Un protocole efficace pour évaluer la modulation de l’activité ERK dans des modèles précoces de poisson zèbre du syndrome de Noonan via la microscopie FRET en direct et l’immunofluorescence

Nous générons un modèle de poisson-zèbre pour des maladies complexes du développement, en reliant le séquençage des patients à la génomique fonctionnelle, afin de soutenir l’interprétation des variants ainsi que les tests précliniques de médicaments. Malgré l’amélioration des capteurs FRET, un test robuste in vivo détectant des changements pathogènes subtils de la signalisation Ras-MAPK avec une sensibilité spatiotemporale suffisante reste insuffisant. Pour commencer, placez la plaque d’injection personnalisée contenant du 2 % d’agarose moulé dans un milieu E3 sur une plateforme de travail.

Disposez et alignez les œufs fécondés des poissons-zèbres adolescents dans la plaque sur les voies appropriées afin de restreindre le mouvement des œufs lors de la microinjection. Rechargez l’aiguille avec deux microlitres de matériau injectable à l’aide d’une pipette micro-chargeuse. Ajustez les réglages de pression et de temps pour calibrer chaque injection en fonction de l’aiguille et de la qualité de l’embryon sur le dispositif de microinjection.

Injectez la solution dans le stade unicellulaire des embryons adolescents de poisson-zèbre. Élever des embryons adolescents microinjectés dans des conditions de soins contrôlés. Nettoyez tous les œufs qui semblent troubles ou dégénérés dans les trois heures suivant le dépôt.

Environ quatre heures après la fécondation, à l’aide d’un microscope stéréoscopique à fluorescence standard, réglé sur une plage de longueurs d’onde de 465 à 500 nanomètres. Criblez les embryons pour l’expression des rapporteurs de fluorescence. Sélectionnez les poissons adolescents positifs pour l’imagerie FRET et réservez les frères et sœurs négatifs pour des évaluations immunohistochimiques.

Placez des pools d’embryons d’un nombre égal dans différents puits d’une plaque à six puits. Pour commencer le traitement, immergez les embryons dans trois millilitres de milieu E3 contenant le contrôle du véhicule sous forme de DMSO ou MEK dilué à la concentration souhaitée. Pour commencer, faites fondre l’aliquote d’agarose à faible fondon à 1,5 % à 2 % dans un thermomélangeur à 50 degrés Celsius.

Une fois dissous, il faut baisser la température à environ 30 degrés Celsius. Placez un embryon adolescent positif injecté au centre d’un plat en verre de 35 millimètres pour l’imagerie en direct. Retirez l’excès de milieu E3 et ajoutez une goutte d’agarose à faible fusion pour immobiliser l’embryon.

Laissez l’agarose polymériser à température ambiante. Allumez le contrôleur de l’incubateur au moins une heure avant l’acquisition et réglez la température à 28 degrés Celsius pour maintenir la santé de l’embryon. Une fois l’incubateur stabilisé, placez la plaque d’imagerie avec l’embryon sur le porte-échantillon et utilisez un objectif sec 10x pour visualiser l’échantillon.

Allumez le laser à ions argon et réglez la puissance du laser à 50 %. Dans les paramètres matériels, choisissez la résolution de profondeur huit bits pour acquérir des images. Ensuite, dans le panneau d’acquisition, sélectionnez le mode de détection spectrale xy, gamma, lambda, z, et réglez le format de l’image à 512 par 512 pixels, vitesse de balayage de 400 hertz et zoom optique de 0,75. Activez la ligne laser de 458 nanomètres du laser à ions argon, et réglez sa valeur d’intensité à 8,5 %. Ensuite, sélectionnez un détecteur hybride et réglez sa sensibilité à une valeur de gain de 500.

Ouvrez le menu déroulant dans la barre de détecteurs pour sélectionner la protéine de fluorescence cyan ou la courbe d’émission ECFP. Pour afficher la courbe d’émission YPET, activez un second détecteur. Ensuite, sélectionnez la courbe d’émission de la protéine de fluorescence jaune YFP.

Pour lancer des acquisitions en direct, positionnez le curseur de détection dans la plage du signal YFP le plus intense afin de visualiser l’échantillon. Définissez les positions de début et de fin de l’épaisseur de l’échantillon dans la fenêtre LASX de la pile Z. Réglez les propriétés de la portée du balayage gamma pour commencer à 460 nanomètres et se terminer à 570 nanomètres de la plage de détection.

