Name: Suivi cellule à laide protéines photoconvertible cours de développement poisson zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Découvrez le suivi cellulaire par protéines photoconvertibles chez l'embryon de poisson-zèbre Danio rerio. Cette méthode de microscopie confocale permet d'étudier les événements biologiques au cours du développement embryonnaire.

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Nous remercions le Dr Ian C. Scott de nous avoir aimablement fourni la lignée transgénique de poisson zèbre Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 au Hospital for Sick Children de Toronto, au Canada. Nous remercions la plateforme d'imagerie à fluorescence par microscopie confocale et biphotonique (Max-Delbrueck-Center for Molecular Medicine) et le Dr Zoltan Cseresnyes pour leur excellente assistance technique et leur soutien global en imagerie. S.A.-S. bénéficie d'une bourse Heisenberg de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Ce travail a été financé par la subvention DFG SE2016/7-1.

1. Obtention d'embryons pour le test de photoconversion
Après croisement interne de poissons-zèbres transgéniques exprimant un PCFP, les embryons homozygotes les plus brillants sont sélectionnés et élevés à 28,5 °C jusqu'au stade embryonnaire souhaité15.
Remarque 1 : Ce prétri permettra d'analyser les embryons avec une faible puissance laser, évitant ainsi la phototoxicité et la photodégradation.
Remarque 2 : Nous recommandons d'utiliser une lumière de faible intensité lors de la visualisation des embryons et de les maintenir à l'obscurité en raison de la grande sensibilité des PCFP, tels que Kaede et KikGR, à l'exposition à la lumière, y compris la lumière du jour.
2. Inclusion
<ol>
	<li>Dans un récipient en verre contenant de l'eau pour œufs, déchorionner les embryons au microscope stéréo à l'aide de pinces.</li>
	<li>Anesthésier les embryons en transférant un embryon déchorionné dans une solution de tricaine à 0,16 mg/ml (éthyl 3-aminobenzoate, Sigma-Aldrich) (40μl d'une solution mère à 4 mg/ml dans 1 ml de milieu E3 1X).</li>
</ol>
Remarque 1 : Transférez les embryons à l’aide d’une pipette en verre ou d’une pipette à embout coupé (P1000) afin de minimiser le risque d’endommager les embryons.
Remarque 2 : Les jeunes embryons déchorionés ne doivent pas être exposés à l'air ni soulevés jusqu'à l'interface eau/air, car les œufs se rompent facilement lorsqu'ils sont soumis à un stress mécanique.
<ol start="3">
	<li>Transférez l'embryon anesthésié sur le couvercle d'une boîte de culture et maintenez l'embryon dans le plus petit volume possible de milieu.</li>
	<li>Transférez l'embryon dans l'agarose en pipetant l'embryon avec de l'agarose à bas point de fusion (LMA, Lonza) à 1 % à 30 °C contenant 0,16 mg/ml de tricaine, puis déposez-le sur le couvercle en verre d'une boîte de culture à fond en couvre-objet (MatTek Corp. Ashland MA USA). Orientez ensuite l'embryon à l'aide d'une pointe en plastique lisse (par exemple une pointe de pipette Microloader coupée, Eppendorf) et, une fois l'agarose LMA polymérisée, recouvrez l'agarose par une solution de tricaine à 0,16 mg/ml.</li>
</ol>
Remarque 1 : Faire fondre l'agarose LMA 1 % à 60 °C et maintenir l'agarose fondue à 30 °C.
3. Photoconversion
<ol>
	<li>Sur un microscope confocal inversé équipé de sources laser de 405 nm, 488 nm et 561 nm, tel que le Zeiss LSM 710, visualiser l'échantillon par un balayage en z-Stack couvrant toute la structure de l'échantillon à photoconvertir et à suivre ultérieurement, en utilisant le laser 488 nm (par exemple, laser Ar de 30 mW, à une intensité de 5 à 7 %, détecteur réglé sur 493-540 nm) et le laser 561 nm (par exemple, laser DPSS 561 de 10 mW, à une intensité de 7 à 9 %, détecteur réglé sur 587-651 nm) pour balayer le tissu/organe afin de détecter respectivement la fluorescence verte et rouge des protéines photoconvertibles.</li>
</ol>
Remarque 1 : Pour l'analyse avant la photoconversion, nous avons utilisé un objectif Plan Apochromat 20x/NA 0,8.
Remarque 2 : Toujours rechercher la fluorescence rouge avant l'expérience afin d'exclure la présence éventuelle d'un PCFP rouge converti par erreur.
<ol start="2">
	<li>Sélectionner l'outil Time series et régler sur 2 cycles sans intervalle (un avant et un après la photoconversion).</li>
	<li>Sélectionner l'outil Regions et définir une ou plusieurs régions d'intérêt (ROI) pour la photoconversion.</li>
</ol>
Remarque 1 : Nous recommandons de déterminer d'abord la précision avec laquelle la région effectivement photoconvertie par le laser de balayage dans la région d'intérêt (ROI) correspond à la ROI sélectionnée dans le logiciel, en mesurant la surface du tissu ou des cellules photoconvertis selon les trois directions (xy et z) sur un échantillon fixé, où aucun déplacement cellulaire ou protéique n'est attendu. Pour les paramètres décrits dans cette application, la ROI correspondait à la région photoconvertie avec une grande précision, mais cela dépend de l'objectif utilisé et de l'intensité du laser appliquée pour la photoconversion. La taille de la ROI peut être réduite à celle d'une seule cellule, selon l'ouverture numérique de l'objectif, le facteur de zoom et l'intensité de lumière laser utilisée pour la photoconversion.
<ol start="4">
	<li>Sélectionnez l'outil Bleaching et configurez-le pour commencer le blanchiment après le balayage 1 sur 2. Nous avons utilisé un laser à diode de 405 nm à 30 mW pour la photoconversion et avons soigneusement optimisé la quantité minimale de lumière laser nécessaire à une photoconversion complète, principalement en ajustant l'intensité de la lumière laser, le nombre de balayages de la région d'intérêt (ROI) et le temps par pixel (i.e., la vitesse de balayage).</li>
</ol>
Remarque 1 : Pour la photoconversion, nous avons utilisé un objectif Plan Apochromat 20x/NA 0,8.
