Observer Division et dynamique mitotique dans un embryon de poisson zèbre en direct

L’objectif global de cette procédure est de surveiller la fidélité de la ségrégation des chromosomes pendant la mitose dans un embryon de poisson-zèbre vivant en utilisant de la chromatine et des protéines de membrane cellulaire marquées par fluorescence qui seront capturées à l’aide de la microscopie confocale à haute résolution. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la mitose, telles que comment les défauts mitotiques entraînent-ils un défaut de développement ou la formation d’une tumeur dans un organisme vertébré vivant ? Le principal avantage de cette technique est que nous observons la mitose dans un organisme vertébré vivant, ce qui permet de collecter des données pertinentes sur le plan physique.

Après avoir élevé des poissons-zèbres adultes et injecté des œufs avec H2A. L’ARN F/Z-EGFP et/ou pCS2 mCherry-CAAX, environ deux heures avant l’imagerie, utilise un microscope à dissection fluorescente pour identifier les embryons positifs à la GFP. Transférez les embryons vert vif exprimant la GFP dans une nouvelle boîte de Pétri de 100 x 15 millimètres avec un milieu bleu E3.

Faire bouillir une solution mère de 1 % d’agarose à bas point de fusion dans du bleu E3. Aliquote trois millilitres d’agarose fondue dans un tube de culture de 17 x 100 millimètres. Gardez l’agarose au chaud en plaçant le tube de culture dans un bain-marie à 42 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.

Rassemblez de la tricaïne de 15 millimolaires, des embryons criblés, de l’agarose à bas point de fusion, du bleu E3 et une boîte de culture à fond de lamelle en verre de 35 millimètres, ainsi qu’un microscope optique de dissection. Ensuite, avec la pince à épiler numéro cinq, retirez soigneusement les chorions de trois embryons et placez les embryons dans un récipient séparé pour être anesthésiés. Ensuite, à l’aide d’une pipette de transfert, ajoutez trois gouttes de tricaïne de 15 millimolaires dans la boîte contenant les embryons et cinq millilitres de milieu.

Ajouter trois à quatre gouttes de solution de tricaïne de 15 millimolaires dans le tube d’agarose fondu à 1 %. Lorsque les embryons sont suffisamment anesthésiés, à l’aide d’un Pipetman P200, avec un centimètre de la pointe de la pipette coupé, transférez les embryons anesthésiés dans la boîte à fond de lamelle. Retirez tout excès de solution de tricaïne bleue E3.

Ajoutez lentement cinq à 10 microlitres de solution d’agarose-tricaïne à faible point de fusion sur les embryons, en gardant chaque goutte séparée, pour vous assurer que les embryons ne dérivent pas les uns des autres. Ensuite, à l’aide d’une aiguille et demie de calibre 21, orientez doucement les embryons dans l’agarose jusqu’à la position souhaitée, en orientant la région d’intérêt aussi près que possible de la lamelle si vous utilisez un microscope inversé. En raison du déplacement qui peut se produire, il peut être nécessaire de retourner à chaque embryon pour s’assurer qu’il reste dans la position requise.

Il peut être nécessaire de le faire plusieurs fois, jusqu’à ce que la position idéale soit atteinte au fur et à mesure que la gélose se solidifie. Après quelques minutes, pour tester s’il est pris, utilisez une aiguille pour briser un petit morceau d’agarose. Lorsqu’il peut être retiré de la goutte, utilisez de l’agarose à bas point de fusion supplémentaire pour former un dôme sur les embryons incrustés, couvrant toute la lamelle.

Pendant que l’agarose se solidifie, préparez trois millilitres de milieu bleu E3 avec cinq gouttes de tricaïne de 15 millimolaires, à placer sur les embryons incrustés pendant l’imagerie. Pour effectuer une imagerie confocale 5D d’embryons de poissons-zèbres vivants, ouvrez le logiciel d’imagerie et réglez le microscope sur un objectif numérique 60X 1,4. Appliquez de l’huile d’immersion sur l’objectif et placez la boîte de culture dans le support de lames sur la platine du microscope.

À l’aide du contrôleur d’axe, centrez l’embryon d’intérêt au-dessus de la lentille de l’objectif et soulevez la lentille pour qu’elle rencontre la boîte de culture. Versez la solution de bleu E3 et de tricaïne sur les embryons incrustés dans l’agar. Ensuite, cliquez sur l’icône de l’orifice pour voir les embryons à travers l’oculaire.

Désactivez la sélection du port oculaire et choisissez Affichage, Commandes d’acquisition, Zone de balayage A1, pour ouvrir l’outil Zone de balayage A1. Sélectionnez le canal GFP, redémarrez le balayage et concentrez-vous sur une région d’intérêt proche de la lamelle. Arrêtez le balayage, sélectionnez les canaux GFP et mCherry, puis réglez l’option de calcul de la moyenne de ligne sur normal.

