Name: Observer Division et dynamique mitotique dans un embryon de poisson zèbre en direct (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Découvrez la visualisation de la mitose en direct dans des embryons de poisson zèbre en utilisant des protéines fluorescentes et la microscopie confocale à haute résolution. Cette méthode permet d'étudier la ségrégation chromosomique et ses implications dans le développement et la formation tumorale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions Kristen Kwan pour les vecteurs pCS2-H2A.F/Z-EGFP et pCS2-mCherry-CAAX. Nous remercions Chris Rodesch de nous avoir enseigné l’imagerie en direct chez le poisson zèbre. Nous remercions Shawn Williams, Erik Malarkey et Brad Yoder pour leur aide en matière d’imagerie confocale à l’UAB et à l’installation d’imagerie à haute résolution de l’UAB. L’installation d’imagerie à haute résolution est soutenue par la subvention de soutien au centre de cancérologie complète de l’UAB (P30CA013148) et le centre central des maladies rhumatismales (P30 AR048311). J.M.P. est soutenu par le National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105), et des subventions pilotes de l’American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) et de l’UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148). S.M.P. est soutenu par la subvention de formation T32 en biologie cellulaire et moléculaire (5T32GM008111-28).

1. Transcription in vitro <ol><li> Linéariser pCS2-H2A.F / Z-EGFP et / ou vecteurs pCS2-mCherry-CAAX par restriction Notl enzyme digérer 31. L&#39; utilisation d&#39; un ARN dans le kit de transcription in vitro, de générer des produits 5 &#39;d&#39;ARNm coiffés à partir de chaque modèle, selon le protocole du fabricant. </li><li> Purifier l&#39;ARNm coiffés en utilisant un kit de purification. Suivez les instructions du fabricant. Eluer avec RNase-H 2 O. </li><li> Déterminer la concentration d&#39;ARN par absorbance à 260 nm en utilisant un spectrophotomètre. (DO 260 x dilution x 40 ug / ml). </li><li> Diluer l&#39;ARN à 100 ng / pl pour chaque H H2A.F / Z-EGFP et mCherry-CAAX avec RNase 2 O. Si la concentration en ARN est trop faible, la fluorescence sera diminuée ou absente. échantillons Brighter diminuera les inquiétudes sur phototoxicité et photoblanchiment. D&#39;autre part, trop d&#39;ARN peuvent être toxiques et / ou provoquer des effets hors cible. Remarque: Conservez le resteARNm purifié à -80 ° C congélateur. </li></ol> 2. Elevage Zebrafish, Embryon Collection, et l&#39; ARNm Injection 36-38 <ol><li> Assembler bassins d&#39;élevage avec une barrière pour séparer le réservoir en deux régions et remplir chaque réservoir d&#39;élevage avec de l&#39;eau du système d&#39;aquaculture utilisé dans l&#39;établissement zebrafish. </li><li> Afin d&#39;éviter la reproduction prématurée, placer deux poissons mâles d&#39;un côté de la barrière et deux poissons femelles de l&#39;autre côté de la nuit avant la reproduction. </li><li> Le lendemain, décongeler le mélange d&#39;ARNm préparé précédemment sur la glace. Remplacer l&#39;eau dans des réservoirs d&#39;élevage avec de l&#39;eau du système d&#39;aquaculture fraîche et éliminer les obstacles. Immédiatement après les barrières sont tirés, réchauffer un moule d&#39;injection à 28,5 ° C et mettre en place l&#39;équipement pour la microinjection. Note: Pour plus d&#39; informations sur les moules d&#39;injection, s&#39;il vous plaît se référer à Gerlach 36. </li><li> Collecter les œufs tous les 10 - 15 min en utilisant une passoire à thé et rincer les œufs dans un 100 x 15 mm plat propre Petri avec E3 Bleu (5 mM de NaCl, KCl 0,17, 0,33 mM de CaCl2, 0,33 mM MgSO 4, 10 -5% bleu de méthylène). E3 bleu est utilisé pour empêcher la croissance fongique et d&#39;assurer le bon développement des larves de poissons. Pour plus d&#39; informations sur l&#39; accouplement et la collecte d&#39;embryons, voir Gerlach 36 et Porazinkski 37. </li><li> Intégrer une cellule mise en scène d&#39; embryons dans un moule d&#39;injection chauffé et injecter de l&#39;ARN dans le jaune d&#39; oeuf dans la quantité souhaitée d&#39;embryons (figure 1A). Compte pour la mort embryonnaire naturelle et d&#39;embryons non fécondés en effectuant des injections embryonnaires sur 15% plus d&#39;embryons que nécessaire pour l&#39;expérience. Pour plus de détails sur microinjection d&#39;embryons de poisson zèbre, s&#39;il vous plaît se référer à Gerlach 36 et Porazinkski 37. NOTE: Pour la première utilisation de l&#39;ARNm, effectuer une analyse dose-courbe pour déterminer la dose optimale pour la fluorescence et la viabilité (définie comme l&#39;absence de défauts de développement bruts jusqu&#39;à 5 dpf) avant d&#39;effectuer l&#39;imagerie 5D. 150-200 ng / ulinjecté dans des embryons est souvent la concentration optimale, il est donc un bon point de départ pour la concentration finale. </li><li> extraire soigneusement les embryons injectés du moule à l&#39;aide d&#39;un 9 &quot;pipette Pasteur