Régiosélective Biolistic ciblage dans les tranches de cerveau organotypique l'aide d'un pistolet à gènes modifiés

Le but de cette procédure est de transfecter ou d’étiqueter rapidement et efficacement des régions distinctes de coupes organotypiques à l’aide d’un pistolet à gènes. Ceci est accompli en préparant d’abord des coupes organotypiques viables du cerveau ou d’autres tissus. La deuxième étape consiste à produire de l’ADN ou des particules d’or décodées pour l’administration biotique.

Ensuite, la tranche organotypique est placée sous un support de pistolet à gènes stabilisé et les particules enrobées sont tirées dans le tissu ou par transformation épisomale ou marquage. La dernière étape consiste à observer ou à analyser l’effet des gènes hétérologues délivrés dans les régions isolées. En fin de compte, cette approche permet à l’utilisateur de transfecter avec précision des régions distinctes des coupes d’organe avec divers gènes hétérologues.

Le principal avantage de cette méthode par rapport aux méthodes existantes est que la biologistique permet au transfecteur de différencier les cellules en phase terminale, tout en limitant le rayon d’action à un petit diamètre. Cette méthode peut aider à comprendre des questions neurobiologiques clés, telles que la compréhension de la contribution régionale d’un seul gène. Commencez cette procédure en plaçant un cerveau frais dans un petit moule récepteur.

Couvrez-le avec la solution ARO, qui a été appelée légèrement au-dessus de la température ambiante. Ensuite, refroidissez rapidement le moule à quatre degrés Celsius en le plaçant sur de la glace. Lorsque l’aros s’est fixé.

Après cinq à 10 minutes, retirez le cerveau intégré à l’aros du moule. Après cela, collez-le sur la plate-forme de la trancheuse fibro. Transférez ensuite la plate-forme dans la chambre de la trancheuse Vibra contenant du PBS stérile glacé.

Après le tranchage, placez délicatement les tranches sur les inserts de culture cellulaire dans un plateau à six puits avec un milieu de culture à l’extérieur de l’insert. Incuber-les dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Dans cette procédure, préparez les nanoprojectiles à l’aide de particules d’or de 40 nanomètres de diamètre en ajoutant d’abord 50 microlitres de 0,05 molaire de spermatozoïdes et 10 microlitres d’ADN à raison d’un milligramme par millilitre à 10 milligrammes de particules d’or.

Ajoutez ensuite du chlorure de calcium dans le mélange de solution pour faciliter la liaison des molécules d’ADN aux nanoparticules d’or. Ensuite, aspirez la solution dans le tube à l’aide d’une seringue. Placez le tube dans la station de préparation du tube.

Laissez les particules d’or se déposer. Retirez ensuite le supinat par aspiration à l’aide d’une seringue. Faites pivoter le tube pour répartir uniformément les particules d’or.

Ensuite, séchez les particules sous un flux constant d’azote à cinq litres par minute. Pour créer des balles d’ADN, coupez le tube en morceaux d’un centimètre à l’aide d’un coupe-tube. Ensuite, insérez-les immédiatement dans la cartouche génétiquement cultivée ou maintenez-les desséchés à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient utilisés dans une hotte stérile à lamina, chargez la cartouche contenant l’or enrobé d’ADN dans le porte-cartouche.

Chargez ensuite le support dans le pistolet à gènes. Fixez-y le canon du pistolet à gènes modifiés à l’aide d’une pince stérile. Placez un insert filtrant contenant une tranche organotypique dans un plat en plastique stérile.

Retirez le support de la tranche organotypique. Ensuite, réglez la pression du gaz à 50 PSI à l’aide du support. Placez le pistolet à gènes à une distance de 10 millimètres au-dessus de la région souhaitée de la tranche pour l’administration génétique.

Ensuite, visez soigneusement le centre du canon et tirez les particules enrobées dans le tissu. Après la transfection biotique, lavez doucement la tranche deux fois avec du PBS. Fixez ensuite la tranche en l’incubant dans du PFA glacé à 4 % dans du PBS pendant 20 minutes.

Après cela, lavez la tranche deux fois dans du PBS. Encore une fois, coupez doucement la membrane de l’insert à l’aide d’un scalpel sans déranger la tranche. Placez ensuite le support de membrane sur une lame de microscope à l’aide d’une pince et laissez reposer la tranche organotypique dessus.

Ensuite, ajoutez une goutte de support de montage sur la tranche. Placez doucement une lamelle sans aucune force directement en contact avec le tissu. Ensuite, fixez la lamelle avec une fine couche de vernis à ongles.

Cette figure montre l’administration biotique d’ADN codé par une protéine fluorescente dans la tranche organotypique d’une souris âgée de six semaines. Comme on peut le voir ici, un neurone bikini avec un port dendritique remarquable trouvé à l’interface de la couche bikini et de la couche moléculaire du cervelet montre un marquage prononcé après une transfection biotique transitoire avec P-E-G-F-P-N one. Voici un grossissement plus élevé des dendrites avec les épines, et voici une cellule paramétallique trouvée dans la région environ un de l’hippocampe.

Suite à l’administration biotique de nanoparticules d’or enrobées de PDS Red FP Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en seulement quelques heures sur la période de trois à quatre jours suivant cette procédure. D’autres méthodes telles que la microscopie confocale peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires telles que la façon dont certains neurones sont connectés à des régions voisines.