Maintenant, choisissez Affichage, Contrôles d’acquisition, Acquisition ND, pour ouvrir l’outil Acquisition ND A1. Lancez l’analyse. Ensuite, à l’aide du contrôleur d’axe, positionnez les embryons de manière à ce que la zone de balayage soit remplie d’autant de poisson-zèbre que possible.

Réglez la limite supérieure de l’empilement Z à l’endroit où les cellules sont floues, ce qui permet un espace supplémentaire de trois micromètres au-dessus de l’échantillon, pour la croissance et le mouvement des cellules. Ensuite, définissez la limite inférieure à l’endroit où les cellules ne sont plus visibles et définissez la taille du pas de l’intervalle Z sur deux micromètres. Pour les expériences présentées ici, ajustez respectivement la puissance du laser d’imagerie, HV ou gain et les niveaux de décalage, comme indiqué ci-dessous.

Une fois les paramètres définis, arrêtez le balayage pour éviter une exposition inutile au laser qui pourrait provoquer une phototoxicité et un photoblanchiment de l’échantillon. Maintenant, sélectionnez l’icône de moyenne de ligne 2X, qui offre la meilleure qualité d’image et le temps de numérisation le plus rapide. Sélectionnez l’intervalle de temps et la durée nécessaires à l’expérience.

Pour les divisions cellulaires de type sauvage, des intervalles de temps de deux minutes pour une durée de deux heures sont suffisants pour déterminer la durée mitotique. Les divisions qui activent le point de contrôle de l’assemblage de la broche pendant plus de trente minutes sont plus adaptées à des intervalles de quatre à cinq minutes pendant quatre heures, afin de conserver la fluorescence, comme démontré ici. Pour enregistrer automatiquement le fichier au fur et à mesure de son acquisition, cochez la case Enregistrer dans le fichier et nommez le fichier.

Enfin, vérifiez que tous les paramètres sont correctement définis et appuyez sur Exécuter maintenant. Une fois l’acquisition terminée, pour afficher le fichier dans un format tridimensionnel, cliquez sur l’icône Seuil de volume. Cette figure démontre la capacité d’observer de nombreuses divisions cellulaires en utilisant un large champ de vision de la queue d’un poisson zèbre sauvage de type AB.

Les divisions cellulaires sont signalées par des astérisques. Le film correspondant est projeté ici. En moyenne, 50 cellules en division chez AB et 30 cellules en division chez le mutant Aurora B ont été observées.

Pour tenir compte du nombre réduit de cellules mitotiques imagées dans l’embryon du mutant Aurora B, le rapport entre les cellules mitotiques et le nombre de cellules imagées a été calculé, suggérant qu’il n’y a pas un nombre inférieur de cellules passant par la mitose dans les embryons mutants Aurora B, mais plutôt un nombre inférieur de cellules totales imagées. Pour quantifier la durée mitotique, le nombre d’intervalles de temps qui occupent une division cellulaire est multiplié par l’intervalle de temps entre chaque pile Z. Comme le révèle ce graphique, le temps moyen de division AB de type sauvage est de 25 minutes, et de 58 minutes pour le mutant aurora B.

Comme on le voit chez les embryons de type sauvage, chaque phase mitotique peut être distinguée. Cependant, des défauts mitotiques sont observés dans l’embryon du mutant Aurora B, qui comprennent l’arrêt mitotique et la cytokinèse limée, entraînant une cellule binucléée, et la formation ultérieure de micronoyaux, qui soutiennent l’augmentation du temps de division mesurée chez ce mutant. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure, du dépistage des embryons à la mise en place des paramètres du microscope confocal

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler le contexte de l’expérience en cours, car il concerne la région d’intérêt, la durée du temps, l’intervalle de temps et la profondeur Z. Cela aidera à maximiser l’efficacité, ainsi qu’à prévenir le photoblanchiment et la phototoxicité. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, comme la propagation des chromosomes, peuvent être mises en œuvre pour répondre à des questions supplémentaires sur la cause des défauts mitotiques observés, ou l’utilisation d’un traitement médicamenteux pour déterminer les effets sur la progression mitotique, la durée ou le destin cellulaire.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie pour explorer la mitose dans le contexte de la biologie du développement et du cancer à l’aide du poisson-zèbre. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’intégrer des embryons de poisson-zèbre, de capturer une imagerie en direct de la mitose et d’analyser la fréquence mitotique, la durée et le destin cellulaire. N’oubliez pas que travailler avec des lasers de haute puissance et de la lumière fluorescente peut être préjudiciable aux yeux, et des précautions, telles que d’éviter le contact visuel direct avec les lasers, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.