en verre modifiée. Pour modifier la pipette, faire fondre l&#39;extrémité à l&#39;aide d&#39;un brûleur Bunsen jusqu&#39;à ce qu&#39;elle forme une boule. </li><li> Placez embryons injectés dans une boîte de Pétri de 100 x 15 mm à l&#39;E3 Bleu et la maison dans un incubateur à 28,5 °. </li><li> Six heures après l&#39;injection, enlever les embryons morts ou non fécondés des plaques et ajouter propre E3 Bleu. Maison des embryons à 28,5 ° C. </li></ol> 3. Préparation et incorporation de Live Zebrafish Embryons Imaging (figure 1B) <ol><li> Deux heures avant l&#39;imagerie, dépister les embryons injectés pour la GFP en utilisant un microscope à dissection fluorescent. Placer les embryons exprimant la GFP vert vif dans une nouvelle boîte de 100 mm x 15 Petri avec E3 Bleu. </li><li> Faire bouillir une solution stock de 1% d&#39;agarose à faible fusion en ajoutant 1 g de bas point de fusion d&#39;agarose à 100 ml d&#39;E3 Bleu. Après avoir utilisé l&#39;agarose, couvrir le ballon avec une feuille d&#39;aluminium. La solution mère reste utile pour jusqu&#39;à un mois. </li><li> Aliquote de 3 ml de la gélose fondue dans un tube de culture de 17 x 100 mm. Gardez au chaud agarose en plaçant le tube de culture dans un bain d&#39;eau C 42 ° jusqu&#39;à utilisation. Préparer une solution à 15 mM Tricaine dans de l&#39; eau déminéralisée pour anesthésier les embryons de poisson zèbre 36. REMARQUE: si l&#39; imagerie aux points de temps antérieurs est désiré, la concentration d&#39;agar - agar peut être diminuée aussi faible que 0,3% 39. </li><li> Amener le mM Tricaine 15, les embryons dépistés, agarose à faible fusion, E3 Bleu, et une lamelle de verre culture sur le fond plat de 35 mm pour un microscope optique de dissection. Retirez délicatement le chorion de l&#39;embryon avec # 5 pinces. Pour ce faire, trois embryons. </li><li> Placer les embryons dechorionated dans un récipient séparé pour être anesthésiés. Le couvercle de la cuvette du fond de lamelle couvre-objet est souvent utilisé à cette fin. En utilisant une pipette de transfert, ajouter trois gouttes (environ 150 pi)mM Tricaine 15 à l&#39;antenne de 5 ml E3 bleu (si en utilisant le couvercle de la boîte de fond de lamelle) ou jusqu&#39;à ce que les embryons ont été suffisamment anesthésiés. En outre, d&#39;ajouter 3-4 gouttes (environ 150-200 pi) d&#39;une solution 15 mM Tricaine au tube d&#39;agarose fondu à 1%. </li><li> En utilisant une pipette P200 avec 1 cm de la pointe de la pipette coupée; transférer les embryons anesthésiés à l&#39;antenne de la lamelle à fond. Retirez tout excès E3 bleu: solution Tricaine. </li><li> Ajouter lentement 5 - 10 pi d&#39;agarose à faible fusion: solution Tricaine sur les embryons, en gardant chaque goutte séparée pour assurer les embryons ne dérivent pas accidentellement près de l&#39;autre. Attention: Si l&#39;agarose est trop chaud, il va endommager l&#39;embryon. Une bonne température pour maintenir la gélose à 42 ° C est. </li><li> En utilisant une aiguille 21 G 1 ½, orienter doucement l&#39;embryon dans l&#39;agarose à la position désirée. Lors de l&#39;utilisation d&#39;un microscope inversé pour l&#39;imagerie time-lapse, orienter la région d&#39;intérêt (ROI) aussi proche de la lamelle comme possible. Remarque: Pour des fins générales, la région de queue offre une facilité d&#39;orientation et de clarté en raison du tissu relativement mince (figure 1A). D&#39; autres tissus, comme la couche épithéliale entourant le jaune d&#39; oeuf et des plis d&#39; ailettes, peuvent être utilisées 28,29. Ces tissus offrent une grande clarté, mais ces régions ne sont que quelques couches de cellules d&#39;épaisseur. Aux fins de ce protocole, il est bénéfique pour l&#39;image de la région de la queue pour acquérir autant de divisions cellulaires que possible. </li><li> Attendez quelques minutes pour la solidification partielle de l&#39;agar-agar. Utilisez l&#39;aiguille pour briser un petit morceau de gélose pour tester sa solidification. Quand un morceau de gélose peut être arrachée de la goutte, passez à l&#39;étape suivante. </li><li> Couvrir l&#39;ensemble lamelle avec de l&#39;agar bas point de fusion formant un dôme sur les embryons embarqués. Laisser la gélose se solidifier avant de déplacer le plat pour l&#39; imagerie confocale (figure 1A). </li><li> Au cours du processus de solidification de la gélose (il faut environ 10 minutes), préparer 3 ml de of E3 solution bleue avec cinq gouttes (environ 250 pi) à 15 mM Tricaine être placé sur les embryons incorporés lors de l&#39;imagerie. </li></ol> 4. 