Imagerie par immunofluorescence multiplex basée sur un code-barres d’ADN pour analyser des échantillons FFPE provenant d’un mélanome murin génétiquement reprogrammé

Nous présentons un protocole pour développer et valider un panel d’immunofluorescence multiplex pour étudier les tissus FFPE de souris et démontrons son utilité en étudiant des échantillons d’un modèle de mélanome traité avec des nanoparticules délivrant de l’ADN plasmatique, codant des signaux immunologiques pour reprogrammer le microenvironnement tumoral. Il manquait dans ce domaine des protocoles d’immunofluorescence multiplexe rigoureusement développés et validés compatibles avec les tissus FFPE de souris fixés au formol et inclus dans de la paraffine.

L’enrobage de paraffine fixé au formol préserve la morphologie des tissus à long terme, est facile à manipuler et à stocker, et permet la création de microréseaux de tissus pour visualiser plusieurs échantillons sur une seule lame.

L’imagerie protéomique spatiale améliorera la visualisation et l’analyse d’un microenvironnement tumoral complexe, aidant ainsi à la prédiction des réponses immunitaires, ce qui peut contribuer au développement de meilleures thérapies.

Nous utiliserons ce protocole pour permettre un meilleur profilage spatial des modèles de tumeurs chez la souris dans de nombreux autres types de tumeurs et différents organes immunitaires.

