Tests d’immunofluorescence multiplex automatisés à haut débit pour la recherche translationnelle

Nous développons des kits pour des tests d’immunofluorescence multiplex rapides et sensibles. L’objectif ici est d’aider les chercheurs à profiler les différents types de cellules apparaissant dans les tissus FFPE

L’immunofluorescence est généralement réalisée à l’aide d’anticorps secondaires marqués à un colorant ou à la peroxydase. L’immunohistochimie a tendance à être faiblement plex. Les anticorps secondaires marqués par colorant souffrent d’un signal plus faible. Les tests d’amplification du signal Tyramide sont laborieux à optimiser et prennent plusieurs heures à plusieurs jours.

Les marqueurs des tests sont pré-optimisés et sont nettement plus rapides que les autres techniques. La pose de quatre marqueurs prend moins de huit heures, et environ trois heures de plus pour quatre biomarqueurs supplémentaires.

La capacité d’exécuter l’immunofluorescence multiplex plus rapidement permettra d’appliquer plus largement la protéomique spatiale et réduira l’obstacle à la compréhension de la contexture spatiale des tissus.

[Narrateur] Pour commencer, décongelez tous les réactifs du kit à température ambiante. Conservez les conjugués d’anticorps, l’enzyme d’amplification, l’initiateur d’échange et le neutralisant d’échange à moins 20 degrés Celsius jusqu’à l’utilisation. Vortex un diluant d’anticorps décongelé. Pipetez le diluant de l’anticorps dans un récipient. Centrifugez brièvement et ajoutez tous les anticorps dans la solution de coloration des anticorps 1 récipient. Ajouter le diluant d’anticorps fourni à une dilution de 1 à 100. Ensuite, utilisez une pipette pour mélanger doucement la solution, en évitant le vortex. Vortex la solution mixte de pré-amplification après décongélation pour bien mélanger. Ajoutez ensuite la solution dans le récipient de mélange respectif. Vortex, le tampon d’amplification et la pipette mélangent l’enzyme d’amplification. Diluez l’enzyme d’amplification dans un rapport de 1 à 10 dans le tampon d’amplification pour créer le tampon d’amplification. Mélanger délicatement par pipetage, en évitant le vortex. Ensuite, vortex et centrifuger la solution de contre-coloration nucléaire fournie et diluer 1 à 100 dans de l’eau ultrapure. Ensuite, diluez les sondes fluorescentes 1 solution dans un rapport de 1 à 20 dans un tampon de sonde. Insérez la baguette de réactif pleine dans l’instrument pour permettre de mesurer les volumes de réactifs. Accédez à l’onglet Configuration des lames en haut du logiciel du colorateur automatique une fois que tous les réactifs sont préparés. Cliquez sur le bouton Ajouter une étude et saisissez l’ID de l’étude, le nom de l’étude et les commentaires de l’étude si nécessaire. Sous Volume de distribution, sélectionnez 150 microlitres et choisissez *Dewax 4 Steps comme méthode de préparation. S’il n’est pas disponible dans la liste déroulante, ouvrez le menu de configuration du protocole, cochez la case de votre choix, puis cliquez sur OK. Une fois l’étude créée, cliquez sur le bouton Ajouter une diapositive situé sur le côté droit de l’écran de configuration de la diapositive. Entrez un nom unique pour la diapositive sous Commentaires de diapositive. Définissez le type de tissu sur Tester le tissu dans le champ approprié. Choisissez ensuite 150 microlitres pour le volume de distribution et réglez le mode de coloration sur Simple dans la liste déroulante de gauche et Routine dans la liste déroulante de droite. Sous Processus, choisissez IHC et définissez le marqueur sur la solution de coloration d’anticorps. Dans la section Protocoles de la fenêtre Ajouter une diapositive, sélectionnez Essai de coloration 1 pour la coloration, *Déparaffinage 4 étapes pour la préparation et *HIER 20 minutes avec ER2 pour HIER. Laissez le protocole Enzyme défini sur l’astérisque et cliquez sur Ajouter une diapositive lorsque tous les champs sont remplis. Après avoir ajouté toutes les diapositives, fermez la fenêtre Ajouter une diapositive et imprimez les étiquettes des diapositives, en les apposant sur la section de mouchoir correspondante. Chargez chaque diapositive étiquetée sur le plateau et placez les carreaux de couverture sur chaque section de mouchoir. Insérez le plateau de