Utilisation d'un haut-débit

L'objectif général de cette procédure est de créer des biofilms de plaque dentaire représentatifs sur le plan compositionnel et composés de plusieurs espèces. En parallèle pour l'analyse, cela est réalisé en préparant d'abord un milieu et un inoculum représentatifs. L'inoculum est ensuite introduit dans la puce microfluidique après une incubation nocturne, et un biofilm se forme à l'intérieur du microcanal.

Enfin, le biofilm est lavé et coloré pour une observation in situ par microscopie confocale à balayage laser ou par microscopie en épifluorescence. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme les cellules à écoulement, est qu'il s'agit d'un système à haut débit permettant de réaliser plusieurs expériences en parallèle, en utilisant moins de matériaux et sans nécessiter de milieux artificiels de laboratoire. Pour commencer, collectez des échantillons de salive auprès d'un groupe de cinq volontaires ou plus dans des tubes en plastique individuels de 50 millilitres.

Prélevez les échantillons de salive dans un seul bécher en plastique placé sur de la glace. Évitez d'utiliser des béchers en verre dans ce montage, car les biopolymères salivaires ont tendance à adhérer aux surfaces en verre. Ensuite, ajoutez du dithiothrésitol à l'échantillon jusqu'à une concentration finale de 2,5 millimolaire.

Agiter le mélange pendant 10 minutes sur de la glace. Transférer l'ensemble du contenu dans plusieurs tubes en plastique. Effectuer une centrifugation à haute vitesse pendant 30 minutes dans une centrifugeuse préalablement refroidie à quatre degrés Celsius afin de séparer les particules du prélèvement.

Transférez l'échantillon de salive dans un nouveau récipient stérile et jetez la fraction de culot afin de préparer un milieu de croissance exempt de bactéries à partir de l'échantillon. Diluez d'abord l'échantillon exempt de débris du jour avec trois volumes d'eau déionisée. Puis, utilisez un filtre à membrane de 0,22 µm à faible liaison aux protéines.

Stérilisez la salive tout en maintenant la fraction filtrée au frais sur de la glace. Éluerez la solution stérilisée et conservez-la à moins 80 degrés Celsius jusqu'à utilisation. Collectez des échantillons de salive auprès d'un groupe de cinq volontaires ou plus dans des tubes en plastique stériles de 50 millilitres.

Prélevez les échantillons de salive dans un bécher en plastique stérilisé préalablement porté à température ambiante, ou dans un tube de 50 millilitres. Ajoutez du glycérol stérile jusqu'à obtention d'une mixture contenant 25 % de glycérol et 75 % de salive.

Contrairement au protocole du milieu de croissance où les contaminants étaient éliminés par une étape de filtration, la technique stérile est importante ici afin de prévenir toute contamination par des bactéries ou des champignons non spécifiques de la cavité buccale. Mélangez la solution de salive au glycérol. Répartissez soigneusement le mélange de salive et de glycérol en aliquotes et conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires pour commencer.

Achetez ou fabriquez une puce microfluidique avec un microcanal similaire à ceux illustrés ici avant d'ensemencer les échantillons dans la puce microfluidique, tant pour le milieu de croissance négatif que pour l'inoculum bactérien positif, sur la paillasse à température ambiante. Vortexez chaque tube pendant cinq secondes pour homogénéiser avant de poursuivre l'expérience principale ; commencez par ajouter 100 microlitres de milieu de croissance dans le réservoir de sortie de la puce microfluidique. À l'aide d'une pompe commandée par ordinateur, commencez un écoulement de cisaillement du milieu à travers le microcanal pendant deux minutes.

À température ambiante, inspectez visuellement chaque canal pour vous assurer qu'il est correctement rempli de liquide. Incubez la micropuce à température ambiante pendant 20 minutes. Cette étape permettra de recouvrir les parois latérales des microcanaux d'un support de biopolymère auquel le biofilm s'ancrera durant sa croissance.

Ensuite, aspirez manuellement ou retirez le milieu restant du réservoir de sortie et transférez cette fraction, qui servira désormais de charge équilibrante hydrodynamique vers le réservoir d'entrée. Après le dépôt de la matrice de biopolymère, ajoutez 100 microlitres de l'inoculum bactérien positif dans le réservoir de sortie. Placez la puce microfluidique sur une plaque chauffante à 37 degrés Celsius et commencez un écoulement rétrograde sous cisaillement modéré.

Parcourir le trajet du réservoir de sortie vers le réservoir d'entrée pendant exactement six secondes. Ensuite, éteindre la pompe et incuber la puce dans des conditions statiques à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes afin de faciliter l'attachement des bactéries ou des champignons aux parois latérales des microcanaux. Puis, retirer et jeter tout l'inoculum du réservoir de sortie à l'aide d'une pipette et remplir à nouveau ce réservoir en ajoutant un millilitre de milieu de croissance exempt de bactéries.

Incuber la puce microfluidique à 37 degrés Celsius pendant environ 20 heures sous un faible débit de cisaillement afin de favoriser la croissance du biofilm dans le canal pendant la culture nocturne. Prélever à la pipette toutes les solutions des réservoirs d'entrée et de sortie. Ajouter 100 microlitres de PBS dans le réservoir d'entrée et laver le microcanal pendant 20 minutes.

Sous un faible écoulement laminaire allant de l'entrée à la sortie, le biofilm est désormais prêt pour la coloration vivant-mort. Juste avant la coloration du biofilm, préparez 100 microlitres du mélange de coloration de viabilité, tel que décrit dans le protocole écrit, pour chaque canal à colorer. Protégez cette solution de l'exposition à la lumière jusqu'au moment où elle sera utilisée pour la coloration. Aspirez tout le liquide restant par l'entrée, puis remplissez à nouveau le même réservoir avec 100 microlitres du mélange de coloration de viabilité.

Ensuite, faites passer la solution de coloration dans le microcanal pendant 45 minutes. Sous un écoulement à faible cisaillement à température ambiante, veillez à protéger la puce de l'exposition à la lumière. Aspirez tout liquide restant du réservoir d'entrée et rechargez avec 100 microlitres de PBS.

Lavez le microcanal pendant 20 minutes sous un faible débit à température ambiante afin d'éliminer les colorants non liés en excès. Le biofilm coloré est désormais prêt pour la microscopie fluorescente afin d'analyser l'architecture tridimensionnelle des biofilms. Des reconstructions numériques utilisant des balayages horizontaux au microscope confocal peuvent être employées pour visualiser la structure globale du film sous n'importe quel angle oblique.

En outre, une analyse de coloration vivant-mort peut être appliquée au même ensemble de données pour étudier la dépendance spatiale de la viabilité cellulaire au sein du biofilm en fonction de différents traitements chimiques. Une fois le biofilm imagé, les cellules provenant des canaux non colorés peuvent être extraites. En utilisant de l'eau distillée circulant à un débit de cisaillement élevé, la flore du biofilm peut ensuite être identifiée à partir de l'ADN génomique par pyroséquençage 454.

Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes, comme l'ajout de différentes espèces ou composés, peuvent être réalisées afin de répondre à diverses questions, par exemple ce qui arrive aux biofilms multi-espèces dans diverses conditions.