[Narrateur] Pour commencer, faites cuire les lames de tissu FFPE à 60 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, refroidissez les lames à température ambiante pendant 10 minutes avant de commencer la déparaffinisation et la réhydratation. Ensuite, incubez les lames dans une solution de xylène deux fois pendant cinq minutes chacune pour éliminer la paraffine, puis réhydratez le tissu en déplaçant les lames dans de l’éthanol à 100 % deux fois pendant cinq minutes chacune. Placez la lame séquentiellement dans des solutions d’éthanol à 90 %, 70 %, 50 % et 30 % pendant cinq minutes chacune. Lavez les lames deux fois avec de l’eau distillée pendant cinq minutes chacune. Effectuez la récupération de l’antigène, puis utilisez une solution de blanchiment fraîche pour blanchir le tissu deux fois à des intervalles de 45 minutes avant d’effectuer la coloration des anticorps. Ensuite, effectuez la coloration des anticorps pendant la nuit à quatre degrés Celsius à l’aide d’une chambre en plastique. Après la coloration, retirez la chambre en plastique et récupérez le cocktail d’anticorps précédemment appliqué. Lavez les lames deux fois dans un tampon de coloration pendant deux minutes chacune. Incuber les lames dans un bocal de coloration contenant 40 millilitres de solution de fixation post-coloration pendant 10 minutes, puis rincez-les trois fois avec du PBS pendant deux minutes chacune. Transférez maintenant les lames dans du méthanol glacé pendant cinq minutes, avant de rincer avec du PBS. Appliquez 200 microlitres de solution fixatrice finale sur chaque lame sous une chambre d’humidité. Après une incubation de 20 minutes à température ambiante, laver à nouveau les lames dans du PBS pendant trois cycles de deux minutes chacun. Si l’imagerie est immédiate, essuyez la lame autour du tissu à l’aide d’un mouchoir non pelucheux. Appuyez sur la cellule d’écoulement pendant 30 secondes à l’aide de l’équipement d’assemblage de la cellule d’écoulement. Si l’imagerie est ultérieure, stockez la lame sans appliquer la cellule d’écoulement dans la mémoire tampon de stockage à quatre degrés Celsius. Lorsque vous êtes prêt à imager, transférez les diapositives de la mémoire tampon de stockage vers PBS pendant 10 minutes avant d’appliquer la cellule d’écoulement. Ensuite, préparez les tampons DMSO de rodage en fonction des cycles d’imagerie souhaités. Préparez la solution mère rapporteure requise pour le nombre total de cycles d’imagerie. Pipetez 250 microlitres de solution mère de rapporteur et cinq microlitres de chaque rapporteur dans des tubes de microcentrifugation d’un millilitre étiquetés noirs ou ambrés. Transférez la solution dans une plaque noire à 96 puits et scellez-la avec une feuille adhésive. Démarrez maintenant l’appareil d’imagerie et utilisez le gestionnaire d’instruments pour régler les paramètres et les temps d’exposition. Placez la plaque rapporteure dans l’appareil, puis placez la lame dans le support de microscope pour commencer l’imagerie. Acquérir des images de tissus colorés. Installez la dernière version du logiciel d’analyse de pathologie numérique. Cliquez sur Créer un projet et sélectionnez un dossier de destination pour l’espace projet. Ensuite, cliquez sur Ajouter des images, puis sur Choisir des fichiers. Accédez ensuite au fichier TIFF QuP produit à partir de l’imagerie d’immunofluorescence multiplex. Réglez le type d’image sur fluorescence, conservez les paramètres par défaut, puis cliquez sur Importer. Si vous utilisez QuPath, double-cliquez sur la nouvelle image pour ouvrir un espace de travail, puis appuyez sur Fichier et Enregistrer régulièrement pour suivre les modifications du projet. Basculez les paramètres de visibilité et d’affichage des marqueurs à l’aide de l’outil Luminosité et contraste de la barre d’outils. À l’aide d’un pinceau ou d’une baguette, dessinez une annotation autour de toute la section du tissu. Définissez cette annotation comme un tissu complet tout en excluant la peau sus-jacente ou les régions qui ne doivent pas être analysées. Maintenez la touche Alt enfoncée pour créer des annotations négatives ou réduire les limites. Choisissez maintenant l’annotation en cliquant sur l’onglet Annotations et en appuyant sur Objets puis sur Annotations, puis sur Dupliquer les annotations sélectionnées. Activez le canal SOX 10, puis réduisez l’annotation dupliquée pour définir la région tumorale à l’aide de l’outil ALT + brosse/baguette. Sélectionnez maintenant l’annotation complète du tissu. Allez ensuite dans Objets suivis d’Annotations et Développez Annotations. Réglez le rayon d’expansion sur un micromètre et cliquez sur Exécuter. Renommez cette nouvelle annotation en Expansion tissulaire complète. Sélectionnez l’annotation de la tumeur, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Insérer dans la hiérarchie. Sélectionnez à nouveau l’annotation de la tumeur, puis allez dans Objets, Annotations, et cliquez maintenant sur Inverser. Définissez cette nouvelle annotation comme Stroma et répétez l’opération pour toutes les coupes de tissus. Pour exécuter la segmentation des cellules, cliquez sur l’onglet Image pour trouver la largeur des pixels et la hauteur de l’image. Téléchargez l’extension StarDist depuis GitHub. Importez l’extension QuPath StarDist.jar fichier dans QuPath. Téléchargez également les fichiers de script groovy StarDist et le fichier model depuis GitHub. Pour chaque section de tissu, sélectionnez les annotations de tumeur et de stroma. Dans la barre des paramètres, cliquez sur Automatiser puis sur Éditeur de script pour ouvrir l’interface du script. Ouvrez le script de segmentation de cellule StarDist approprié correspondant à la taille en pixels de l’image. Lorsque vous y êtes invité, sélectionnez StarDistcellsegmodel.pb pour la segmentation des cellules. Après la segmentation des cellules, enregistrez l’image, puis cliquez séquentiellement sur Mesurer, Exporter les mesures, sélectionnez les images correspondantes et définissez le type d’exportation comme cellules et le séparateur comme .csv. Choisissez l’emplacement d’un fichier de sortie, puis cliquez sur Remplir pour inclure les mesures pertinentes. Pour chaque marqueur de lignage à utiliser dans le clustering ou le phénotypage, sélectionnez une valeur moyenne à exporter. Pour normaliser les données protéomiques, ouvrez le fichier CSV exporté et tronquez les en-têtes de colonne pour ne conserver que le nom du marqueur. Après avoir installé la dernière version de R & R Studio, téléchargez le script de normalisation des marqueurs .r à partir de GitHub et exécutez-le pour filtrer les cellules en fonction de la taille nucléaire. Effectuez une normalisation minimale/maximale pour chaque marqueur. Une fois l’opération terminée, enregistrez le nouveau fichier CSV avec les données normalisées. La conjugaison du code-barres de l’ADN de l’anticorps a été confirmée par électrophorèse sur gel de protéines, montrant des bandes supplémentaires dans la région de la chaîne lourde. L’imagerie par immunofluorescence multiplex des tumeurs du flanc B16-F10 traitées avec des nanoparticules 4-1BBL/IL-12 et un anti-PD1 systémique a montré une expression distincte des marqueurs immunitaires dans toutes les sections tumorales. Le clustering FlowSOM a identifié une gamme plus large d’intensités d’expression des marqueurs par rapport au phénotypage Seurat, avec une différence d’intensité maximale d’environ 0,7 contre 0,5. Le phénotypage FlowSOM a également permis de classer un plus grand nombre de macrophages en sous-types M1 et M2. La quantification des densités de macrophages a montré que FlowSOM détectait des densités plus élevées de macrophages M1 et M2 par rapport à Seurat, tandis que Seurat classait plus de macrophages comme Autres. L’analyse spatiale a révélé que les macrophages M2 et les cellules tueuses naturelles présentaient les distances minimales moyennes les plus élevées après le traitement et que les macrophages M1 étaient plus prévalents autour des lymphocytes T CD8.