Note 2 : La puissance du laser et le nombre d'itérations doivent être déterminés empiriquement pour chaque configuration expérimentale et doivent assurer la photoconversion complète du PCFP vert au rouge dans la région d'intérêt (ROI), avec la quantité minimale nécessaire de lumière laser afin de réduire la phototoxicité. Nous recommandons d'initier les tests avec une faible puissance laser (par exemple 3 %, correspondant à 0,03 mW dans le plan de l'objectif) combinée à un faible nombre d'itérations (par exemple 20), puis d'augmenter progressivement la puissance du laser jusqu'à atteindre une photoconversion complète, ce qui, dans notre cas, correspondait à une puissance de 10 % (soit 0,1 mW dans le plan de l'objectif). Dans ces conditions, tous les embryons testés ont survécu au protocole de traitement. Néanmoins, nous avons observé que la membrane du vitellus est sensible aux impulsions laser et peut facilement être endommagée, entraînant la mort de l'embryon. Pour cette raison, une létalité embryonnaire après la photoconversion peut survenir si la position du tissu ciblé est proche du corps vitellin.
<ol start="5">
	<li>Analyser l'échantillon en z-Stack à l'aide de lasers à 488 nm et 561 nm pour visualiser la fluorescence verte résiduelle et la fluorescence rouge photoconvertie du PCFP.</li>
</ol>
Note 1 : Pour l'analyse après la photoconversion, nous avons utilisé un objectif Plan Apochromat 20x/NA 0,8.
4. Retirer l'embryon de l'agarose
<ol>
	<li>Jetez la solution et retirez délicatement l'embryon du LMA à 1 % à l'aide d'une aiguille ou d'une pointe en plastique lisse.</li>
	<li>Conservez l'embryon dans de l'eau d'œuf à l'obscurité à 28,5 °C jusqu'au stade de développement souhaité.</li>
</ol>
Remarque 1 : Il est important que les embryons poursuivent leur développement dans de l’eau d’œuf, en particulier durant les premiers jours de développement correspondant à l’allongement du corps embryonnaire. En effet, certains tissus ou organes embryonnaires changent de position au cours du développement, ce qui nécessite des orientations spécifiques lors de l’encapsulation, lesquelles dépendent du tissu ou organe d’intérêt ainsi que du stade de développement souhaité pour l’analyse.
5. Réinclusion
<ol>
	<li>Procéder comme au point 2.) de ce protocole.</li>
</ol>
6. Suivi du tissu photoconverti aux stades embryonnaires ultérieurs
<ol>
	<li>Numérisation de la région d'intérêt (z-Stack) à l'aide de lasers à 488 nm et 561 nm pour les signaux fluorescents verts et rouges, respectivement.</li>
</ol>
Remarque 1 : Pour l'analyse effectuée x heures après la photoconversion, nous avons utilisé un objectif Plan Apochromat 20x/NA 0,8.
Note 2 : Étant donné que ce protocole n'affecte pas le développement normal de l'embryon, il est possible d'observer l'embryon photoconverti à des stades ultérieurs du développement (pour cela, procéder comme indiqué aux points 4 - 6).
7. Résultats représentatifs
Un exemple de test de photoconversion est illustré dans la figure 1. Nous avons suivi les cellules endothéliales au cours du développement du poisson zèbre (pour une revue de l'anatomie vasculaire du poisson zèbre en développement, voir16). Ainsi, nous avons utilisé une lignée rapporteuse de poisson zèbre Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 exprimant KikGR dans les noyaux endothéliaux17. Les embryons homozygotes et fortement exprimants ont été élevés à 28,5 °C jusqu'à 48 heures post-fécondation (hpf). Après déchorionation, les embryons ont été anesthésiés et inclus dans de l'agarose à faible fusion (LMA), en positionnant le côté antéro-dorsal de l'embryon vers la lame de couverture afin de mieux visualiser les vaisseaux de la tête. Nous avons utilisé un microscope confocal inversé (Zeiss LSM 710 Meta) équipé de lasers fonctionnant à 405 nm, 488 nm et 561 nm, ainsi qu'un objectif Plan Apochromat 20x/NA 0,8 pour le test de photoconversion et le suivi ultérieur de la protéine photoconvertie. Comme indiqué dans la figure 1A, avant la photoconversion, KikGR était exprimé dans le tissu endothélial et n'était détectable que sous forme de fluorescence verte à l'aide d'un laser Argon à 488 nm. Des balayages de contrôle avec un laser DPSS 561-10 à 561 nm pour la fluorescence rouge n'ont détecté aucune trace de KikGR photoconverti avant la photoconversion (figure 1A). Ensuite, la région d'intérêt (ROI) a été entièrement photoconvertie à l'aide d'un laser à diode 405 nm (à 10 % d'intensité, 20 itérations), puis les vaisseaux de la tête ont été à nouveau scannés à l'aide des lasers 488 nm et 561 nm (figure 1B). Comme le montre la figure 1B, la fluorescence verte de KikGR s'est complètement transformée en rouge au sein de la ROI. Après le test de photoconversion, l'embryon a été retiré de l'agarose et élevé à 28,5 °C dans de l'eau d'œufs. Enfin, l'embryon a été observé à nouveau 24 heures après la photoconversion, environ à 72 hpf, afin de suivre les cellules endothéliales photoconverties à des stades ultérieurs (figure 1C). Ainsi, l'embryon a été à nouveau inclus dans de l'agarose à faible fusion (LMA), et l'échantillon a été rescanné à l'aide des lasers 488 nm et 561 nm. Comme le montre la figure 1C, dans le tissu endothélial issu de la ROI photoconvertie, des protéines KikGR à la fois non photoconverties et photoconverties ont été observées, en raison de la stabilité de la forme rouge fluorescente de KikGR photoconvertie et de la resynthèse de nouvelles protéines KikGR vertes non photoconverties.
<img alt="Processus de photoconversion chez le poisson zèbre ; changement de la protéine fluorescente dans les images de microscopie au fil du temps." src="/files/ftp_upload/4350/4350fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1. Photoconversion de KikGR au cours du développement du poisson zèbre. (A,B) Une région spécifique de la vascularisation endothéliale de la tête a été photoconvertie à 48 hpf chez des embryons transgéniques Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 et (C) observée à nouveau 24 heures après la photoconversion (environ 72 hpf). La fluorescence de KikGR (en vert), de KikGR photoconverti (en rouge) et des canaux fusionnés sont présentées. Les cercles pointillés indiquent la région d’intérêt (ROI) avant, juste après et 24 heures après la photoconversion. Les images sont des vues dorsales de l’embryon de poisson zèbre, l’extrémité antérieure étant orientée vers le bas. Échelles : 50 μm.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protéine (acronyme)</td>