5D imagerie confocale de Live Zebrafish Embryons 40,41 NOTE: Voir Ariga 40 et O&#39;Brien 41 pour plus de détails sur la façon d&#39;effectuer l&#39; imagerie 5D en utilisant d&#39; autres systèmes confocaux. Pour Z-intervalle, Z-stack, Z-profondeur, intervalle de temps, et les définitions 5D voir la figure 1C. <ol><li> Ouvrez le logiciel d&#39;imagerie et régler le microscope à 60x NA 1.4 objectif. Appliquer de l&#39;huile d&#39;immersion à l&#39;objectif et placer la boîte de culture dans le porte-lame sur la platine du microscope. L&#39;utilisation du contrôleur d&#39;axe, l&#39;embryon centre d&#39;intérêt au-dessus de la lentille d&#39;objectif et amener la lentille d&#39;objectif vers le haut pour atteindre la boîte de culture. </li><li> Cliquez sur l&#39;icône de l&#39;oculaire et de passer au filtre de la GFP sur le microscope. Focus sur le ROI. En se concentrant sur le tissu le plus proche de la lamelle sera offer les meilleurs résultats d&#39;imagerie. </li><li> Retirez le verrouillage. Sélectionnez les canaux GFP et mCherry (préétablies longueurs d&#39;onde dans le logiciel) et définir la ligne option normale moyenne. </li><li> Utilisez &quot;Controls Voir / Acquisition / Zone de numérisation A1&quot; commande pour ouvrir l&#39;outil A1 Zone de numérisation. </li><li> Commencez la numérisation. À l&#39;aide de l&#39;axe de commande, placer l&#39;embryon de telle sorte que la zone de balayage est rempli avec autant de poisson-zèbre que possible. La puissance du laser n&#39;a pas besoin d&#39;être optimale à ce stade. Abaisser la puissance du laser pour éviter photoblanchiment inutile. </li><li> Utilisez les «Contrôles Voir / Acquisition / acquisition ND&quot; commande pour ouvrir le panneau de commande d&#39;acquisition ND. </li><li> Commencez le balayage pour définir les paramètres Z-stack. Réglez la limite supérieure Z-pile à l&#39;endroit où les cellules ne sont pas au point et limite inférieure à l&#39;endroit où les cellules ne sont plus visibles. Prévoir un espace de 3 pm au-dessus de l&#39;échantillon pour la croissance et le mouvement des cellules, ce qui peut se développer dans le domaine de l&#39;imagerie. Le Z-pile pour les chiffres présentés dans ce protocol couvrait une Z-profondeur de 40 um dans la queue de l&#39;embryon. </li><li> Définissez la taille de l&#39;étape Z-intervalle à 2 pm. En moyenne, une cellule est de 10 um de diamètre; donc 2 um produira cinq intervalles de données d&#39;imagerie à analyser pour chaque cellule. REMARQUE: La profondeur de l&#39;image pouvant être acquise dépend de l&#39;intervalle Z. résolution Z est sacrifié à gagner en profondeur globale dans la dimension Z pour l&#39;image autant de cellules en mitose que possible (grande profondeur Z). L&#39;inverse est vrai dans la mesure où, en diminuant la taille de l&#39;étape, la résolution Z est acquise, alors que la profondeur Z est sacrifiée (petite profondeur Z). </li><li> Réglez la puissance image laser, HV, et le décalage des niveaux. Pour les expériences ont démontré dans ce protocole, utiliser la puissance du laser suivant, HV, et le décalage des niveaux fixés aux niveaux correspondants, respectivement, pour le canal de la GFP; 2-5, 120-140, et de -9 à -11. Pour le canal mCherry, utiliser la puissance du laser suivant, HV, et le décalage des niveaux, respectivement; 3 - 6, 120-140 et -3-8. Une fois que les paramètres sont réglés, arrêtez le balayage pour éviter l&#39;exposition au laser inutiles qui peuvent causer des phototoxicité et photoblanchiment de l&#39;échantillon. </li><li> Sélectionnez l&#39;icône de la moyenne 2x ligne. &quot;Aucune moyenne&quot; produit une image granuleuse en &quot;ligne de 4x en moyenne&quot; augmente considérablement le temps de balayage. L&#39;utilisation de 2x la ligne moyenne fournit la meilleure qualité d&#39;image et le temps le plus rapide de balayage. </li><li> Sélectionnez la durée appropriée de l&#39;intervalle et le temps temps nécessaire pour l&#39;expérience. Pour les divisions de type sauvage, des intervalles de temps de deux minutes pendant 2 heures est le meilleur pour la détermination de la durée mitotique (utilisé dans les figures 1, 2, 3A et 3B). Divisions qui activent le point de contrôle de l&#39; ensemble de la broche pendant plus de 30 min sont plus appropriés pour des intervalles de cinq minutes pour quatre heures afin de préserver la fluorescence comme le montre la figure 3C. </li><li> Cochez la case &quot;enregistrer le fichier&quot; et nommez le fichier pour enregistrer automatiquement le fichier tel qu&#39;il est en cours d&#39;acquisition. Double contrôle tous les paramètres sont réglées correctement et appuyez sur &quot;démarrer run&quot;. </li><li> Après l&#39;acquisition est terminée, pour afficher le fichier dans un format en trois dimensions, cliquez sur l&#39;icône du seuil de volume. </li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L&#39; utilisation de ce procédé permet de déduire une rupture de l&#39; enveloppe nucléaire, la formation d&#39;une plaque métaphase par des attaches microtubules kinétochore, et la ségrégation des chromatides sœurs pour former deux nouvelles cellules in vivo et d&#39;une manière dépendante du temps. La capacité à observer mitose chez le poisson zèbre est avantageuse par rapport à des échantillons fixes et des systèmes de culture cellulaire, car les cellules sont imagées dans la physiologie naturelle, le tissu...

