Une méthode hybride d'extraction d'ADN pour l'évaluation qualitative et quantitative des communautés bactériennes de la volaille Échantillons de production

L’objectif général de l’expérience suivante est de mettre au point une nouvelle technique d’extraction de l’ADN qui combine l’homogénéisation mécanique de l’ADN avec l’élimination des inhibiteurs de PCR et la méthode d’extraction somatique de référence sur des échantillons environnementaux le long du continuum de production de volaille. Pour ce faire, on divise d’abord un échantillon environnemental dans des microtubes à centrifuger contenant un mélange de billes afin d’homogénéiser efficacement les échantillons environnementaux complexes. La deuxième étape consiste à placer les tubes dans un homogénéisateur à haute puissance pour libérer efficacement les acides nucléiques des cellules bactériennes et de la matrice environnementale.

Ensuite, l’homogénat est utilisé comme matériau de départ pour la méthode d’extraction enzymatique de l’ADN de référence par la phase de liaison à l’inhibition de la PCR. La dernière étape consiste à placer les échantillons dans un poste de travail robotisé d’extraction d’ADN afin de fournir à l’utilisateur des échantillons d’ADN extraits se prêtant à une multitude d’applications en aval, en fin de compte, la PCR quantitative et l’analyse du microbiome à l’aide de la plate-forme MiSeq en aluminium, ont été utilisées pour montrer que cette nouvelle méthode hybride offre la meilleure combinaison d’évaluations qualitatives et quantitatives des communautés bactériennes totales par rapport au traitement des échantillons avec la méthode d’extraction mécanique ou enzymatique seul. Cette méthode donne un aperçu de l’analyse des communautés microbiennes le long du continuum de production avicole, mais elle peut également être appliquée à d’autres systèmes agricoles tels que les porcs, les bovins ou la production végétale contenant des échantillons environnementaux tout aussi complexes.

La démonstration de cette procédure aujourd’hui sera faite par Kaitlyn Griffin, une étudiante de mon laboratoire. Pour commencer l’expérience, réglez un bain-marie à 95 degrés Celsius. Ensuite, pesez trois répétitions de 0,33 gramme pour analyser un total d’un gramme de température ambiante, de sol ou de matières fécales dans une matrice de lyse de deux millilitres de gants de changement de tube ET entre les échantillons.

Ajoutez 825 microlitres de tampon de phosphate de sodium et 275 microlitres de solution de pré-lyse ou PLS dans un tube d’échantillon. Ensuite, faites vorter les échantillons pendant 15 secondes après les avoir mélangés, centrifugez les tubes à 14 000 G pendant cinq minutes. Décanter le surnageant et ajouter 700 microlitres de tampon A SL. Ensuite, faites tourbillonner le tube pendant cinq secondes.

Ouvrez un tube à la fois pour éviter toute contamination. Ensuite, assurez-vous qu’il y a un espace libre de 10 % du volume total dans le tube conique avant de placer les échantillons dans l’instrument de préparation rapide 24. Homogénéiser les échantillons à une vitesse de six mètres par seconde pendant 40 secondes.

Notez la différence entre la préparation rapide 24 et le vortex après homogénéisation. Centrifuger l’échantillon à 14 000 G pendant cinq minutes. Transférez le surnageant dans un microtube de centrifugation stérile de deux millilitres jusqu’à l’échantillon restant dans le tube ET-matrice de lyse à 700 microlitres supplémentaires d’un tampon SL, réhomogénéisez et centrifugez.

En utilisant les réglages précédents, placez des clips de verrouillage en plastique sur les tubes d’échantillon pour vous assurer qu’ils ne s’ouvriront pas et incubez les surnageants dans un bain-marie à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, ouvrez chaque micro tube de centrifugation pour relâcher la pression, rebouchez les tubes et faites-les tourbillonner pendant 15 secondes. Centrifugez les échantillons à 14 000 GS pendant une minute.

Après centrifugation, transférez 1,2 millilitres de surnageant dans un microtube à centrifuger stérile de deux millilitres. Placez ensuite le blister contenant la languette directement sur le microtube de centrifugation ouvert et poussez doucement la languette hors du blister dans le tube. Pour éviter tout contact entre la languette d’inhibition X et le tube, ajoutez une languette d’inhibition X à chaque échantillon.

Ensuite, faites tourbillonner les tubes jusqu’à ce que les échantillons se transforment en un liquide uniformément blanc cassé. Incuber les échantillons pendant une minute à température ambiante et les centrifuger à 14 000 fromages pendant cinq minutes tout en évitant les particules restantes au fond des tubes. Transférez tout le liquide dans un microtube à centrifuger stérile de 1,5 millilitre.

Ensuite, centrifugez les tubes à pleine vitesse pendant cinq minutes. Avant de commencer la purification automatique de l’ADN, assurez-vous que le poste de travail contient la quantité appropriée d’embouts de filtre et de tampons. Ensuite, ajoutez des tubes elluciens et des tubes filtrants aux adaptateurs de rotor et ajoutez 400 microlitres de chaque échantillon dans la fente centrale de l’adaptateur de rotor.

Placez les adaptateurs de rotor dans la centrifugeuse de poste de travail et assurez-vous que tous les couvercles des tubes de micro-centrifugeuse sont correctement fixés dans l’adaptateur de rotor. Ajoutez la solution de protéinase K dans un microtube à centrifuger stérile de 1,5 millilitre et placez-la dans la fente A du poste de travail. Ajoutez deux micro-tubes à centrifuger à verrouillage sûr d’un millilitre à la section agitateur du poste de travail et assurez-vous que les couvercles des tubes d’échantillon sont bien placés.

À l’aide de l’écran tactile du poste de travail, sélectionnez le protocole de détection de l’ADN des agents pathogènes dans les selles humaines et lisez les écrans suivants pour vous assurer que le poste de travail a été correctement chargé. Une fois que tous les écrans de vérification sont réussis, sélectionnez Démarrer pour exécuter le protocole. Retirez ensuite les échantillons des adaptateurs de rotor.

Combinez les trois purifications répétées pour un échantillon individuel à l’aide d’un système basé sur la centrifugation et l’évaporation. Rééluer l’échantillon à un volume final de 100 microlitres avec un tampon tris EDTA. Enfin, bouchez les échantillons et placez-les à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires pour l’analyse en aval.

Ce graphique montre que la méthode mécanique a systématiquement fourni les estimations globales les plus élevées de l’abondance totale des gènes normalisés par les bactéries pour les échantillons de matières fécales et de portée. La méthode enzymatique a donné les estimations les plus faibles dans tous les cas. La nouvelle méthode d’extraction hybride a produit la meilleure combinaison d’estimations qualitatives et quantitatives de la communauté bactérienne totale.

Des trois méthodes d’extraction testées. Vous devriez maintenant avoir une meilleure compréhension de la façon d’effectuer cette nouvelle méthode d’extraction d’ADN hybride semi-automatisée et voir son utilité dans l’évaluation qualitative et quantitative des communautés microbiennes à partir d’échantillons environnementaux complexes.