Glutamate et hypoxie comme un modèle de stress pour la isolé perfusé vertébrés Retina

L’objectif global de l’expérience suivante est d’introduire le glutamate ou le stress d’hypoxie comme modèle potentiel pour tester l’efficacité des agents neuroprotecteurs. Ceci est réalisé en obtenant d’abord des yeux bovins fraîchement nucléés et en effectuant une explication rapide, mais toujours traumatisante, de la rétine. Ensuite, après avoir fusionné les rétines avec une solution nutritive spéciale, des électrodes sont utilisées pour enregistrer une série d’électrorétinogrammes de base stables ou ERG.

Ensuite, le glutamate est ajouté à la solution nutritive, ou l’hypoxie est induite en ajoutant 100 % d’azote au lieu d’oxygène. Enfin, un ERG est enregistré afin de voir l’effet du stress glutamate ou de l’hypoxie sur les amplitudes des ondes A et B. Les résultats montrent une modification de la fonction rétinienne lorsqu’elle est exposée à l’hypoxie ou au stress glutamate par le biais d’enregistrements ERG.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la culture cellulaire ou les enregistrements ERG in vivo est que les tests fonctionnels peuvent être effectués contrairement aux cultures cellulaires sans avoir la variabilité exercée par le placement d’électrodes ou l’anesthésie générale par rapport aux expériences in vivo. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine pharmacologique, telles que l’analyse d’agents neuroprotecteurs. Les implications de cette technique s’étendent au traitement ou au diagnostic de maladies aiguës ou chroniques.

D’éventuels agents neuroprotecteurs peuvent maintenant être testés avec ce modèle de stress. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la neuroprotection dans le domaine de l’ophtalmologie, elle peut également être appliquée à d’autres domaines médicaux tels que les maladies neurodégénératives. Généralement, les personnes novices dans cette méthode auront du mal à cause de la technique de préparation.

Le modèle lui-même a été développé par le professeur Sickle à Cologne, et c’était un grand neurophysiologiste. Après avoir obtenu des yeux de bovin d’un animal abattu, placez-les dans une solution de faucille à température ambiante pour les transporter au laboratoire à l’aide d’une faible lumière rouge dans des conditions sombres adaptées. Retirez la partie antérieure de l’œil, puis effectuez une incision équatoriale d’environ quatre millimètres en arrière du limbe, et retirez la cornée, l’iris, le corps ciliaire et le cristallin en une seule pièce.

Gardez les rétines en solution de faucille. Ensuite, desserrez mécaniquement les attaches vitrées à la surface de la rétine et retirez le vitré de l’œilleton ouvert. Ensuite, divisez l’œil en quatre quadrants et, à l’aide d’un TR affinez, perforez des zones rondes d’environ sept millimètres de diamètre.

Séparez doucement la rétine de l’épithélium pigmentaire et pour la placer sur un appareil d’enregistrement, transférez la rétine sur un treillis et utilisez un anneau en plastique pour la fixer sur les électrodes. Placez ensuite l’appareil d’enregistrement à l’intérieur d’un boîtier à l’abri de la lumière. Avant de prendre des mesures dans l’obscurité, adaptez la rétine puis avec des filtres de densité neutre calibrés et un stimulus lumineux de 10 microsecondes réglé À des intervalles de cinq minutes, appliquez un flash xénon blanc unique d’un hertz pour une stimulation d’une intensité de 6,3 correspondant à l’intensité lumineuse ou MLX à la surface de la rétine.

Après la période d’adaptation à l’obscurité sous perfusion constante, mesurez les amplitudes du signal électrique jusqu’à ce que les amplitudes d’une onde soient stables. Pour commencer le test, remplacez l’oxygène pur par de l’azote pur pour tester l’hypoxie ou du glutamate de 250 micromolaires. Enregistrez les réponses électriques toutes les cinq minutes pendant 45 minutes.

Mesurez l’amplitude de l’onde B depuis le creux de l’onde A jusqu’au pic de l’onde B pour étudier l’effet de l’hypoxie ou du glutamate sur le potentiel du photorécepteur. Dans des conditions scotopiques, ajoutez un aspartate millimolaire à la solution nutritive pour supprimer l’onde B afin d’évaluer statistiquement les données, utilisez le test de Coof Smirnoff pour assurer une distribution normale pour toutes les données. Calculez la réduction des amplitudes et des pourcentages des ondes A et B après la phase d’exposition.

Par rapport à la dernière mesure avant l’exposition, comparez la réduction des amplitudes de l’ERG après 45 minutes à la fin de la période d’exposition à l’ERG mesurée avant l’application. Comparez les ondes a et b à la fin de la phase de lavage à l’amplitude correspondante avant l’exposition. Pour examiner une éventuelle récupération à des fins d’analyse statistique, utilisez le logiciel statistique JMP ou le logiciel SPSS.

Calculez les données tout au long de l’ensemble sous la forme de la moyenne, plus ou moins, de l’écart-type. Utilisez le test statistique approprié pour estimer la signification, comme indiqué ici. Après une perfusion d’une heure des préparations rétiniennes avec une solution étalon saturée en oxygène, l’amplitude de l’ERG s’est stabilisée et a montré moins de variation d’amplitude entre les mesures uniques.

Le pH, la pression osmotique, la température et l’OP deux ont été maintenus constants pour tous les essais. Pour isoler le signal du photorécepteur du signal de la rétine interne, un aspartate millimolaire a été ajouté à la solution étalon pour supprimer l’onde B. Dans des conditions hypoxiques, une diminution de l’amplitude d’une onde de 87,0 % a été notée.

Après un temps d’exposition de 45 minutes à la fin du lavage, une diminution de 36,5 % a été notée. C’était statistiquement significatif. De plus, une diminution initiale statistiquement significative de l’amplitude de l’onde B de 87,23 % a été enregistrée dans ce contexte.

Une réduction statistiquement significative de 25,5 % a été notée. Après exposition avec 250 micromolaires de glutamate, une réduction non significative de 7,8 % de l’amplitude d’une onde a été détectée après l’intervalle de temps défini. S’en est suivie une réduction non significative de 1,9 %Enfin, une diminution des amplitudes de l’ERG de 83,7 % a été enregistrée, et à la fin du lavage, une récupération BWA a été observée, entraînant une réduction non significative de 2,3 % après 75 minutes de perfusion avec une solution étalon.

Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier de garder un œil sur votre base ERG. Suite à cette procédure, des agents neuroprotecteurs ou offensants peuvent être testés afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la toxicité après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la XV avec l’électrophysiologie pour explorer les changements ERG dans un modèle standardisé.