Mesure de la stabilité des protéines dans le salon embryons de poissons zèbres en utilisant la fluorescence Decay Après Photoconversion (FDAP)

L’objectif général de l’expérience suivante est de mesurer la stabilité des protéines intracellulaires et extracellulaires dans des embryons de poissons-zèbres vivants. Ceci est réalisé en marquant une protéine d’intérêt avec une protéine fluorescente photoconvertible, et en injectant de l’ARNm, codant pour la fusion ainsi qu’un colorant fluorescent dans des embryons de poisson-zèbre. Ensuite, la protéine de fusion photoconvertible est photoconvertie, ce qui marque la protéine par impulsion.

Dans cet exemple, la protéine de fusion est sécrétée, puis la décroissance de l’intensité de fluorescence photoconvertie intra et extracellulaire est surveillée au fil du temps et équipée d’une fonction décroissante exponentielle afin de déterminer les demi-vies intracellulaires et extracellulaires de la protéine de fusion. Les résultats montrent la stabilité in vivo des protéines de fusion photoconvertibles basée sur la décroissance du signal fluorescent au fil du temps. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie cellulaire et du développement.

Par exemple, comment la stabilité influence la distribution et la disponibilité des protéines. Nous utilisons notre logiciel EP pour l’analyse des données FD DP. EP est disponible gratuitement sur notre page Web : Après avoir généré un ARNm coiffé en codant une protéine de fusion photoconvertible verte à rouge d’intérêt, transférez environ 31 embryons de poisson-zèbre au stade cellulaire dans une boîte de Pétri en verre ou en plastique recouvert de rose de cinq centimètres de diamètre contenant environ huit millilitres de milieu embryonnaire.

Ajoutez deux millilitres de solution bouillon pro nay préalablement préparée et décongelée dans le plat et incubez à température ambiante pendant cinq à 10 minutes. Remplissez un haut-parleur en verre avec du milieu pour embryons et, tout en évitant d’exposer les embryons à l’air ou au plastique, transférez les embryons dans le bécher en inclinant la boîte de Pétri tout en l’immergeant dans le milieu. Une fois que les embryons se sont déposés au fond du bécher, versez la majeure partie du milieu et utilisez un milieu frais pour le remplacer soigneusement.

Le léger tourbillonnement du milieu frais fera perdre aux embryons leur ciron affaibli. Après avoir répété le lavage, utilisez une pipette en verre PEs avec une pointe flammée pour transférer les embryons enrobés dans un plat d’injection enrobé d’agarose. Ensuite, co-injectez l’ARNm et un conjugué Alexa 4 88 DExT de trois kilodaltons directement au centre de la cellule pour assurer une distribution uniforme de l’ARNm et du colorant.

Une fois le clivage commencé, transférez les embryons injectés dans un puits recouvert d’agarose à un à 2 % d’un récipient en plastique à six puits rempli d’embryons, de milieu, et incubez dans l’obscurité à 28 degrés Celsius jusqu’à ce que les embryons atteignent le stade avancé de la sphère avec un microscope stéréoscopique, identifiez un à cinq embryons sains et utilisez une pipette en verre PEs avec une pointe flammée pour les retirer de la boîte. Éjectez doucement les embryons dans un micro-tube de centrifugation contenant environ un millilitre d’aros fondus à 1 % de point de fusion bas dans un milieu embryonnaire x dadios. Ensuite, ramenez les embryons dans la pipette avec quelques aros.

Ensuite, éjectez doucement les aros et les embryons sur le couvercle. Verre d’un plat à fond de verre. Pour réutiliser la pipette en verre, nettoyez les aros résiduels pour éviter le colmatage en pipetant rapidement le milieu embryonnaire de haut en bas, en travaillant rapidement avant que les aros ne se solidifient.

À l’aide d’une sonde métallique, positionnez les embryons de manière à ce que le pôle de l’animal fasse face à la vitre de protection sous le stéréomicroscope. Surveillez les positions des embryons et réajustez si nécessaire jusqu’à ce que l’agarro durcisse. Lorsque l’agarro s’est solidifié, utilisez un milieu d’embryons x danios pour remplir le plat à fond de verre.