			<td>Ex (nm)</td>
			<td>Em (nm)</td>
			<td>EC </td>
			<td>QY</td>
			<td>Structure quaternaire</td>
			<td>Luminosité </td>
			<td>Application</td>
			<td>Réf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaede_G</td>
			<td>508</td>
			<td>518</td>
			<td>99</td>
			<td>0.9</td>
			<td>tetramer</td>
			<td>259</td>
			<td rowspan="2">Suivi cellulaire</td>
			<td rowspan="2">2,6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaede_R</td>
			<td>572</td>
			<td>580</td>
			<td>60</td>
			<td>0.3</td>
			<td>tetramer</td>
			<td>59</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KikGR_G</td>
			<td>507</td>
			<td>517</td>
			<td>54</td>
			<td>0.7</td>
			<td>tetramer</td>
			<td>112</td>
			<td rowspan="2">Suivi cellulaire</td>
			<td rowspan="2">3,6,8-10 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KikGR_R</td>
			<td>583</td>
			<td>593</td>
			<td>35</td>
			<td>0.6</td>
			<td>tetramer</td>
			<td>68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mKikGR_G</td>
			<td>505</td>
			<td>515</td>
			<td>49</td>
			<td>0.7</td>
			<td>monomer</td>
			<td>101</td>
			<td rowspan="2">Suivi dynamique Images de super-résolution</td>
			<td rowspan="2">13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mKikGR_R</td>
			<td>580</td>
			<td>591</td>
			<td>28</td>
			<td>0.6</td>
			<td>monomer</td>
			<td>53</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EosFP_G</td>
			<td>506</td>
			<td>516</td>
			<td>72</td>
			<td>0.7</td>
			<td>tetramer</td>
			<td>150</td>
			<td rowspan="2">Suivi cellulaire</td>
			<td rowspan="2">5,20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EosFP_R</td>
			<td>571</td>
			<td>581</td>
			<td>41</td>
			<td>0.5</td>
			<td>tetramer</td>
			<td>67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tdEos_G</td>
			<td>506</td>
			<td>516</td>
			<td>34</td>
			<td>0.7</td>
			<td>tandem dimer</td>
			<td>165</td>
			<td rowspan="2">Images de super-résolution</td>
			<td rowspan="2">12,14,21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tdEos_R</td>
			<td>569</td>
			<td>581</td>
			<td>33</td>
			<td>0.6</td>
			<td>tandem dimer</td>
			<td>59</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEos2_G</td>
			<td>506</td>
			<td>519</td>
			<td>56</td>
			<td>0.7</td>
			<td>monomer</td>
			<td>140</td>
			<td rowspan="2">Suivi dynamique Images de super-résolution</td>
			<td rowspan="2">11,18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEos2_R</td>
			<td>573</td>
			<td>584</td>
			<td>46</td>
			<td>0.7</td>
			<td>monomer</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dendra2_G</td>
			<td>490</td>
			<td>507</td>
			<td>45</td>
			<td>0.5</td>
			<td>monomer</td>
			<td>67</td>
			<td rowspan="2">Suivi dynamique Images de super-résolution</td>
			<td rowspan="2">4,11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dendra2_R</td>
			<td>553</td>
			<td>573</td>
			<td>35</td>
			<td>0.55</td>
			<td>monomer</td>
			<td>57</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau I. Propriétés des protéines fluorescentes photoconvertibles. Le tableau indique, pour chaque PCFP, le nom courant et/ou l'acronyme, les longueurs d'onde d'excitation (Ex) et d'émission (Em) maximales, les coefficients d'extinction molaires (CE, 10-3 M-1 cm-1), le rendement quantique (RQ), la structure quaternaire dans des conditions physiologiques, la luminosité relative (en % d'EGFP), l'application et les références. Tableau adapté de Day et Davidson, 20101.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PCFP</td>
			<td>Lignées transgéniques de poisson zèbre</td>
			<td>Source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="10">Kaede</td>
			<td>Tg(elavl3:Kaede)rw0130a</td>
			<td>Okamoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(EPV.TP1-Mmu.Hbb:Kaede)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(ins:Kaede)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(isl1:Gal4-VP16,14xUAS:Kaede)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(lhx5:Kaede)b1204/+</td>
			<td>ZIRC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(myl7:kaede)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(olig2:Kaede)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(UAS-E1b:Kaede)s1999t</td>
			<td>ZIRC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(UAS:Kaede)rk8</td>
			<td>ZIRC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(vsx2:Kaede)nns2</td>
			<td>Higashijima Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">KikGR</td>
			<td>Tg(kdrl:nlsKikGR)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(krt4:NTR-KikGR)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(myl7:nlsKikGR)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(sox10:KikGR)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(UAS:KikGR)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">EosFP</td>
			<td>Tg(sox10:EosFP)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(sox10:nlsEosFP)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Dendra</td>
			<td>Tg(-8mpx:Dendra2)</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(UAS:Dendra-kras)</td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau II. Lignées transgéniques de zebrafish exprimant des PCFP. Données obtenues dans la base de données sur l'organisme modèle zebrafish (ZFIN, <a href="http://zfin.org/" target="_blank">http://zfin.org/</a>). La disponibilité des lignées au Zebrafish International Resource Center (ZIRC, <a href="http://zebrafish.org/zirc/" target="_blank">http://zebrafish.org/zirc/</a>) est indiquée.

