Observer Division et dynamique mitotique dans un embryon de poisson zèbre en direct

L'objectif général de cette procédure est de surveiller la fidélité de la ségrégation chromosomique pendant la mitose dans un embryon de poisson zèbre vivant, en utilisant des protéines de la chromatine et de la membrane cellulaire marquées au fluorochrome, qui seront capturées par microscopie confocale à haute résolution. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la mitose, telles que : comment les défauts mitotiques entraînent-ils un défaut de développement ou la formation d'une tumeur dans un organisme vertébré vivant ? Le principal avantage de cette technique est que nous observons la mitose dans un organisme vertébré vivant, ce qui permet de recueillir des données physiologiquement pertinentes.

Après avoir fait se reproduire des zebrafish adultes et injecté des œufs avec l'ARN H2A.F/Z-EGFP et/ou pCS2 mCherry-CAAX, environ deux heures avant l'imagerie, utilisez un microscope stéréo fluorescent pour identifier les embryons positifs pour la GFP. Transférez les embryons exprimant une forte fluorescence verte dans une nouvelle boîte de Pétri de 100 par 15 millimètres contenant du milieu E3 bleu.

Faites bouillir une solution mère d'agarose à faible point de fusion à 1 % dans du E3 bleu. Répartissez trois millilitres d'agarose fondu dans un tube de culture de 17 par 100 millimètres. Maintenez l'agarose au chaud en plaçant le tube de culture dans un bain-marie à 42 degrés Celsius jusqu'à son utilisation.

Prélevez de la tricaïne à 15 millimolaire, des embryons sélectionnés, de l'agarose à bas point de fusion, du E3 bleu, une boîte de culture de 35 millimètres à fond en lame de verre, ainsi qu'un microscope stéréo. Ensuite, à l'aide de pincettes de type n°5, retirez soigneusement les choriions de trois embryons, puis placez les embryons dans un récipient séparé afin de les anesthésier. Puis, à l'aide d'une pipette de transfert, ajoutez trois gouttes de tricaïne à 15 millimolaire dans la boîte contenant les embryons et cinq millilitres de milieu.

Ajouter trois à quatre gouttes de solution de tricaïne à 15 millimolaire dans le tube contenant de l'agarose fondu à 1 %. Lorsque les embryons sont suffisamment anesthésiés, transférer les embryons anesthésiés dans la boîte munie d’un fond en lamelle à l’aide d’un Pipetman P200 dont un centimètre de l’embout a été coupé. Éliminer toute solution excédentaire de tricaïne E3 bleue.

Ajouter lentement cinq à 10 microlitres de solution d'agarose à bas point de fusion au tricaine sur les embryons, en gardant chaque goutte séparée, afin de s'assurer que les embryons ne dérivent pas vers des positions proches les unes des autres. Ensuite, à l’aide d’une aiguille de 1,5 pouce de calibre 21, orienter délicatement les embryons dans l’agarose vers la position souhaitée, en plaçant la région d’intérêt aussi près que possible de la lame si l’on utilise un microscope inversé. En raison des déplacements possibles, il peut être nécessaire de revenir sur chaque embryon pour s’assurer qu’il reste dans la position requise.

Cela peut devoir être répété plusieurs fois jusqu'à ce que la position idéale soit atteinte pendant la solidification de l'agar. Après quelques minutes, pour vérifier la prise, utilisez une aiguille pour séparer un petit morceau d'agarose. Lorsqu'il peut être détaché de la goutte, ajoutez de l'agarose à bas point de fusion pour former une coupole recouvrant entièrement les embryons inclus, en couvrant toute la lamelle.

Pendant que l'agarose durcit, préparez trois millilitres de milieu E3 bleu contenant cinq gouttes de tricaïne à 15 millimolaire, qui seront ajoutés sur les embryons inclus lors de l'acquisition d'images. Pour réaliser l'imagerie confocale 5D d'embryons de poisson zèbre vivants, ouvrez le logiciel d'imagerie et réglez le microscope sur un objectif de 60X à ouverture numérique 1,4. Appliquez de l'huile d'immersion sur l'objectif, puis placez la boîte de culture dans le porte-lame fixé sur la platine du microscope.

À l’aide du contrôleur d’axes, positionner au centre l’embryon d’intérêt au-dessus de l’objectif et monter l’objectif jusqu’au plat de culture. Verser la solution E3 bleue et la tricaïne sur les embryons inclus dans l’agar. Ensuite, cliquer sur l’icône du porte-oculaire pour observer les embryons à travers l’oculaire.

Désactivez la sélection du port oculaire, puis choisissez Affichage, Contrôles d'acquisition, Zone de balayage A1, afin d'ouvrir l'outil de zone de balayage A1. Sélectionnez le canal GFP, redémarrez le balayage et focalisez-vous sur une région d'intérêt proche de la lame. Arrêtez le balayage, sélectionnez les canaux GFP et mCherry, puis réglez l'option de moyenne des lignes sur normale.