Pour préparer la photoconversion, réglez l’incubateur à 28 degrés Celsius et placez une grosse goutte d’huile d’immersion sur l’objectif pour vous assurer que le film d’huile entre l’objectif et le verre de protection ne se brisera pas lorsque la scène se déplacera vers différentes positions embryonnaires. Pendant l’imagerie en toute sécurité, placez l’antenne à fond en verre sur la platine afin que l’antenne ne se déplace pas lorsque la platine se déplace. Ensuite, dans le progiciel du microscope confocal, définissez la position de chaque embryon.

Ajustez la profondeur Z pour chaque embryon et essayez de cibler à peu près le même plan dans chaque embryon à l’aide des lasers 4 88 et 5 lasers 43 nanomètres. Acquérez des images avant la conversion de photos. Configurez ensuite le logiciel du microscope confocal pour imager chacune des positions précédemment définies avec les conditions d’imagerie appropriées.

Toutes les 10 ou 20 minutes ou toutes les cinq heures, convertissez le commutateur de protéine de fusion en un objectif 10 x et exposez des groupes d’embryons à la lumière UV de la lampe au mercure avec un filtre d’environ 300 à 400 nanomètres à 100 % de sortie pendant deux minutes. Déplacez la mise au point le long de l’axe Z pour favoriser une conversion uniforme des photos après la conversion des photos. Revenez immédiatement à l’objectif 25 x ou 40 x et vérifiez que les positions précédemment définies sont toujours exactes.

Si la parabole s’est déplacée pendant la photoconversion, redéfinissez les positions des embryons. Démarrez le cours de temps d’imagerie et laissez-le fonctionner pendant cinq heures. Notez le temps écoulé entre la photoconversion et le début de l’imagerie pour chaque embryon.

Vérifiez de temps en temps l’expérience et surveillez le niveau du milieu de Danielle, en ajoutant plus si nécessaire. Commencez par inspecter visuellement les ensembles de données sur le parcours temporel de chaque embryon. Éliminez les ensembles de données d’embryons morts pendant l’imagerie qui se sont considérablement déplacés, qui ont de très faibles niveaux de signal photoconverti ou qui contiennent des régions de cellules qui semblent inhabituelles et qui ont cessé de bouger et de se diviser.

À l’aide du progiciel basé sur Python, PI F DAP crée un masque à l’aide du signal Alexa 4 88, qui est strictement intracellulaire. Afin de séparer le signal photoconverti intracellulaire et extracellulaire, appliquez le masque à l’image du canal rouge correspondant pour éviter que les pixels intracellulaires ne soient pris en compte. Lors du calcul de l’intensité extracellulaire moyenne pour mesurer l’intensité intracellulaire moyenne, inversez le masque, affichez les images masquées générées, inspectez-les visuellement, et éliminez les ensembles de données dans lesquels les masques ne distinguent pas avec précision l’espace intracellulaire de l’espace extracellulaire.

Utilisez PI F DAP pour calculer les intensités de fluorescence extracellulaires et intracellulaires moyennes pour chaque image. Ensuite, ajustez les données de fluorescence comme indiqué ici selon les directives du protocole de texte, et calculez la protéine extracellulaire et intracellulaire. La moitié vit tau du taux de liquidation.

Le strabisme de Constance K est une protéine sécrétée qui induit l’expression des gènes endodermiques mis au cours de l’embryogenèse du poisson zèbre. Dans cette expérience, des embryons ont été co-injectés avec Alexa 4 88 dextran et un ARNm codant pour le strabisme DENDRA deux et soumis au test F DAP. Comme indiqué ici, l’intensité du signal photoconverti extracellulaire diminue avec le temps.

À l’aide de PI F dap, des profils d’intensité extracellulaire de 23 embryons ont été générés et les données ont été ajustées avec un modèle de clairance de premier ordre. Les résultats indiquent une demi-vie moyenne de tau de 116 minutes. Profils d’intensité et de protéines similaires.

Des demi-vies ont été obtenues lorsque les intervalles entre les images étaient de 10 ou 20 minutes. Suggérant que le blanchiment des photos ou la conversion de photos par inadvertance n’a pas contribué de manière significative aux changements d’intensité. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la décroissance de la fluorescence après la conversion de photos.

A mesurer in vivo. Demi-vies de protéines de fusion photoconvertibles dans des embryons de poisson-zèbre vivants.