La mitose est un processus essentiel du cellulaire critique pour la croissance, la différenciation et la régénération dans un organisme vivant. Lors de la préparation précise et la réplication de l&#39;ADN en interphase, la cellule est amorcée à se diviser. La première phase de la mitose, la prophase, est initiée par l&#39;activation de la cycline B / Cdk1. Prophase est caractérisé par la condensation de la matière de la chromatine dans les chromosomes. répartition de l&#39;enveloppe nucléaire se produit à la transition entre prophase et prométaphase. Dans prométaphase, centrosomes, le centre de nucléation pour la formation du fuseau, commencent à migrer vers les pôles opposés tout en étendant microtubules à la recherche de l&#39;attachement kinétochore. Lors de la fixation, les conversions pour mettre fin sur l&#39; attachement des microtubules et des forces de tension orientent les chromosomes formant une plaque de métaphase 1. Si tous les chromosomes sont correctement fixés, le point de contrôle de l&#39;ensemble de la broche est satisfaite, les anneaux de cohésine tenant les chromatides sœurs ensemble sont clivés et microtubules raccourcir pour tirer soeurchromatides à des pôles opposés pendant anaphase 2,3. La phase finale, télophase, implique un allongement de la cellule et de la réforme de l&#39;enveloppe nucléaire autour des deux nouveaux noyaux. Cytokinèse achève le processus de division en séparant le cytoplasme des deux nouvelles cellules filles 4-6. Altération des principales voies mitose (c. -à- broche ensemble checkpoint, duplication centrosome, soeur chromatides cohésion, etc.) Peut entraîner la métaphase arrestation, de chromosomes mauvaise ségrégation, et de l&#39; instabilité génomique 7-10. En fin de compte, les défauts dans les voies de la mitose contrôle peuvent provoquer des troubles du développement et cancer, nécessitant la visualisation de la mitose et ses défauts dans un vertébré, organisme multicellulaire en direct 10-16. embryons de poisson zèbre servent comme un grand organisme modèle pour l&#39;imagerie en direct en raison du tissu transparent, la facilité de microinjection, et le développement rapide. En utilisant zebrafish, l&#39;objectif global de ce manuscrit est dedécrivent un procédé de 5D en temps réel (dimensions X, Y, Z, du temps et de longueur d&#39; onde) d&#39; imagerie de la mitose 17 (figure 1C). L&#39;utilisation de zebrafish mutant défectueux dans différentes voies mitose démontrer la conséquence de tels défauts. Pour ce protocole, les mutants Aurora B et Esco2 ont été choisis pour illustrer ces défauts. Aurora B est une kinase qui fait partie du complexe chromosome de passagers (CPC) impliqués dans la formation du fuseau et de l&#39;attachement des microtubules. Il est également nécessaire pour la formation de clivage de sillon dans cytokinesis 18,19. Chez le poisson zèbre, un déficit Aurora B conduit à des défauts dans l&#39; induction sillon, cytocinèse, et la ségrégation des chromosomes 20. Esco2, d&#39;autre part, est une acétyltransférase qui est essentiel pour la cohésion des chromatides sœurs 21,22. Il acétyle cohesin sur la partie SMC3 de l&#39;anneau stabilisant ainsi cohesin pour assurer la séparation des chromosomes lors de la transition métaphase-anaphase 23. Perte de Esco2 chez le poisson zèbre conduit à chromosome mauvaise ségrégation, prématurée des chromatides sœurs séparation, l&#39; instabilité génomique, et p53-dépendante et l&#39; apoptose indépendante 24,25. En raison de la disponibilité, auroraB hi1045 et hi2865 de esco2 zebrafish mutant (ci - après dénommé aurB m / m et esco2 m / m, respectivement) sera utilisé pour illustrer cette technique 25-27. Couplage microscopie confocale à fluorescence machinerie cellulaire étiquetée a permis aux chercheurs de visualiser la chromatine et la membrane cellulaire lors de la mitose dynamique 25,28,29. histones fluorescents marqués ont été historiquement utilisé pour visualiser la chromatine. Les histones sont des protéines nucléaires composées de quatre paires différentes (H2A, H2B, H3 et H4) qui sont responsables de la structure des nucléosomes qui compose les chromosomes 30. Alors que H2B est sans doute le histone le plus utilisé pour des protéines fluorescentes dansla souris et de la culture cellulaire, l&#39; utilisation de Histone 2A, Z de famille (H2A.F / Z) a bien prouvé pour une utilisation dans zebrafish 31,32. Concanavaline A et la caséine kinase 1-gamma par exemple, à localiser la membrane cellulaire et ont été précédemment montré efficace pour la visualisation de la membrane cellulaire dans les oursins et 33,34 drosophile. D&#39; autres études ont montré que la protéine fluorescente CAAX étiquetée étiquettes de la membrane cellulaire et a réussi à 31 zebrafish. CAAX est un motif qui est reconnu par les enzymes de modification post-traductionnelles telles que farnesyltransferases et geranylgeranyltransferases. Modifications par ces enzymes provoquent des protéines à devenir associées à la membrane, ainsi le marquage de la membrane cellulaire 35. En raison de l&#39;utilisation préalable zebrafish, ce protocole a choisi d&#39;utiliser H2A.F / Z et CAAX pour marquer la chromatine et la membrane cellulaire. L&#39;application de cette méthode permettra au chercheur de surveiller la mitose au niveau de la cellule individuelle pour observer le chromosome individueldynamique, comme le suivi ainsi que simultanément plusieurs divisions cellulaires qui peuvent influer sur la différenciation et le développement des tissus. Cet article se concentrera sur l&#39;imagerie de la dynamique de la ségrégation des chromosomes lors de la mitose au niveau de la cellule individuelle. Dans ce manuscrit, la capacité d&#39;observer plusieurs divisions mitotiques, calculer le temps de division, et de déchiffrer les phénotypes mitotiques sera illustrée et discutée. En utilisant ces paramètres, physiologiquement les données pertinentes peuvent être collectées et appliquées à plusieurs états pathologiques affectés par des défauts mitotiques.