<ol><li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+protein+palette%3A+tools+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem. Soc. Rev. 38, 2887-2921 (2009).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 12651-12656 (2002).</li>
<li>Tsutsui, H., Karasawa, S., Shimizu, H., Nukina, N., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-rational+engineering+of+a+coral+fluorescent+protein+into+an+efficient+highlighter%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Semi-rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter.</a> EMBO Rep. 6, 233-238 (2005).</li>
<li>Gurskaya, N. G., Verkhusha, V. V., Shcheglov, A. S., Staroverov, D. B., Chepurnykh, T. V., Fradkov, A. F., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).</li>
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<li>Stark, D. A., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+comparison+of+photoactivatable+fluorescent+proteins+in+an+avian+embryo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model.</a> Dev. Dyn. 236, 1583-1594 (2007).</li>
<li>Kulesa, P. M., Teddy, J. M., Stark, D. A., Smith, S. E., McLennan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+invasion+is+a+spatially-ordered+progression+into+the+head+with+higher+cell+proliferation+at+the+migratory+front+as+revealed+by+the+photoactivatable+protein%2C+KikGR%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest invasion is a spatially-ordered progression into the head with higher cell proliferation at the migratory front as revealed by the photoactivatable protein, KikGR.</a> Dev. Biol. 316, 275-287 (2008).</li>
<li>Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+KikGR+a+photoconvertible+green-to-red+fluorescent+protein+for+cell+labeling+and+lineage+analysis+in+ES+cells+and+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos.</a> BMC Dev. Biol. 9, 49(2009).</li>
<li>Griswold, S. L., Sajja, K. C., Jang, C. W., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+iUBC-KikGR+photoconvertible+transgenic+mice+for+live+time-lapse+imaging+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of iUBC-KikGR photoconvertible transgenic mice for live time-lapse imaging during development.</a> Genesis. 49, 591-598 (2011).</li>
<li>Baker, S. M., Buckheit, R. W. 3rd, Falk, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green-to-red+photoconvertible+fluorescent+proteins%3A+tracking+cell+and+protein+dynamics+on+standard+wide-field+mercury+arc-based+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Green-to-red photoconvertible fluorescent proteins: tracking cell and protein dynamics on standard wide-field mercury arc-based microscopes.</a> BMC Cell Biol. 11, 15(2010).</li>
<li>Watanabe, S., Punge, A., Hollopeter, G., Willig, K. I., Hobson, R. J., Davis, M. W., Hell, S. W., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+localization+in+electron+micrographs+using+fluorescence+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy.</a> Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).</li>
<li>Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mKikGR%2C+a+monomeric+photoswitchable+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein.</a> PLoS One. 3, e3944(2008).</li>
<li>Fang, Z., Takizawa, N., Wilson, K. A., Smith, T. C., Delprato, A., Davidson, M. W., Lambright, D. G., Luna, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane-associated+protein%2C+supervillin%2C+accelerates+F-actin-dependent+rapid+integrin+recycling+and+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The membrane-associated protein, supervillin, accelerates F-actin-dependent rapid integrin recycling and cell motility.</a> Traffic. 11, 782-799 (2010).</li>
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<li>Godinho, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of zebrafish development.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011, 770-777 (2011).</li>
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<li>Nienhaus, G. U., Nienhaus, K., Holzle, A., Ivanchenko, S., Renzi, F., Oswald, F., Wolff, M., Schmitt, F., Rocker, C., Vallone, B., Weidemann, W., Heilker, R., Nar, H., Wiedenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoconvertible+fluorescent+protein+EosFP%3A+biophysical+properties+and+cell+biology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Photoconvertible fluorescent protein EosFP: biophysical properties and cell biology applications.</a> Photochem. Photobiol. 82, 351-358 (2006).</li>
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</ol>

