Phénotypage Souris fonction pulmonaire In Vivo Avec le Capacité diffusion pulmonaire

L’objectif général de l’expérience suivante est d’apprendre à mesurer la capacité de diffusion des poumons d’une souris à l’aide d’un chromatographe en phase gazeuse calibré. Ceci est accompli en gonflant les poumons d’une souris anesthésiée avec un gaz contenant du néon et du monoxyde de carbone, en retenant le gaz dans les poumons pendant neuf secondes et en recueillant le gaz. Le gaz retiré des poumons est ensuite dilué à deux millilitres et injecté dans le chromatographe en phase gazeuse.

L’absorption différentielle du néon et du monoxyde de carbone dans les poumons est utilisée pour calculer la capacité de diffusion. Cette mesure peut être utilisée pour évaluer la perte de fonction pulmonaire dans un large éventail de modèles de maladies pulmonaires. Le principal avantage de cette technique par rapport à toutes les autres méthodes existantes pour mesurer la fonction pulmonaire chez la souris est qu’il s’agit d’une mesure très simple et reproductible qui peut être directement comparée à des mesures similaires chez l’homme.

Cette méthode peut être utilisée pour suivre les changements dans la structure pulmonaire qui se produisent avec une variété de pathologies pulmonaires. Ce protocole commence par la mise en place du module de chromatographe en phase gazeuse fourni avec l’appareil pour mesurer les pics d’azote, d’oxygène, de néon et de monoxyde de carbone. Pour cette application, seules les données sur le néon et le monoxyde de carbone sont nécessaires.

L’instrument utilise une colonne de tamis moléculaire avec de l’hélium comme gaz vecteur. Ce chromatographe en phase gazeuse particulier a une colonne de 0,8 millilitre et un échantillon de deux millilitres est utilisé pour assurer un dégagement adéquat de cette colonne avant de commencer. Une série de mesures permet toujours d’étalonner la machine à l’aide de deux millilitres de gaz directement à partir du sac d’échantillonnage de gaz.

Le premier pic à apparaître est le néon, puis l’oxygène et l’azote, que l’on ne mesure pas pour cette procédure. Enfin, le pic de monoxyde de carbone apparaît le temps du chromatographe en phase gazeuse. Pour mesurer tous ces pics, il faut un peu moins d’une minute.

Pour commencer, anesthésez les souris avec de la kétamine et de la xylazine. Confirmez l’anesthésie par l’absence de mouvement réflexe en réponse à un pincement de l’orteil. Ensuite, pour protéger les yeux, appliquez une pommade vétérinaire, puis trachéostomies les souris avec une canule à clous.

Utilisez une canule de calibre 18 pour les adultes ou une canule de calibre 20 pour les très jeunes souris. Ensuite, démarrez le métronome avec des clics audibles toutes les secondes. Pour les souris de plus de six semaines, utilisez une seringue de trois millilitres pour retirer 0,8 millilitre de gaz du sac de mélange de gaz.

Si la souris a moins de quatre semaines, utilisez 0,4 millilitre de gaz, puis connectez la seringue à la canule trachéale et gonflez rapidement les poumons. Commencez à compter mentalement de un à 10 en synchronisation avec les clics du métronome. Lorsque le compte atteint 10, prélevez rapidement le volume de 0,8 millilitre.

Diluez ce gaz expiré à deux millilitres en ajoutant de l’espace, de l’air et du poids au moins 15 secondes. Il est très important de gonfler et de dégonfler les poumons le plus rapidement possible. Un gonflage rapide est très facile, mais il faut un peu de pratique pour prélever précisément les 0,8 ml rapidement, puis injecter l’ensemble de l’échantillon dans le chromatographe en phase gazeuse.

Pour l’analyse, il est important d’éviter la contamination de l’échantillon lors du transfert vers et depuis l’animal et vers le chromatographe en phase gazeuse. Cela peut être fait avec précaution en coiffant le signe avec un doigt pendant que le GC mesure l’échantillon. Gonflez le poumon de souris avec 0,8 millilitre supplémentaire de mélange gazeux du sac, puis traitez cet échantillon de la même manière que le premier.

À l’aide des valeurs moyennes des deux mesures, calculez le DFCO. L’indice C fait référence aux gaz d’étalonnage et l’indice neuf fait référence aux échantillons prélevés sur l’animal. Après l’apnée de neuf secondes.

La valeur nominale du contrôle DFCO prélevée sur des souris noires C 57 est d’environ 0,77. Dans une étude utilisant un modèle de grippe PR huit, une perte progressive de fonction a été observée au sixième et au huitième jour dans un modèle d’emphysème 21 jours après l’installation des élastases. Le DFCO a été modérément diminué, mais il y a eu des changements beaucoup plus importants dans le modèle de fibrose induit par l’installation de Blio Mycin.

La voie fibrotique causée par la bléomycine a entraîné le plus grand changement de DFCO observé dans tous les modèles pathologiques. Ceci est important car la capacité de diffusion est également un marqueur fiable de la fibrose chez l’homme. Le gène CFTR joue un rôle crucial dans la fibrose kystique et dans une étude sur des souris dépourvues de ce gène, il y a eu une diminution significative du DFCO.

La DFCO a encore diminué avec une infection fongique chez ces souris knock-out. Un modèle couramment utilisé pour les lésions pulmonaires est causé par le LPS. Chez les souris exposées au LPS, il y avait une perte progressive de la fonction pulmonaire en fonction du temps du premier au quatrième jour, comme l’ont évalué les mesures du DFCO, la mesure du DFCO peut être effectuée avec succès chez les souris dès l’âge de deux semaines.

La taille plus petite du poumon nécessite un volume de gonflage plus petit de 0,4 millilitre. Le DFCO mesuré avec ce volume plus petit est capable de montrer l’augmentation attendue à mesure que le poumon mûrit Une fois maîtrisé. Cette technique peut être effectuée en quelques minutes seulement par souris avant d’effectuer toute autre mesure ou évaluation de la fonction pulmonaire.

Lors de cette tentative, il est important de s’assurer d’effectuer rapidement l’étape de gonflage et de dégonflage et d’être prudent lors du transfert de l’échantillon afin d’éviter toute contamination.