<table><tbody><tr><td>Vecteurs pCS2</td><td>Don de K. Kwan</td><td></td><td>Pour le plasmide d’intérêt Enzyme de</td></tr><tr><td>restriction NotI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3189S</td><td>Pour la digestion de restriction du plasmide</td></tr><tr><td>mMessage SP6 kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td>Pour la transcription in vitro</td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Pour purifier l’ARNm</td></tr><tr><td>100 x 15 mm Boîtes de Pétri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>Pour l’hébergement des embryons moule</td></tr><tr>de<td>micro-injection</td><td>fait maison</td><td></td><td>Pour maintenir les embryons lors de la micro-injection</td></tr><tr><td>Agarose II</td><td>Amresco</td><td>0815-25G</td><td>Pour l’enrobage des embryons</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td>Pour anesthésier les embryons</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>Pour l’eau embryonnaire (E3 Blue), dissoute dans UltraPure H2</td></tr><tr><td>O Chlorure de potassium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>Pour l’eau embryonnaire (E3 Blue), dissoute dans UltraPure H2</td></tr><tr><td>O Chlorure de calcium dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td>Pour l’eau embryonnaire (E3 Blue), dissoute dans UltraPure H2</td></tr><tr><td>O Magnesium Sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>M7506</td><td>Pour l’eau embryonnaire (E3 Blue), dissoute dans un tube de culture UltraPure H>2O</td></tr><tr><td>Methylene Blue Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MB1</td><td>Pour l’eau embryonnaire (E3 Blue), dissoute dans un tube de culture de 100 mm UltraPure H<sub2O</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>50-819-812</td><td>Pour gélose fondue</td></tr><tr><td>Plat de culture à fond de lamelle en verre de 35 mm&nbsp ;</td><td>MatTek Corp</td><td>P35G-0-20-C&nbsp ;</td><td>N° 0, verre de 20 mm, pour l’enrobage d’embryons</td></tr><tr><td>#5 pince à épiler</td><td>Dumont</td><td>72701-D</td><td>Pour déchorionner les embryons</td></tr><tr><td>21 G Aiguille de calibre 1 1/2</td><td>Becton Dickinson</td><td>305167</td><td>Pour positionner les embryons dans un</td></tr><tr><td>microscope de dissection</td> de gélose <td>Nikon AZ100</td><td></td><td>Pour le dépistage et l’intégration d’embryons, n’importe quelle lunette de dissection fera l’affaire</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Nikon A1+</td><td></td><td>Pour l’imagerie en accéléré</td></tr><tr><td>Logiciel confocal</td><td>NIS Elements AR 4.13.00</td><td></td><td>Pour l’acquisition et le traitement d’images</td></tr></tbody></table>