Aucun conflit d'intérêts déclaré.

Ces dernières années, des modèles animaux transgéniques exprimant des protéines photoconvertibles telles que Kaede ou KikGR ont été générés. Ces animaux se développent normalement, ce qui indique que ces protéines n'ont aucun effet toxique sur le développement embryonnaire. Le premier rapport concernant un test de photoconversion pour le traçage cellulaire dans les embryons animaux a été réalisé par Hatta et collaborateurs, par injection d'ARNm ou d'ADN codant pour Kaede dans des embryons de poisson-zèbre à un seul blast...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Matériel :&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">Équipement nécessaire pour l'élevage des poissons et la collecte des œufs (voir le Zebrafish Book22 pour plus de détails).</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Leica</td><td>Lecia MZ6 Stereomicroscope</td><td>Équipé d'un laser fonctionnant à 488 nm</td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss LSM 710 NLO</td><td>Équipé de lasers fonctionnant à 488 nm, 561 nm et 405 nm</td></tr><tr><td>Bloc chauffant</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paire de pinces Dumont n°5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture à fond en lame de verre</td><td>MatTek Corp</td><td></td><td>Ashland MA USA</td></tr><tr><td>Pointes de pipette Microloader</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Réactifs :&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;Milieu d'eau pour œufs&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>60 &amp;mu;g/ml de sels Instant Ocean dans de l’eau ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;Milieu E3&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>5 mM NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,17 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,33 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,00001 % (p/v) de bleu de méthylène</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;Solution mère de tricaine à 4 mg/ml&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>400 mg de tricaine (éthyl 3-aminobenzoate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>97,9 ml d’eau ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,1 ml de Tris 1 M (pH 9)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ajuster à pH 7, aliquoter et conserver à -20 &amp;deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;Agarose à bas point de fusion (LMA, Lonza) à 1 %&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>1 g de LMA/100 ml de milieu E3 1X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aliquoter et conserver à 4 &amp;deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

