Suivi cellule à l'aide protéines photoconvertible cours de développement poisson zèbre

L’objectif global de cette procédure est de suivre les cellules photocommutées dans un embryon de poisson zèbre vivant. Ceci est accompli en intégrant d’abord un embryon, exprimant une photoprotéine fluorescente convertible spécifique au tissu dans des aros à basse température de fusion. Ensuite, la protéine dans la région d’intérêt est complètement photoconvertie.

Ensuite, l’embryon est soigneusement retiré de l’aros et maintenu dans de l’eau d’œuf à 28,5 degrés Celsius jusqu’aux stades ultérieurs. Enfin, l’embryon photoconverti est à nouveau encastré dans des aros à basse température de fusion. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent que les cellules photoconverties peuvent être détectées avec précision à des stades ultérieurs en raison de la présence stable de la protéine photoconvertie par microscopie confocale.

Nous pensons donc que la méthode que nous allons présenter aujourd’hui va être très utile dans le contexte de la biologie cellulaire et du développement. Nous pensons donc que l’utilisation de cette méthodologie dans le contexte de la migration cellulaire, de la dynamique tissulaire et d’autres comportements cellulaires sera très utile. Veronica Lombardo, postdoctorante de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure après le croisement de poissons-zèbres transgéniques, exprimant une protéine fluorescente photoconvertible.

Choisissez les embryons les plus brillants qui sont homozygotes et faites-les pousser à 28,5 degrés Celsius lorsqu’ils ont atteint le stade souhaité. Utilisez des pinces pour les démouler dans un récipient en verre avec de l’eau d’œuf pour anesthésier les embryons. À l’aide d’une pipette en verre ou d’une pointe de pipette coupée, transférez-les un à la fois dans une trica.

Transférez un embryon anesthésié sur le couvercle d’une boîte de culture et maintenez l’embryon dans le plus petit volume possible de milieu. Transférez l’embryon dans aros en le pipetant avec 1 % d’agros à basse température de fusion avec trica à 30 degrés Celsius, et placez-le dans une boîte de culture à fond de verre. Utilisez une pointe en plastique lisse pour orienter l’embryon lorsque l’agros s’est polymérisé.

Recouvrez-le de solution Trica sur un microscope confocal inversé équipé de sources laser de 405, 488 et 561 nanomètres et d’un objectif 20x. Utilisez les lasers de 488 et 561 nanomètres pour générer une pile Z de la structure entière de l’échantillon, qui comprend la région d’intérêt. Sélectionnez l’outil de séries chronologiques et réglez-le pour deux cycles sans intervalle, un pour la pré et un pour la post-conversion de photos.

Sélectionnez l’outil de la région et définissez une ou plusieurs régions d’intérêt pour la conversion de photos. Ensuite, sélectionnez l’outil de blanchiment et configurez-le pour commencer le blanchiment après l’analyse. L’un des deux utilisés ici est un laser à diode de 30 milliwatts de 405 nanomètres.

Soigneusement optimisé pour la quantité minimale de lumière laser nécessaire à une conversion complète des photos, ce qui est obtenu en faisant varier l’intensité de la lumière laser, les itérations de balayage de la région d’intérêt et la vitesse de balayage. Scannez l’échantillon avec les lasers de 488 nanomètres et 561 nanomètres pour visualiser le vert restant et la fluorescence rouge photoconvertie de la protéine fluorescente photoconvertible. Après la conversion photo, jetez la solution et, à l’aide d’une aiguille ou d’une pointe en plastique lisse, retirez soigneusement l’embryon de l’agros.

Maintenez l’embryon dans l’eau de l’œuf dans l’obscurité à 28,5 degrés Celsius jusqu’au stade de développement souhaité. Intégrez l’embryon une deuxième fois, puis générez un Zack de l’échantillon, y compris la région d’intérêt, à l’aide des lasers nanométriques de 488 et 561 nanomètres. Comme ce protocole n’affecte pas le développement normal, il est possible d’observer l’embryon photoconverti à des stades ultérieurs.

Voici un exemple de test de conversion de photos. Les cellules endothéliales ont été suivies pendant le développement du poisson-zèbre de 48 à 72 heures après la fécondation à l’aide d’une lignée transgénique exprimant le coup G dans les noyaux endothéliaux, comme montré ici avant la conversion photo. N’a détecté aucune photo convertie kick GR avant la conversion de photo.

Par la suite, la région d’intérêt a été complètement photoconvertie à l’aide d’un laser à diode de 405 nanomètres à 10 % d’intensité, 20 itérations et les vaisseaux de tête ont été balayés à nouveau à l’aide des lasers de 488 nanomètres et 561 nanomètres. Dans ce panneau, le coup de pied vert G est complètement passé au rouge dans la région d’intérêt pour suivre les cellules endothéliales photoconverties à des stades ultérieurs. L’embryon a été observé 24 heures après la photoconversion, soit environ 72 heures après la fécondation dans les tissus endothéliales provenant de la région d’intérêt photoconvertie.

Des protéines G non converties et photoconverties ont été observées en raison de la stabilité de la protéine g photoconvertie en fluorescence rouge et de la synthèse de nouvelles protéines G vertes non converties après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du développement pour explorer la biologie cellulaire et le remodelage tissulaire chez plusieurs poissons.