doit être positionnée directement sous l'ouverture du canon. Le ciblage peut être confirmé à l'aide d'un colorant (diolistique) ou d'une transfection par protéine fluorescente (biolistique). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Processus de clarification des tissus cérébraux, dispositif d'imagerie avec cerveau dans l'hydrogel, analyse par diagramme de coupe transversale." src="/files/ftp_upload/52148/52148fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2. Préparation de tranches organotypiques et ciblage régiosélectif. (A) Un cerveau de souris adulte inclus dans du DMEM, prêt à être tranché. (B) Le moule a été collé sur le support du vibrotrancheur, la lame étant prête à couper une tranche. (C) Stratégies de ciblage régiosélectif de l'expression hétérologue de gènes par livraison biolistique dans des tranches cérébrales organotypiques coronales. Images préparées à partir de clichés provenant de l'atlas de référence anatomique Allen Brain Atlas23. Le panneau gauche illustre deux régions cérébrales différentes ciblées à titre d'exemple : (1) restreindre l'expression du gène à la région corticale de l'hémisphère gauche ; (2) restreindre l'expression hétérologue du gène à la région de l'hypothalamus du cerveau. Le panneau central montre que l'expression de deux gènes hétérologues (3 et 4) peut être isolée, permettant de comparer l'hippocampe des deux hémisphères au sein d'une même tranche organotypique, éliminant ainsi tout biais lié à l'utilisation de sections différentes et/ou offrant la possibilité d'étudier une communication croisée distale induite par ces gènes. Le panneau droit illustre le chevauchement possible d'une livraison transgénique permettant d'exprimer le premier gène (5) dans une région corticale précise, tout en exprimant un autre gène (6) dans une région corticale distincte mais partiellement superposée. Ceci permet d'analyser l'effet de la modulation génétique de chaque gène hétérologue séparément, ainsi que leur effet combiné au sein d'une même tranche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Microscopie de la différenciation neuronale ; panneau A : stades cellulaires, panneau B : immunofluorescence, réseau neuronal." src="/files/ftp_upload/52148/52148fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3. Motif de dispersion observé par biolistique sur papier filtre et image à faible grossissement. (A) Le canon amélioré a été tiré sur du papier filtre afin de déterminer la dispersion des particules d'or. Le côté gauche montre la distribution obtenue avec le canon amélioré, tandis que le panneau droit montre celle du canon standard. Barre noire : 1 cm. Image extraite de O'Brien, et al.17. (B) Image à faible grossissement montrant le motif stochastique de transfection dans la zone de dispersion biolistique de 3 mm au sein de la région hippocampique de souris âgées de 6 semaines. Barre blanche : 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Morphologie neuronale, dendrites marqués sur des images de microscopie, visualisation des structures neuronales." src="/files/ftp_upload/52148/52148fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Figure 4. Livraison biolistique d'ADN codant pour une protéine fluorescente dans des tranches organotypiques de souris âgées de 6 semaines. (A) Images confocales inversées d'une tranche organotypique fixée du cervelet d'une cellule de Purkinje transfetée avec des particules d'or revêtues de pEGFP-N1. L'image a été prise avec un grossissement de 40X. Barre noire : 30 µm. (B) Montre un grossissement de 60X du réseau dendritique d'une autre cellule de Purkinje afin de mettre en évidence les épines dendritiques. Barre noire : 5 µm. (C) Présente une image confocale de tranches fixées provenant de la région hippocampique, à un grossissement de 60X, montrant quatre cellules pyramidales transfectées avec DSredFP. Barre noire : 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Structure des dendrites neuronales, image de microscopie à fluorescence, mettant en évidence les connexions et les ramifications neuronales." src="/files/ftp_upload/52148/52148fig5highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5. Livraison diolistique de colorants fluorescents marquant la membrane dans des tranches organotypiques. (A) montre l'imagerie en direct d'un neurone hippocampique marqué avec DiO en 20X d'agrandissement. Les épines dendritiques peuvent être clairement observées, ainsi que l'axone, identifié par l'absence d'épines dendritiques et la présence de boutons synaptiques indiqués par une flèche blanche. Barre blanche : 30 µm. (B) Coloration marquée de la région hippocampique marquée avec DiO et contre-colorée avec DAPI. Barre blanche : 30 µm. (C) Agrandissement plus élevé (60x) des épines dendritiques présentes dans la région CA1 de l'hippocampe. Barre blanche : 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>

Les améliorations récentes apportées aux préparations de coupes de cerveau organotypiques ont permis de les exploiter pour des applications biotechnologiques. Les coupes organotypiques conservent les caractéristiques structurelles locales de la biologie in vivo, y compris les connexions synaptiques fonctionnelles. Nous présentons ici une méthode d’administration biolistique régiosélective pour étiqueter et manipuler génétiquement ces tranches.