suivi cellule à l&#39;aide protéines photoconvertible cours de développement poisson zèbre

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

L'embryogenèse est un processus dynamique qui s'étudie idéalement à l'aide de techniques permettant de documenter les changements développementaux in vivo. L'utilisation de protéines fluorescentes codées génétiquement s'est révélée être une stratégie précieuse pour élucider les processus morphogénétiques dynamiques tels qu'ils se produisent dans l'organisme entier. Au cours de la dernière décennie, le développement de protéines fluorescentes photoactivables et photoconvertibles a ouvert la possibilité d'étudier le destin de sous-populations discrètes de protéines marquées1. Contrairement aux protéines photoactivables, les protéines fluorescentes photoconvertibles (PCFP) peuvent être facilement suivies et imagées dans leur état d'émission natif avant la photoconversion, ce qui facilite l'identification et la sélection des régions par inspection optique. Les PCFP, telles que Kaede2, KikGR3, Dendra4 et EosFP5, peuvent passer du vert au rouge suite à une exposition à la lumière UV ou bleue, en raison d'une séquence tripeptidique His-Tyr-Gly qui forme un chromophore vert pouvant être photoconverti en un chromophore rouge par une β-élimination catalysée par la lumière suivie d'une extension du système π-conjugué3. Les PCFP et leurs variantes monomériques sont des outils utiles respectivement pour le suivi cellulaire6-10 et l'étude de la dynamique des protéines11-14. Ces dernières années, les PCFP ont été exprimées dans divers modèles animaux, tels que le poisson zèbre6, le poulet7,8 et la souris9,10, afin de suivre le destin des cellules. Nous décrivons ici un protocole de photoconversion spécifique aux cellules des PCFP dans l'embryon vivant de poisson zèbre, suivi d'un suivi des protéines photoconverties à des stades développementaux ultérieurs. Cette méthodologie permet d'étudier, de manière spécifique aux tissus, les événements de biologie cellulaire sous-jacents à la morphogenèse dans le modèle animal du poisson zèbre.

Ici, nous présentons une méthode permettant la commutation photoactivée de protéines fluorescentes photoconvertibles (PCFP) dans l’embryon vivant de poisson zèbre, ainsi que le suivi ultérieur de la protéine photoconvertie à des points temporels spécifiques au cours du développement. Cette méthodologie permet de surveiller les événements de biologie cellulaire sous-jacents à différents processus développementaux dans un organisme vertébré vivant.

Suivi cellule à l&#39;aide protéines photoconvertible cours de développement poisson zèbre

L'embryogenèse est un processus dynamique qui est étudié de manière optimale à l'aide de techniques permettant de documenter les changements développementaux in vivo. L'utilisation de ...