observer division et dynamique mitotique dans un embryon de poisson zèbre en direct

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

La mitose est critique pour la croissance de organismal et la différenciation. Le processus est très dynamique et nécessite ordonné des événements pour accomplir la condensation appropriée de la chromatine, l&#39;attachement des microtubules-kinétochore, la ségrégation des chromosomes, et la cytokinèse dans un petit cadre de temps. Des erreurs dans le délicat processus peut entraîner des maladies humaines, y compris des malformations congénitales et le cancer. Les approches traditionnelles de l&#39;enquête états pathologiques mitotique humains reposent souvent sur des systèmes de culture cellulaire, qui manquent de la physiologie naturelle et contexte de développement / tissu-spécifique avantageux lors de l&#39;étude des maladies humaines. Ce protocole permet de surmonter de nombreux obstacles en fournissant un moyen de visualiser, avec une haute résolution, la dynamique des chromosomes dans un système de vertébrés, le poisson zèbre. Ce protocole détaille une approche qui peut être utilisée pour obtenir des images dynamiques de cellules en division, qui comprennent: la transcription in vitro, l&#39; élevage du poisson zèbre / collecte, embryon plongement et imagerie time-lapse. Optimisation et modifications de ce protocole sont également explorées. Utilisation de H2A.F / Z-EGFP (étiquettes chromatine) et mCherry-CAAX (de la membrane cellulaire des étiquettes) des embryons d&#39;ARNm-injecté, mitose dans de type sauvage AB, auroraB hi1045 et hi2865 de esco2 zebrafish mutant est visualisé. Imagerie haute résolution en direct chez le poisson zèbre permet d&#39;observer plusieurs mitoses à quantifier statistiquement défauts mitotiques et le timing de la progression mitotique. En outre, l&#39; observation des aspects qualitatifs qui définissent les processus inappropriés mitotiques ( par exemple, des défauts de congression, de chromosomes mauvaise ségrégation, etc.) et les résultats chromosomiques incorrecte (ie, aneuploïdie, polyploïdie, micronoyaux, etc.) sont respectées. Cet essai peut être appliqué à l&#39;observation de la différenciation tissulaire / développement et se prête à l&#39;utilisation du poisson zèbre mutant et agents pharmacologiques. Visualisation de la façon dont les défauts en mitose conduisent à des troubles du cancer et de développement sera grandementaméliorer la compréhension de la pathogenèse de la maladie.

