Phénotypage Souris fonction pulmonaire In Vivo Avec le Capacité diffusion pulmonaire
6 janvier 2015
Nous décrivons un moyen de mesurer rapidement et simplement la capacité de diffusion pulmonaire chez la souris et montrons qu’elle est suffisamment sensible aux changements de phénotype dans plusieurs pathologies pulmonaires courantes. Cette métrique apporte donc une pertinence translationnelle directe aux modèles murins, puisque la capacité de diffusion est également facilement mesurable chez l’homme.
L’objectif général de l’expérience suivante est d’apprendre à mesurer la capacité de diffusion des poumons d’une souris à l’aide d’un chromatographe en phase gazeuse calibré. Ceci est accompli en gonflant les poumons d’une souris anesthésiée avec un gaz contenant du néon et du monoxyde de carbone, en retenant le gaz dans les poumons pendant neuf secondes et en recueillant le gaz. Le gaz retiré des poumons est ensuite dilué à deux millilitres et injecté dans le chromatographe en phase gazeuse.
L’absorption différentielle du néon et du monoxyde de carbone dans les poumons est utilisée pour calculer la capacité de diffusion. Cette mesure peut être utilisée pour évaluer la perte de fonction pulmonaire dans un large éventail de modèles de maladies pulmonaires. Le principal avantage de cette technique par rapport à toutes les autres méthodes existantes pour mesurer la fonction pulmonaire chez la souris est qu’il s’agit d’une mesure très simple et reproductible qui peut être directement comparée à des mesures similaires chez l’homme.
Cette méthode peut être utilisée pour suivre les changements dans la structure pulmonaire qui se produisent avec une variété de pathologies pulmonaires. Ce protocole commence par la mise en place du module de chromatographe en phase gazeuse fourni avec l’appareil pour mesurer les pics d’azote, d’oxygène, de néon et de monoxyde de carbone. Pour cette application, seules les données sur le néon et le monoxyde de carbone sont nécessaires.
L’instrument utilise une colonne de tamis moléculaire avec de l’hélium comme gaz vecteur. Ce chromatographe en phase gazeuse particulier a une colonne de 0,8 millilitre et un échantillon de deux millilitres est utilisé pour assurer un dégagement adéquat de cette colonne avant de commencer. Une série de mesures permet toujours d’étalonner la machine à l’aide de deux millilitres de gaz directement à partir du sac d’échantillonnage de gaz.
Le premier pic à apparaître est le néon, puis l’oxygène et l’azote, que l’on ne mesure pas pour cette procédure. Enfin, le pic de monoxyde de carbone apparaît le temps du chromatographe en phase gazeuse. Pour mesurer tous ces pics, il faut un peu moins d’une minute.
Pour commencer, anesthésez les souris avec de la kétamine et de la xylazine. Confirmez l’anesthésie par l’absence de mouvement réflexe en réponse à un pincement de l’orteil. Ensuite, pour protéger les yeux, appliquez une pommade vétérinaire, puis trachéostomies les souris avec une canule à clous.
Utilisez une canule de calibre 18 pour les adultes ou une canule de calibre 20 pour les très jeunes souris. Ensuite, démarrez le métronome avec des clics audibles toutes les secondes. Pour les souris de plus de six semaines, utilisez une seringue de trois millilitres pour retirer 0,8 millilitre de gaz du sac de mélange de gaz.
Si la souris a moins de quatre semaines, utilisez 0,4 millilitre de gaz, puis connectez la seringue à la canule trachéale et gonflez rapidement les poumons. Commencez à compter mentalement de un à 10 en synchronisation avec les clics du métronome. Lorsque le compte atteint 10, prélevez rapidement le volume de 0,8 millilitre.
Diluez ce gaz expiré à deux millilitres en ajoutant de l’espace, de l’air et du poids au moins 15 secondes. Il est très important de gonfler et de dégonfler les poumons le plus rapidement possible. Un gonflage rapide est très facile, mais il faut un peu de pratique pour prélever précisément les 0,8 ml rapidement, puis injecter l’ensemble de l’échantillon dans le chromatographe en phase gazeuse.
Pour l’analyse, il est important d’éviter la contamination de l’échantillon lors du transfert vers et depuis l’animal et vers le chromatographe en phase gazeuse. Cela peut être fait avec précaution en coiffant le signe avec un doigt pendant que le GC mesure l’échantillon. Gonflez le poumon de souris avec 0,8 millilitre supplémentaire de mélange gazeux du sac, puis traitez cet échantillon de la même manière que le premier.
À l’aide des valeurs moyennes des deux mesures, calculez le DFCO. L’indice C fait référence aux gaz d’étalonnage et l’indice neuf fait référence aux échantillons prélevés sur l’animal. Après l’apnée de neuf secondes.
La valeur nominale du contrôle DFCO prélevée sur des souris noires C 57 est d’environ 0,77. Dans une étude utilisant un modèle de grippe PR huit, une perte progressive de fonction a été observée au sixième et au huitième jour dans un modèle d’emphysème 21 jours après l’installation des élastases. Le DFCO a été modérément diminué, mais il y a eu des changements beaucoup plus importants dans le modèle de fibrose induit par l’installation de Blio Mycin.