L'objectif général de cette procédure est de suivre des cellules photo-commutées dans un embryon vivant de poisson zèbre. Cela est réalisé en incorporant d'abord un embryon exprimant une protéine fluorescente photoconvertible spécifique à un tissu dans de l'agarose à bas point de fusion. Ensuite, la protéine dans la région d'intérêt est entièrement photoconvertie.Ensuite, l'embryon est soigneusement retiré de l'agarose et maintenu dans de l'eau d'œufs à 28,5 degrés Celsius jusqu'aux stades ultérieurs. Enfin, l'embryon photoconverti est à nouveau inclus dans de l'agarose à bas point de fusion. En définitive, les résultats obtenus permettent de montrer que les cellules photoconverties peuvent être détectées avec précision aux stades ultérieurs grâce à la présence stable de la protéine photoconvertie, par microscopie confocale.Nous pensons donc que la méthode que nous présenterons aujourd'hui sera très utile dans le contexte de la biologie cellulaire et du développement. Nous estimons que l'utilisation de cette méthodologie dans l'étude de la migration cellulaire, de la dynamique tissulaire et d'autres comportements cellulaires s'avérera particulièrement intéressante. La procédure sera démontrée par Veronica Lombardo, une postdoctorante de mon laboratoire, après avoir croisé des poissons-zèbres transgéniques exprimant une protéine fluorescente photoconvertible.Choisissez les embryons les plus fluorescents qui sont homozygotes et faites-les croître à 28,5 degrés Celsius lorsqu'ils ont atteint le stade souhaité. Utilisez une pince pour les désenkyster dans un récipient en verre contenant de l'eau pour œufs afin d'anesthésier les embryons. Utilisez une pipette en verre ou une pipette à embout coupé pour les transférer un par un dans le trica.Transférez un embryon anesthésié sur le couvercle d'une boîte de culture et maintenez l'embryon dans le plus petit volume possible de milieu. Transférez l'embryon dans de l'agros en le pipetant avec de l'agros à 1 % à basse température de fusion contenant du trica à 30 degrés Celsius, puis placez-le dans une boîte de culture dont le fond est constitué d'un couvre-objet. Utilisez une pointe en plastique lisse pour orienter l'embryon une fois que l'agros a polymérisé.Le recouvrir de la solution Trica sur un microscope confocal inversé équipé de sources laser de 405, 488 et 561 nanomètres et d'un objectif 20 x. Utiliser les lasers de 488 et 561 nanomètres pour générer un empilement en Z de l'ensemble de la structure de l'échantillon, y compris la région d'intérêt. Sélectionner l'outil de série temporelle et le régler sur deux cycles sans intervalle, un avant et un après la photoconversion.Sélectionnez l'outil de région et définissez une ou plusieurs régions d'intérêt pour la conversion photochimique. Ensuite, sélectionnez l'outil de blanchiment et configurez-le pour commencer le blanchiment après l'analyse. L'un des deux utilisés ici est un laser à diode de 30 milliwatts à 405 nanomètres.Optimisé avec soin pour utiliser la quantité minimale de lumière laser nécessaire à la photoconversion complète, obtenue en faisant varier l'intensité de la lumière laser, le nombre de balayages de la région d'intérêt et la vitesse de balayage. Balayer l'échantillon avec les lasers de 488 nanomètres et de 561 nanomètres pour visualiser toute fluorescence verte résiduelle ainsi que la fluorescence rouge photoconvertie de la protéine fluorescente photoconvertible. Après la photoconversion, éliminer la solution et, à l'aide d'une aiguille ou d'une pointe en plastique lisse, retirer délicatement l'embryon de l'agros.Conserver l'embryon dans l'eau d'œuf à l'obscurité à 28,5 degrés Celsius jusqu'au stade de développement souhaité. Enrober une deuxième fois l'embryon, puis générer un Zack de l'échantillon, incluant la région d'intérêt, en utilisant à nouveau les lasers de 488 et 561 nanomètres. Étant donné que ce protocole n'affecte pas le développement normal, il est possible d'observer l'embryon photoconverti à des stades ultérieurs.Voici un exemple de dosage de conversion photochimique. Des cellules endothéliales ont été suivies au cours du développement du poisson zèbre, de 48 à 72 heures après la fécondation, à l’aide d’une lignée transgénique rapporteuse exprimant kick G dans les noyaux endothéliaux, comme illustré ici. Avant la conversion photochimique, kick G était exprimé au sein du tissu endothélial et n’était détectable que sous forme de fluorescence verte à l’aide de balayages contrôles au laser argon de 488 nanomètres. Aucune détection de kick GR photoconverti n’a été observée avec un laser de 561 nanomètres pour la fluorescence rouge avant la conversion photochimique.Par la suite, la région d’intérêt a été entièrement photoconvertie à l’aide d’un laser à diode de 405 nanomètres, à une intensité de 10 % et sur 20 itérations, puis les vaisseaux crâniens ont été de nouveau scannés à l’aide des lasers de 488 nanomètres et 561 nanomètres. Dans ce panneau, la fluorescence verte de la protéine Kick G s’est complètement transformée en rouge dans la région d’intérêt, permettant de suivre les cellules endothéliales photoconverties aux stades ultérieurs. L’embryon a été observé 24 heures après la photoconversion, soit environ 72 heures après la fécondation, au niveau des tissus endothéliaux issus de la région d’intérêt photoconvertie.Des protéines G kick tant non converties que photoconverties ont été observées en raison de la stabilité de la forme photoconvertie rouge fluorescente de kick g, et de la synthèse de nouvelles protéines G kick vertes non converties après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine de la biologie du développement pour explorer la biologie cellulaire et le remodelage des tissus chez plusieurs espèces de poissons.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ce protocole décrit l'imagerie des neurones individuels ou des cellules de la crête neurale dans la vie des embryons de poisson zèbre. Cette méthode est utilisée pour examiner les comportements cellulaires actine et la localisation utilisant la fluorescence confocale time-lapse microscopie.