La figure 2 montre la capacité d&#39;observer de nombreuses divisions cellulaires en utilisant une large vue d&#39;un AB de type sauvage queue de poisson zèbre champ. Plus de sept cellules en mitose sont imagés dans un laps de temps de 14 min (Movie 1). Dans les deux heures de temps bien sûr, plus de 40 événements mitotiques ont été capturés. En moyenne, 50 cellules en division ont été observées dans l&#39;AB et 30 cellules qui se divisent en aur B</...

La mitose est essentielle à tout organisme vivant et les défauts entraînent souvent le cancer et des troubles du développement. En utilisant ce protocole d’imagerie et le poisson-zèbre comme système modèle, les chercheurs peuvent visualiser la mitose dans un organisme vertébré vivant et la multitude de défauts qui se produisent lorsque les processus mitotiques sont défectueux.

Observer Division et dynamique mitotique dans un embryon de poisson zèbre en direct

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

L'objectif général de cette procédure est de surveiller la fidélité de la ségrégation chromosomique pendant la mitose dans un embryon de poisson zèbre vivant, en utilisant des protéines de la chromatine et de la membrane cellulaire marquées au fluorochrome, qui seront capturées par microscopie confocale à haute résolution. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la mitose, telles que : comment les défauts mitotiques entraînent-ils un défaut de développement ou la formation d'une tumeur dans un organisme vertébré vivant ? Le principal avantage de cette technique est que nous observons la mitose dans un organisme vertébré vivant, ce qui permet de recueillir des données physiologiquement pertinentes.Après avoir fait se reproduire des zebrafish adultes et injecté des œufs avec l'ARN H2A.F/Z-EGFP et/ou pCS2 mCherry-CAAX, environ deux heures avant l'imagerie, utilisez un microscope stéréo fluorescent pour identifier les embryons positifs pour la GFP. Transférez les embryons exprimant une forte fluorescence verte dans une nouvelle boîte de Pétri de 100 par 15 millimètres contenant du milieu E3 bleu.Faites bouillir une solution mère d'agarose à faible point de fusion à 1 % dans du E3 bleu. Répartissez trois millilitres d'agarose fondu dans un tube de culture de 17 par 100 millimètres. Maintenez l'agarose au chaud en plaçant le tube de culture dans un bain-marie à 42 degrés Celsius jusqu'à son utilisation.Prélevez de la tricaïne à 15 millimolaire, des embryons sélectionnés, de l'agarose à bas point de fusion, du E3 bleu, une boîte de culture de 35 millimètres à fond en lame de verre, ainsi qu'un microscope stéréo. Ensuite, à l'aide de pincettes de type n°5, retirez soigneusement les choriions de trois embryons, puis placez les embryons dans un récipient séparé afin de les anesthésier. Puis, à l'aide d'une pipette de transfert, ajoutez trois gouttes de tricaïne à 15 millimolaire dans la boîte contenant les embryons et cinq millilitres de milieu.Ajouter trois à quatre gouttes de solution de tricaïne à 15 millimolaire dans le tube contenant de l'agarose fondu à 1 %. Lorsque les embryons sont suffisamment anesthésiés, transférer les embryons anesthésiés dans la boîte munie d’un fond en lamelle à l’aide d’un Pipetman P200 dont un centimètre de l’embout a été coupé. Éliminer toute solution excédentaire de tricaïne E3 bleue.Ajouter lentement cinq à 10 microlitres de solution d'agarose à bas point de fusion au tricaine sur les embryons, en gardant chaque goutte séparée, afin de s'assurer que les embryons ne dérivent pas vers des positions proches les unes des autres. Ensuite, à l’aide d’une aiguille de 1,5 pouce de calibre 21, orienter délicatement les embryons dans l’agarose vers la position souhaitée, en plaçant la région d’intérêt aussi près que possible de la lame si l’on utilise un microscope inversé. En raison des déplacements possibles, il peut être nécessaire de revenir sur chaque embryon pour s’assurer qu’il reste dans la position requise.Cela peut devoir être répété plusieurs fois jusqu'à ce que la position idéale soit atteinte pendant la solidification de l'agar. Après quelques minutes, pour vérifier la prise, utilisez une aiguille pour séparer un petit morceau d'agarose. Lorsqu'il peut être détaché de la goutte, ajoutez de l'agarose à bas point de fusion pour former une coupole recouvrant entièrement les embryons inclus, en couvrant toute la lamelle.Pendant que l'agarose durcit, préparez trois millilitres de milieu E3 bleu contenant cinq gouttes de tricaïne à 15 millimolaire, qui seront ajoutés sur les embryons inclus lors de l'acquisition d'images. Pour réaliser l'imagerie confocale 5D d'embryons de poisson zèbre vivants, ouvrez le logiciel d'imagerie et réglez le microscope sur un objectif de 60X à ouverture numérique 1,4. Appliquez de l'huile d'immersion sur l'objectif, puis placez la boîte de culture dans le porte-lame fixé sur la platine du microscope.À l’aide du contrôleur d’axes, positionner au centre l’embryon d’intérêt au-dessus de l’objectif et monter l’objectif jusqu’au plat de culture. Verser la solution E3 bleue et la tricaïne sur les embryons inclus dans l’agar. Ensuite, cliquer sur l’icône du porte-oculaire pour observer les embryons à travers l’oculaire.Désactivez la sélection du port oculaire, puis choisissez Affichage, Contrôles d'acquisition, Zone de balayage A1, afin d'ouvrir l'outil de zone de balayage A1. Sélectionnez le canal GFP, redémarrez le balayage et focalisez-vous sur une région d'intérêt proche de la lame. Arrêtez le balayage, sélectionnez les canaux GFP et mCherry, puis réglez l'option de moyenne des lignes sur normale.Choisissez maintenant Affichage, Commandes d'acquisition, Acquisition ND, pour ouvrir l'outil d'acquisition ND A1. Commencez la numérisation. Ensuite, à l'aide du contrôleur d'axes, positionnez les embryons de manière à ce que la zone de numérisation soit remplie au maximum par le poisson zèbre.Définir la limite supérieure de la pile Z à l'endroit où les cellules sortent du foyer, en prévoyant un espace supplémentaire de trois micromètres au-dessus de l'échantillon, pour permettre la croissance et le déplacement cellulaire. Ensuite, régler la limite inférieure à l'endroit où les cellules ne sont plus visibles, et fixer l'intervalle du pas Z à deux micromètres. Pour les expériences présentées ici, ajuster respectivement la puissance du laser d'acquisition, le HV ou le gain, et les niveaux de décalage, comme indiqués ci-dessous.Une fois les paramètres définis, arrêtez la numérisation pour éviter une exposition inutile au laser, qui pourrait provoquer une phototoxicité et un photoblanchiment de l'échantillon. Sélectionnez maintenant l'icône de moyenne sur 2 lignes, qui offre la meilleure qualité d'image et le temps de balayage le plus rapide. Choisissez l'intervalle de temps et la durée expérimentale appropriés nécessaires pour l'expérience.Pour les divisions cellulaires de type sauvage, des intervalles de deux minutes sur une durée de deux heures sont suffisants pour déterminer la durée de la mitose. Les divisions qui activent le point de contrôle de l'assemblage du fuseau pendant plus de trente minutes conviennent mieux à des intervalles de quatre à cinq minutes sur quatre heures, afin de préserver la fluorescence, comme illustré ici. Pour enregistrer automatiquement le fichier pendant son acquisition, cochez la case Enregistrer dans un fichier et donnez un nom au fichier.Enfin, vérifiez soigneusement que tous les paramètres sont correctement définis, puis cliquez sur Exécuter maintenant. Une fois l'acquisition terminée, pour visualiser le fichier en format tridimensionnel, cliquez sur l'icône Seuil de volume. Cette figure illustre la capacité d'observer de nombreuses divisions cellulaires en utilisant un champ de vision large sur la queue d'un poisson-zèbre de type sauvage AB.Les divisions cellulaires sont indiquées par des astérisques. Le film correspondant est montré ici. En moyenne, 50 cellules en division dans AB et 30 cellules en division chez le mutant aurora B ont été observées.Pour tenir compte du nombre réduit de cellules en mitose observées dans l'embryon mutant de l'aurora B, le ratio de cellules en mitose par rapport au nombre total de cellules observées a été calculé, suggérant qu'il n'y a pas moins de cellules traversant la mitose dans les embryons mutants de l'aurora B, mais plutôt un nombre moindre de cellules totales observées. Pour quantifier la durée de la mitose, le nombre d'intervalles temporels correspondant à une division cellulaire est multiplié par l'intervalle de temps entre chaque série Z. Comme le révèle ce graphique, la durée moyenne de division pour le type sauvage AB est de 25 minutes, contre 58 minutes pour le mutant aurora B.Comme observé chez les embryons de type sauvage, chaque phase mitotique peut être distinguée. Toutefois, des anomalies mitotiques sont observées chez l'embryon mutant aurora B, incluant un arrêt en mitose et une cytokinèse défectueuse, conduisant à la formation d'une cellule binucléée, puis à l'apparition de micronoyaux, ce qui explique le temps de division accru mesuré chez ce mutant. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure, depuis le criblage des embryons jusqu'à la mise en place des paramètres du microscope confocal.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit le contexte de l'expérience en cours, notamment en ce qui concerne la région d'intérêt, la durée, l'intervalle de temps et la profondeur en Z. Cela permettra d'optimiser l'efficacité tout en évitant le photoblanchiment et la phototoxicité. Après cette procédure, d'autres méthodes, comme les préparations de chromosomes étalés, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires sur la cause des anomalies mitotiques observées, ou l'utilisation d'un traitement pharmacologique pour déterminer ses effets sur la progression, la durée de la mitose ou le destin cellulaire.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine de la biologie pour explorer la mitose dans le contexte de la biologie du développement et de la cancérologie en utilisant le poisson zèbre. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d'incorporer des embryons de poisson zèbre, d'acquérir des images en direct de la mitose, et d'analyser la fréquence mitotique, la durée et le destin cellulaire. N'oubliez pas que travailler avec des lasers puissants et des lumières fluorescentes peut nuire aux yeux, et que des précautions, telles que l'évitement du contact direct des yeux avec les lasers, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

