Utilisation d'un haut-débit In Vitro Système microfluidique pour développer orales biofilms multi-espèces

L’objectif général de cette procédure est de créer des biofilms de plaque dentaire multi-espèces représentatifs de la composition. Parallèlement à l’analyse, cela se fait en créant d’abord un média et un inoculum représentatifs. L’inoculum est ensuite introduit dans la puce microfluidique après une nuit d’incubation, un biofilm se forme à l’intérieur du micro-canal.

Enfin, le biofilm est lavé et coloré pour une microscopie à balayage laser confocale in situ ou une microscopie à fluorescence épi. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme les cellules à flux est qu’il s’agit d’un système à haut débit qui permet de réaliser plusieurs expériences en parallèle tout en utilisant moins de matériaux et en ne nécessitant pas de milieux de laboratoire artificiels. Pour commencer, prélevez des échantillons de salive d’une cohorte de cinq volontaires ou plus dans des tubes en plastique individuels de 50 millilitres.

Tirez les échantillons de salive dans un seul bécher en plastique placé sur de la glace. Évitez d’utiliser des béchers en verre dans cette configuration, car les biopolymères de salive ont tendance à adhérer aux surfaces en verre. Ensuite, ajoutez di thio threes hole à l’échantillon jusqu’à ce que sa concentration finale soit de 2,5 millimolaires.

Remuez le mélange pendant 10 minutes sur de la glace. Tirez tout le contenu dans plusieurs tubes en plastique. Effectuez une rotation à grande vitesse pendant 30 minutes dans une centrifugeuse réfrigérée à quatre degrés Celsius pour séparer les particules de l’échantillon.

Transférez le salive dans un récipient frais et stérile et jetez la fraction de pastille pour préparer un milieu de croissance exempt de bactéries à partir de l’échantillon. Tout d’abord, diluez l’échantillon sans débris de jour avec trois volumes d’eau déminéralisée. Puis à l’aide d’un filtre à membrane à faible teneur en protéines de 0,22 micro.

Stérilisez la salive tout en gardant la fraction post-filtrée refroidie sur de la glace. Appliquez la solution stérilisée et conservez-la à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Prélevez des échantillons de salive d’une cohorte de cinq volontaires ou plus dans des tubes en plastique stériles de 50 millilitres.

Tirez les échantillons de salive dans un bécher en plastique pré-stérilisé à température ambiante ou un tube de 50 millilitres. Ajouter du glycérol stérilisé jusqu’à ce qu’il y ait 25 % de glycérol. 75 % de mélange de salive est atteint.

Contrairement au protocole du milieu de culture où les contaminants ont été éliminés à l’aide d’une étape de filtration, la technique stérile est importante ici pour éviter la contamination par des bactéries ou des champignons spécifiques non oraux. Mélangez la solution de glycérol de salive. Bien aliquote le mélange de glycérol de salive et conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires pour commencer.

Achetez ou fabriquez une puce microfluidique avec un microcanal similaire à ceux illustrés ici avant d’inoculer des échantillons dans la micropuce pour le milieu de croissance des bactéries négatives et l’inoculum positif pour les bactéries sur la paillasse à température ambiante. Mélangez chaque tube pendant cinq secondes avant de passer à l’expérience principale, commencez par ajouter 100 microlitres de milieu de croissance au réservoir de sortie des micropuces. À l’aide d’une pompe de contrôle par ordinateur, commencez à débiter le microcanal pendant deux minutes.

À température ambiante, inspectez visuellement chaque canal pour vous assurer qu’il s’agit d’un bon remplissage de liquide. Incuber la micropuce à température ambiante pendant 20 minutes. Cela recouvrira les parois latérales des microcanaux d’un échafaudage en biopolymère auquel le biofilm s’ancrera pendant la croissance.

Ensuite, aspirez manuellement le fluide restant du réservoir de sortie et transférez cette fraction, qui agira maintenant comme une charge d’équilibrage hydrodynamique vers le réservoir d’entrée. Après le dépôt de l’échafaudage de biopolymère, ajoutez 100 microlitres d’inoculum positif aux bactéries dans le réservoir de sortie. Placez la micropuce sur une plaque chauffante à 37 degrés Celsius et commencez l’écoulement inverse à cisaillement moyen.

Voyager de la sortie au réservoir d’entrée pendant exactement six secondes. Ensuite, éteignez la pompe et incubez la puce dans des conditions statiques à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes pour faciliter la fixation des bactéries ou des champignons aux parois latérales des microcanaux. Ensuite, retirez et jetez tout l’inoculum du réservoir de sortie à l’aide d’une pipette et remplissez le même réservoir en ajoutant un millilitre de milieu de croissance exempt de bactéries.

Incuber la micropuce à 37 degrés Celsius pendant environ 20 heures sous un faible débit pour favoriser la croissance du biofilm intra-canal lors de la croissance pendant la nuit. Pipetez toutes les solutions à partir des réservoirs d’entrée et de sortie. Appliquez 100 microlitres de PBS au réservoir d’entrée et lavez le micro-canal pendant 20 minutes.

Sous un faible flux direct de l’entrée à la sortie, le biofilm est maintenant prêt pour la coloration des morts vivants. Juste avant la coloration du biofilm, préparez 100 microlitres du mélange de coloration de viabilité tel qu’il se trouve dans le protocole de texte pour chaque canal à colorer. Protégez cette solution de l’exposition à la lumière jusqu’à ce qu’il soit nécessaire de colorer le biofilm, d’aspirer tout le liquide restant de l’entrée et de remplir le même réservoir avec 100 microlitres de mélange de coloration de viabilité.

Poussez ensuite la solution de coloration à travers le microcanal pendant 45 minutes. En cas de faible débit de soc à température ambiante, assurez-vous de protéger la puce de l’exposition à la lumière. Aspirez tout le liquide restant du réservoir d’entrée et remplissez avec 100 microlitres de PBS.

Lavez le microcanal pendant 20 minutes sous un faible débit de soc à température ambiante pour éliminer l’excès de colorants non liés. Le biofilm coloré est maintenant prêt pour la microscopie fluorescente afin de tester l’architecture tridimensionnelle des biofilms. Les reconstructions numériques à l’aide de balayages horizontaux avec un microscope confocal peuvent être utilisées pour visualiser la structure globale du film sous n’importe quel angle oblique.

De plus, l’analyse des colorants de morts vivants peut être appliquée au même ensemble de données pour étudier la dépendance spatiale de la viabilité cellulaire à l’intérieur du biofilm en fonction de différents traitements chimiques. Une fois le biofilm imagé, les cellules des canaux non colorés peuvent être extraites. À l’aide d’eau distillée fonctionnant à fort débit de cisaillement, la flore du biofilm peut ensuite être identifiée à partir de l’ADN génomique par pyroséquençage 4 5 4.

En suivant cette procédure. D’autres méthodes, comme l’ajout d’espèces ou de composés différents, peuvent être mises en œuvre afin de répondre à différentes questions, telles que ce qui arrive aux biofilms multi-espèces dans diverses conditions.