Imagerie en temps réel de la motilité cellulaire et cytosquelette d&#39;actine des neurones individuels et de la crête neurale dans les embryons de poissons zèbres

Microscopie multiphotonique permet de contrôler les photons de basse énergie avec une pénétration profonde et optiques phototoxicité réduite. Nous décrivons l'utilisation de cette technologie pour l'étiquetage de cellules vivantes dans des embryons de poissons zèbres. Ce protocole peut être facilement adapté à la photo-induction de diverses molécules lumière réactive.

Deux-Photon-Based photoactivation dans Live embryons de poissons zèbres

Une méthode est décrite pour photoactiver cellules individuelles contenant une protéine fluorescente utilisant cage absorption à deux photons à partir d'un Ti: saphir oscillateur laser femtoseconde. Pour mapper le destin de la cellule photoactivé, l'immunohistochimie est utilisée. Cette technique peut être appliquée à n'importe quel type de cellule.

Simple cartographie du destin cellulaire chez le poisson zèbre

Cette vidéo démontre le suivi du recrutement des leucocytes à l’aide de larves de poisson-zèbre transgéniques exprimant une protéine fluorescente verte photoconvertible. La pré-injection de bactéries marquées à un colorant fluorescent rouge dans la vésicule otique et l'induction de la photoconversion permettent d'observer la migration, la phagocytose et la dispersion des leucocytes dans tout le corps, fournissant des informations précieuses sur la dynamique de la réponse immunitaire.

Suivi des leucocytes basé sur la photoconversion chez le poisson-zèbre transgénique infecté par des bactéries

Les teneurs en protéines dans les cellules et les tissus sont souvent étroitement réglementées par l'équilibre de la production de protéines et de dégagement. En utilisant la fluorescence Decay Après Photoconversion (FDAP), la cinétique de dégagement de protéines peuvent être mesurées expérimentalement in vivo.

Mesure de la stabilité des protéines dans le salon embryons de poissons zèbres en utilisant la fluorescence Decay Après Photoconversion (FDAP)

Nous avons établi le système photoconvertible PSmOrange comme un outil puissant, simple et peu coûteux pour le suivi cellulaire in vivo dans les fonds transgéniques GFP. Ce protocole décrit son application dans le système modèle du poisson zèbre.

Suivi des cellules dans le poisson zèbre transgénique de la GFP-Utilisation du système photoconvertible PSmOrange

Ici, nous présentons une méthode de montage polyvalente qui permet l’imagerie à long terme en accéléré du développement postérieur du corps d’embryons de poisson-zèbre vivants sans perturber le développement normal.

Une méthode de montage polyvalent pour l&#39;imagerie à long terme du développement Zebrafish

Une combinaison des techniques optiques avancées de lecture avec excitation de fluorescence multi-photons longue longueur d’onde de laser a été mis en œuvre pour capturer l’imagerie haute résolution, en trois dimensions, en temps réel de la migration de la crête neurale en Tg (sox10:EGFP) et les embryons de poissons zèbres Tg (foxd3:GFP).

Multiphotonique Time Lapse imagerie de visualiser le développement en temps réel : visualisation de la migration des cellules neurales de crête dans des embryons de poisson-zèbre

Nous présentons ici un protocole pour montrer comment cellule photoconversion est réalisée grâce à l’exposition aux UV dans des zones spécifiques exprimant la protéine fluorescente, Eos, chez les individus vivants.

Photoconversion cellule unique chez le poisson zèbre Intact de la vie

Ce protocole décrit une méthode pour la photoconversion de la protéine fluorescente de Kaede dans les cellules du vivant endocardiques embryon de poisson zèbre qui permet le suivi des cellules endocardiaques pendant le canal atrio-ventriculaire et le développement de valve auriculo-ventriculaire cardiaque .

Mouvements de tissu endocardique suivant via Photoconversion de cellules dans l’embryon de poisson zèbre

Ce protocole décrit une approche pour l’étiquetage in toto et l’imagerie multidimensionnelle du développement oculaire précoce du poisson-zèbre. Nous décrivons l’étiquetage, l’intégration et l’imagerie quadridimensionnelle (4D) à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser, ainsi que les considérations relatives à l’optimisation de l’acquisition d’ensembles de données pour disséquer les mécanismes de morphogenèse optique en coupe.

Imagerie en 4 dimensions de la morphogenèse de la coupe optique du poisson-zèbre

Découvrez le suivi cellulaire par protéines photoconvertibles chez l'embryon de poisson-zèbre Danio rerio. Cette méthode de microscopie confocale permet d'étudier les événements biologiques au cours du développement embryonnaire.

Suivi cellule à l'aide protéines photoconvertible cours de développement poisson zèbre

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