Régiosélective Biolistic ciblage dans les tranches de cerveau organotypique l&#39;aide d&#39;un pistolet à gènes modifiés

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

Le but de cette procédure est de transfecter ou d’étiqueter rapidement et efficacement des régions distinctes de coupes organotypiques à l’aide d’un pistolet à gènes. Ceci est accompli en préparant d’abord des coupes organotypiques viables du cerveau ou d’autres tissus. La deuxième étape consiste à produire de l’ADN ou des particules d’or décodées pour l’administration biotique.Ensuite, la tranche organotypique est placée sous un support de pistolet à gènes stabilisé et les particules enrobées sont tirées dans le tissu ou par transformation épisomale ou marquage. La dernière étape consiste à observer ou à analyser l’effet des gènes hétérologues délivrés dans les régions isolées. En fin de compte, cette approche permet à l’utilisateur de transfecter avec précision des régions distinctes des coupes d’organe avec divers gènes hétérologues.Le principal avantage de cette méthode par rapport aux méthodes existantes est que la biologistique permet au transfecteur de différencier les cellules en phase terminale, tout en limitant le rayon d’action à un petit diamètre. Cette méthode peut aider à comprendre des questions neurobiologiques clés, telles que la compréhension de la contribution régionale d’un seul gène. Commencez cette procédure en plaçant un cerveau frais dans un petit moule récepteur.Couvrez-le avec la solution ARO, qui a été appelée légèrement au-dessus de la température ambiante. Ensuite, refroidissez rapidement le moule à quatre degrés Celsius en le plaçant sur de la glace. Lorsque l’aros s’est fixé.Après cinq à 10 minutes, retirez le cerveau intégré à l’aros du moule. Après cela, collez-le sur la plate-forme de la trancheuse fibro. Transférez ensuite la plate-forme dans la chambre de la trancheuse Vibra contenant du PBS stérile glacé.Après le tranchage, placez délicatement les tranches sur les inserts de culture cellulaire dans un plateau à six puits avec un milieu de culture à l’extérieur de l’insert. Incuber-les dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Dans cette procédure, préparez les nanoprojectiles à l’aide de particules d’or de 40 nanomètres de diamètre en ajoutant d’abord 50 microlitres de 0,05 molaire de spermatozoïdes et 10 microlitres d’ADN à raison d’un milligramme par millilitre à 10 milligrammes de particules d’or.Ajoutez ensuite du chlorure de calcium dans le mélange de solution pour faciliter la liaison des molécules d’ADN aux nanoparticules d’or. Ensuite, aspirez la solution dans le tube à l’aide d’une seringue. Placez le tube dans la station de préparation du tube.Laissez les particules d’or se déposer. Retirez ensuite le supinat par aspiration à l’aide d’une seringue. Faites pivoter le tube pour répartir uniformément les particules d’or.Ensuite, séchez les particules sous un flux constant d’azote à cinq litres par minute. Pour créer des balles d’ADN, coupez le tube en morceaux d’un centimètre à l’aide d’un coupe-tube. Ensuite, insérez-les immédiatement dans la cartouche génétiquement cultivée ou maintenez-les desséchés à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient utilisés dans une hotte stérile à lamina, chargez la cartouche contenant l’or enrobé d’ADN dans le porte-cartouche.Chargez ensuite le support dans le pistolet à gènes. Fixez-y le canon du pistolet à gènes modifiés à l’aide d’une pince stérile. Placez un insert filtrant contenant une tranche organotypique dans un plat en plastique stérile.Retirez le support de la tranche organotypique. Ensuite, réglez la pression du gaz à 50 PSI à l’aide du support. Placez le pistolet à gènes à une distance de 10 millimètres au-dessus de la région souhaitée de la tranche pour l’administration génétique.Ensuite, visez soigneusement le centre du canon et tirez les particules enrobées dans le tissu. Après la transfection biotique, lavez doucement la tranche deux fois avec du PBS. Fixez ensuite la tranche en l’incubant dans du PFA glacé à 4 % dans du PBS pendant 20 minutes.Après cela, lavez la tranche deux fois dans du PBS. Encore une fois, coupez doucement la membrane de l’insert à l’aide d’un scalpel sans déranger la tranche. Placez ensuite le support de membrane sur une lame de microscope à l’aide d’une pince et laissez reposer la tranche organotypique dessus.Ensuite, ajoutez une goutte de support de montage sur la tranche. Placez doucement une lamelle sans aucune force directement en contact avec le tissu. Ensuite, fixez la lamelle avec une fine couche de vernis à ongles.Cette figure montre l’administration biotique d’ADN codé par une protéine fluorescente dans la tranche organotypique d’une souris âgée de six semaines. Comme on peut le voir ici, un neurone bikini avec un port dendritique remarquable trouvé à l’interface de la couche bikini et de la couche moléculaire du cervelet montre un marquage prononcé après une transfection biotique transitoire avec P-E-G-F-P-N one. Voici un grossissement plus élevé des dendrites avec les épines, et voici une cellule paramétallique trouvée dans la région environ un de l’hippocampe.Suite à l’administration biotique de nanoparticules d’or enrobées de PDS Red FP Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en seulement quelques heures sur la période de trois à quatre jours suivant cette procédure. D’autres méthodes telles que la microscopie confocale peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires telles que la façon dont certains neurones sont connectés à des régions voisines.

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Régiosélective Biolistic ciblage dans les tranches de cerveau organotypique l'aide d'un pistolet à gènes modifiés

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