La voie fibrotique causée par la bléomycine a entraîné le plus grand changement de DFCO observé dans tous les modèles pathologiques. Ceci est important car la capacité de diffusion est également un marqueur fiable de la fibrose chez l’homme. Le gène CFTR joue un rôle crucial dans la fibrose kystique et dans une étude sur des souris dépourvues de ce gène, il y a eu une diminution significative du DFCO.
La DFCO a encore diminué avec une infection fongique chez ces souris knock-out. Un modèle couramment utilisé pour les lésions pulmonaires est causé par le LPS. Chez les souris exposées au LPS, il y avait une perte progressive de la fonction pulmonaire en fonction du temps du premier au quatrième jour, comme l’ont évalué les mesures du DFCO, la mesure du DFCO peut être effectuée avec succès chez les souris dès l’âge de deux semaines.
La taille plus petite du poumon nécessite un volume de gonflage plus petit de 0,4 millilitre. Le DFCO mesuré avec ce volume plus petit est capable de montrer l’augmentation attendue à mesure que le poumon mûrit Une fois maîtrisé. Cette technique peut être effectuée en quelques minutes seulement par souris avant d’effectuer toute autre mesure ou évaluation de la fonction pulmonaire.
Lors de cette tentative, il est important de s’assurer d’effectuer rapidement l’étape de gonflage et de dégonflage et d’être prudent lors du transfert de l’échantillon afin d’éviter toute contamination.
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Aperçu
Cet article décrit une méthode pour mesurer la capacité de diffusion pulmonaire chez les souris en utilisant un chromatographe en phase gazeuse calibré. La technique est sensible aux changements de phénotype dans diverses pathologies pulmonaires, ce qui la rend pertinente pour la recherche translationnelle.
Composants clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neuroscience
- Physiologie respiratoire
- Recherche translationnelle
Contexte
- La capacité de diffusion pulmonaire est une mesure critique de la fonction pulmonaire.
- Les méthodes existantes pour mesurer la fonction pulmonaire chez les souris peuvent être complexes.
- Les études comparatives entre souris et humains sont essentielles pour la pertinence translationnelle.
- Des techniques simples et reproductibles sont nécessaires pour une recherche efficace.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode simple pour mesurer la capacité de diffusion pulmonaire chez les souris.
- Évaluer la perte de fonction pulmonaire à travers divers modèles de maladies pulmonaires.
- Faciliter les comparaisons des mesures de fonction pulmonaire entre souris et humains.
Méthodes utilisées
- Inflation des poumons de souris anesthésiées avec un mélange de gaz contenant du néon et du monoxyde de carbone.
- Retenue du gaz dans les poumons pendant neuf secondes avant la collecte.
- Dilution du gaz collecté à deux millilitres pour l'analyse.
- Utilisation d'un chromatographe en phase gazeuse pour mesurer l'absorption différentielle des gaz.
Résultats principaux
- La méthode fournit une mesure fiable de la capacité de diffusion pulmonaire.
- Elle est sensible aux changements de la fonction pulmonaire associés à diverses pathologies.
- La technique est simple et reproductible, améliorant son applicabilité dans la recherche.
- Les résultats peuvent être directement comparés avec des mesures similaires chez les humains.
Conclusions
- Cette méthode offre un outil précieux pour évaluer la fonction pulmonaire dans les modèles de souris.
- Elle soutient la recherche translationnelle en établissant des ponts entre les mesures chez les souris et les humains.
- Les études futures peuvent utiliser cette technique pour explorer plus efficacement les pathologies pulmonaires.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Measuring lung diffusing capacity in mice provides a translational pulmonary function test that enables direct comparison with human clinical data. This approach supports phenotypic characterization of lung disease models and enhances predictive confidence in preclinical target validation. The method’s simplicity and reproducibility facilitate integration into discovery workflows for mechanistic de-risking and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying lung function loss across emphysema, fibrosis, acute lung injury, and infection models.
- Operational Value: Provides a rapid, reproducible assay for functional target validation in murine lung pathology studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, gas-exchange-based readouts suitable for screening compound effects on lung structure and function.
- Operational Value: Standardized procedure with <1-minute readout supports high-throughput phenotypic screening in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with human diffusing capacity measurements, enabling cross-species biomarker alignment and translational continuity.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by detecting early functional changes in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, offering a phenotypic bridge between murine models and human clinical endpoints.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by detecting structural lung changes via functional gas exchange metrics.
- Screening: Enables assay readiness through standardized gas collection and chromatographic analysis of neon and carbon monoxide uptake.
- Analytics: Generates quantitative diffusing capacity (DFCO) values that allow comparison of lung function across experimental conditions and time points.
- Translational Research: Connects murine phenotypes to human clinical relevance through direct comparability of diffusing capacity measurements.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable capability for longitudinal lung function monitoring across multiple disease models and study phases.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in lung pathology models through quantitative phenotyping.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via rapid gas injection, breath-hold, and GC analysis workflow.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, translationally relevant functional readouts that reduce late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of compounds based on lung function preservation or improvement in disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse anesthesia, tracheal cannulation, and gas handling techniques.
- Dependent on access to a calibrated gas chromatograph with molecular sieve column and helium carrier gas.
- Necessitates cross-team standardization of gas volumes, inflation timing, and sample dilution protocols.
- Involves adaptation considerations for neonatal vs. adult mice due to lung size and required gas volumes (0.4 mL vs. 0.8 mL).
- Includes practical limitations such as the need to prevent sample contamination during transfer and the importance of rapid lung inflation/deflation for accurate measurements.