observing-mitotic-division-and-dynamics-in-a-live-zebrafish-embryo

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode permettant d'analyser le cerveau des vertébrés en développement dans embryons de poissons zèbres vivent à la résolution seule cellule par microscopie confocale. Cela inclut la méthode par laquelle nous injectons de l'embryon de poisson zèbre à cellule unique, puis monter et l'image du cerveau en développement.

En direct l&#39;imagerie du cerveau de poisson zèbre embryonnaires par microscopie confocale

La vidéo montre le présent une méthode qui prend avantage de la combinaison de l'électroporation et la microscopie confocale pour l'imagerie en direct sur chaque cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur poisson zèbre en développement.

Imagerie time-lapse en direct de relation clonale cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur développement Zebrafish

Processus de développement tels que la prolifération, la structuration, la différenciation et le guidage axonal peuvent être facilement modélisés dans la moelle épinière du poisson zèbre. Dans cet article, nous décrivons une procédure de montage pour embryons de poisson zèbre, qui optimise la visualisation de ces événements.

Dissection et montage latéral embryons de poisson zèbre: Analyse de la moelle épinière développement

L’imagerie du comportement dynamique des organites et d’autres structures subcellulaires in vivo peut faire la lumière sur leur fonction dans des conditions physiologiques et pathologiques. Ici, nous présentons des méthodes de marquage génétique de deux organites, les centrosomes et les mitochondries, et d’imagerie de leur dynamique dans des embryons de poisson-zèbre vivants à l’aide de la microscopie à grand champ et confocale.

Imagerie Structures subcellulaires dans le Embryo Living Zebrafish

Ici, nous présentons une méthode de montage polyvalente qui permet l’imagerie à long terme en accéléré du développement postérieur du corps d’embryons de poisson-zèbre vivants sans perturber le développement normal.

Une méthode de montage polyvalent pour l&#39;imagerie à long terme du développement Zebrafish

Une combinaison des techniques optiques avancées de lecture avec excitation de fluorescence multi-photons longue longueur d’onde de laser a été mis en œuvre pour capturer l’imagerie haute résolution, en trois dimensions, en temps réel de la migration de la crête neurale en Tg (sox10:EGFP) et les embryons de poissons zèbres Tg (foxd3:GFP).

Multiphotonique Time Lapse imagerie de visualiser le développement en temps réel : visualisation de la migration des cellules neurales de crête dans des embryons de poisson-zèbre

Ici, nous montrons le processus de création d’une ligne de poisson-zèbre de journaliste tension électrique cellulaire afin de visualiser le développement embryonnaire, mouvement, et des cellules de tumeur de poissons in vivo.

Visualisation de l’activité électrique cellulaire dans les jeunes embryons de poisson-zèbre et tumeurs

Ce protocole décrit une approche pour l’étiquetage in toto et l’imagerie multidimensionnelle du développement oculaire précoce du poisson-zèbre. Nous décrivons l’étiquetage, l’intégration et l’imagerie quadridimensionnelle (4D) à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser, ainsi que les considérations relatives à l’optimisation de l’acquisition d’ensembles de données pour disséquer les mécanismes de morphogenèse optique en coupe.

Imagerie en 4 dimensions de la morphogenèse de la coupe optique du poisson-zèbre

Nous faisons la démonstration d’une méthode qui tire parti de la microscopie confocale à balayage rapide pour effectuer une imagerie en direct des cellules microgliales dans le tectum optique du poisson-zèbre en développement, permettant ainsi l’analyse de la dynamique de ces cellules in vivo.

Imagerie en direct et caractérisation de la dynamique de la microglie chez l’embryon de poisson-zèbre

Une stratégie de préparation d’échantillons pour l’imagerie d’embryons précoces de poisson-zèbre dans un chorion intact à l’aide d’un microscope à feuillet de lumière est décrite. Il analyse les différentes orientations que les embryons acquièrent à l’intérieur du chorion aux stades épibolique et bourgeonnaire à 70 % et détaille les stratégies d’imagerie pour obtenir une résolution à l’échelle cellulaire dans tout l’embryon à l’aide du système de feuillet lumineux.

Stratégies d’imagerie et de montage par microscopie à feuillet de lumière pour les embryons précoces de poisson-zèbre

Découvrez la visualisation de la mitose en direct dans des embryons de poisson zèbre en utilisant des protéines fluorescentes et la microscopie confocale à haute résolution. Cette méthode permet d'étudier la ségrégation chromosomique et ses implications dans le développement et la formation tumorale.

Observer Division et dynamique mitotique dans un embryon de poisson zèbre en direct

Explorer plus de vidéos