Choisissez maintenant Affichage, Commandes d'acquisition, Acquisition ND, pour ouvrir l'outil d'acquisition ND A1. Commencez la numérisation. Ensuite, à l'aide du contrôleur d'axes, positionnez les embryons de manière à ce que la zone de numérisation soit remplie au maximum par le poisson zèbre.

Définir la limite supérieure de la pile Z à l'endroit où les cellules sortent du foyer, en prévoyant un espace supplémentaire de trois micromètres au-dessus de l'échantillon, pour permettre la croissance et le déplacement cellulaire. Ensuite, régler la limite inférieure à l'endroit où les cellules ne sont plus visibles, et fixer l'intervalle du pas Z à deux micromètres. Pour les expériences présentées ici, ajuster respectivement la puissance du laser d'acquisition, le HV ou le gain, et les niveaux de décalage, comme indiqués ci-dessous.

Une fois les paramètres définis, arrêtez la numérisation pour éviter une exposition inutile au laser, qui pourrait provoquer une phototoxicité et un photoblanchiment de l'échantillon. Sélectionnez maintenant l'icône de moyenne sur 2 lignes, qui offre la meilleure qualité d'image et le temps de balayage le plus rapide. Choisissez l'intervalle de temps et la durée expérimentale appropriés nécessaires pour l'expérience.

Pour les divisions cellulaires de type sauvage, des intervalles de deux minutes sur une durée de deux heures sont suffisants pour déterminer la durée de la mitose. Les divisions qui activent le point de contrôle de l'assemblage du fuseau pendant plus de trente minutes conviennent mieux à des intervalles de quatre à cinq minutes sur quatre heures, afin de préserver la fluorescence, comme illustré ici. Pour enregistrer automatiquement le fichier pendant son acquisition, cochez la case Enregistrer dans un fichier et donnez un nom au fichier.

Enfin, vérifiez soigneusement que tous les paramètres sont correctement définis, puis cliquez sur Exécuter maintenant. Une fois l'acquisition terminée, pour visualiser le fichier en format tridimensionnel, cliquez sur l'icône Seuil de volume. Cette figure illustre la capacité d'observer de nombreuses divisions cellulaires en utilisant un champ de vision large sur la queue d'un poisson-zèbre de type sauvage AB.

Les divisions cellulaires sont indiquées par des astérisques. Le film correspondant est montré ici. En moyenne, 50 cellules en division dans AB et 30 cellules en division chez le mutant aurora B ont été observées.

Pour tenir compte du nombre réduit de cellules en mitose observées dans l'embryon mutant de l'aurora B, le ratio de cellules en mitose par rapport au nombre total de cellules observées a été calculé, suggérant qu'il n'y a pas moins de cellules traversant la mitose dans les embryons mutants de l'aurora B, mais plutôt un nombre moindre de cellules totales observées. Pour quantifier la durée de la mitose, le nombre d'intervalles temporels correspondant à une division cellulaire est multiplié par l'intervalle de temps entre chaque série Z. Comme le révèle ce graphique, la durée moyenne de division pour le type sauvage AB est de 25 minutes, contre 58 minutes pour le mutant aurora B.

Comme observé chez les embryons de type sauvage, chaque phase mitotique peut être distinguée. Toutefois, des anomalies mitotiques sont observées chez l'embryon mutant aurora B, incluant un arrêt en mitose et une cytokinèse défectueuse, conduisant à la formation d'une cellule binucléée, puis à l'apparition de micronoyaux, ce qui explique le temps de division accru mesuré chez ce mutant. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure, depuis le criblage des embryons jusqu'à la mise en place des paramètres du microscope confocal.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit le contexte de l'expérience en cours, notamment en ce qui concerne la région d'intérêt, la durée, l'intervalle de temps et la profondeur en Z. Cela permettra d'optimiser l'efficacité tout en évitant le photoblanchiment et la phototoxicité. Après cette procédure, d'autres méthodes, comme les préparations de chromosomes étalés, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires sur la cause des anomalies mitotiques observées, ou l'utilisation d'un traitement pharmacologique pour déterminer ses effets sur la progression, la durée de la mitose ou le destin cellulaire.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine de la biologie pour explorer la mitose dans le contexte de la biologie du développement et de la cancérologie en utilisant le poisson zèbre. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d'incorporer des embryons de poisson zèbre, d'acquérir des images en direct de la mitose, et d'analyser la fréquence mitotique, la durée et le destin cellulaire. N'oubliez pas que travailler avec des lasers puissants et des lumières fluorescentes peut nuire aux yeux, et que des précautions, telles que l'évitement du contact direct des yeux avec les lasers, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.