Définissez la largeur de bande de détection à cinq nanomètres et la taille du pas de balayage à cinq nanomètres. Démarrez l’acquisition par z-stack. Insérez et enregistrez deux spectres d’émission de référence adaptés pour le CFP et le YFP dans la base de données des colorants disponible dans la fenêtre de configuration pour exclure le bleed through spectral.

Sélectionnez le fichier image spectrale résultant de la session d’imagerie et ouvrez la fenêtre du processus. Ensuite, dans l’outil de séparation des colorants, sélectionnez Séparation spectrale des colorants, et configurez les réglages pour la séparation des colorants. Dans les listes déroulantes à gauche du dialogue, sélectionnez le nouveau spectre d’émission CFP en première position et le nouveau spectre d’émissions YFP dans la base de données spectre.

Dans le balayage gamma des images, identifiez l’image ayant la plus grande intensité de signal. Ensuite, déplacez-vous le long du z-scan pour sélectionner la section optique qui met en évidence la zone d’intérêt sur la zone de marge. Activez le mode de sélection du ROI sur la zone de marge du pôle animal pour définir la zone avec le meilleur spectre.

Cliquez sur la réticule ROI dans la fenêtre d’affichage et ajustez la taille du ROI de référence à 40 voxels dans la zone de mesures. Ouvrez le nouveau fichier généré contenant les deux canaux séparés. Produire une image de projection bidimensionnelle à partir de la série d’images tridimensionnelles en utilisant la projection à intensité maximale.

Dans la fenêtre Processus, sélectionnez recadre pour séparer les canaux en deux fichiers distincts, le canal un et le canal deux. Dans la fenêtre Processus, sélectionnez Combiner les images, puis sélectionnez le fichier canal deux et insérez-le dans la première option. Ensuite, sélectionnez le fichier du canal un et insérez-le dans la seconde option.

Régler un rescaling avec un facteur cinq et choisir l’opération de ratio. Cliquez sur Appliquer pour générer le nouveau fichier contenant l’image métrique de ratio. Enregistrez le fichier pour l’analyse des données.

Importez les fichiers image d’imagerie spectrale et de séparation des colorants dans le logiciel open source des Fidji pour analyse. Configurez les paramètres pour les mesures de lecture aux Fidji en utilisant Analyze and Set Measurements. Sélectionnez la surface, la densité intégrée et la valeur grise moyenne comme paramètres d’intérêt.

À l’aide de l’outil de sélection de polygones depuis la barre d’outils, sélectionnez la région d’intérêt correspondant à la marge de la gastrule. Dans l’ordre, cliquez sur Analyser, Outils et Gestionnaire de ROI pour enregistrer les spécifications ROI xy. Pour effectuer des mesures dans un ROI sélectionné, cliquez sur Analyser et Mesurer.

Organisez les FRET par valeurs de ratio CFP pour chaque ROI dans une feuille de calcul avec des groupes expérimentaux en colonnes et des valeurs brutes en lignes. Pour une seule réplique biologique, créez une table de colonnes avec une variable de groupement, où chaque groupe est défini par une colonne. À la fin de la gastrulation, fixez les embryons par immersion dans du paraldéhyde à 4 % préparé dans du PBS pendant 20 minutes à température ambiante.

Après fixation, lavez les embryons plusieurs fois avec du PBS. À l’aide d’une pipette Pastor, orientez les embryons latéralement dans un seul puits d’une plaque à 12 puits contenant du PBS frais. À l’aide d’un microscope stéréo avec un objectif de grossissement de 2,7x, un objectif de balayage de 0,63x et un facteur de zoom de 8,6, capturez les images en mode champ clair pour évaluer la présence d’une forme ovale.

Importez l’image de l’embryon capturée dans un logiciel fidjien. Pour mesurer la longueur des axes de l’embryon, sélectionnez l’outil droit dans la barre d’outils et cliquez sur Analyser, suivi de Mesurer. Après avoir effectué certaines mesures, ajoutez-les à la liste du gestionnaire de ROI et enregistrez le fichier ROI.

Exportez les données dans une feuille de calcul. Calculez le rapport des axes en divisant la longueur de l’axe majeur par la longueur de l’axe mineur. Calculez la moyenne, l’écart-type de la moyenne, ou l’erreur standard de la moyenne des différentes répliques.

Notre pipeline FRET en temps real dans le poisson zèbre permet la détection sensible précoce de l’activation pathogène de la signalisation ERK, le soutien à l’interprétation des variants et les tests d’efficacité des inhibiteurs MEK.