diapositives dans l’instrument et sélectionnez le colorateur automatique correspondant sur le côté droit de l’écran du logiciel. Vérifiez que les trois plateaux de lames et toutes les informations sur les réactifs, y compris les réactifs en vrac et préparés, sont visibles. Vérifiez que les conteneurs de réactifs en vrac sont correctement remplis et que les conteneurs à déchets ont un volume suffisant pour terminer le cycle. Appuyez ensuite sur le bouton de lecture pour commencer le cycle de coloration et assurer le retrait rapide des lames du colorateur automatique une fois la procédure terminée. Placez les lames tachées dans le tampon PBS et appliquez les lamelles de recouvrement à l’aide du support de montage. Imagez les lames à l’aide d’un microscope à fluorescence ou d’un scanner de lames entières avec des filtres compatibles avec les colorants de dosage. Pour le test d’échange, décongelez le tampon d’échange à température ambiante. Conservez le neutralisateur d’échange et l’initiateur d’échange stockés à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts à l’emploi. Préparez deux récipients de titrage de réactifs et récupérez le kit de détection pour l’utiliser pendant le protocole d’échange. Vortex le tampon d’échange. Et la pipette mélange l’initiateur d’échange. Préparez la solution d’échange dans son conteneur désigné en mélangeant les volumes requis d’initiateur d’échange et de tampon d’échange. Mélangez le contenu par pipetage uniquement. Combinez maintenant la solution des sondes fluorescentes 2 avec le tampon d’échange dilué dans le récipient correspondant. Vortex uniquement le tampon de sonde et la sonde fluorescente mélangent et la pipette mélange la solution finale. Placez la baguette de réactif pleine avec tous les réactifs préparés sur le colorant automatique. Laissez la machine effectuer un test de trempage sur tous les réactifs. Après avoir ajouté les diapositives, réglez le marqueur sur *Négatif. Et pour Preparation, HIER et Enzyme, sélectionnez l’option de tiret astérisque, car aucun déparaffinage ou récupération d’antigène n’est nécessaire pour le protocole d’échange. Cliquez sur Ajouter une diapositive lorsque vous avez terminé. Une fois toutes les diapositives ajoutées, fermez la fenêtre Ajouter une diapositive et imprimez les étiquettes des diapositives à apposer sur chaque section de tissu correspondante. Chargez chaque lame sur le plateau et placez une tuile de couverture sur chaque section de mouchoir avant de placer le plateau dans le colorateur automatique. Appuyez maintenant sur le bouton de lecture pour lancer la course. Des images d’un noyau de microréseau tissulaire capturées sur deux cycles de coloration à l’aide d’un protocole d’immunofluorescence à huit plex ont montré des marqueurs immunitaires distincts dans chaque tour, avec un co-enregistrement d’image réussi combinant les deux cycles en un composite unifié. L’imagerie de lames entières de tissus cancéreux colorectaux a permis d’identifier des phénotypes immunitaires basés sur la colocalisation de marqueurs, y compris les lymphocytes T régulateurs, les lymphocytes T épuisés et les macrophages immunosuppresseurs. La coloration par immunofluorescence a montré une co-expression de CD3, CD4 et FoxP3 dans les lymphocytes T régulateurs. PD1 et PDL1 dans les cellules tumorales et stromales. CD3, CD8 et PD1 dans les lymphocytes T cytotoxiques épuisés. et CD 68 et PDL1 dans les macrophages immunosuppresseurs. La comparaison de l’immunohistochimie à marqueur unique et de l’immunofluorescence simple ou multiplex a confirmé la concordance qualitative des modèles de coloration pour tous les marqueurs. La coloration en série sur différents types de tissus a confirmé des modèles d’expression cohérents de marqueurs immunitaires avec des noyaux de tissus représentatifs, montrant une coloration réussie et une variabilité minimale. Des coupes d’amygdales colorées dans six lames de série pour CD8 ont démontré une reproductibilité élevée avec une distribution de signal presque identique sur toutes les images. La quantification des densités cellulaires positives pour les marqueurs entre les types de tissus a montré les densités les plus élevées dans les amygdales et les ganglions lymphatiques, et les plus faibles dans le mélanome et le côlon.