Name: Protocole pour la formation du biofilm Streamer dans un dispositif microfluidique avec micro-piliers (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Apprenez la formation de biofilms streamers dans un dispositif microfluidique avec micro-piliers. Cette méthode utilise Pseudomonas fluorescens pour étudier la dynamique des biofilms en milieu poreux contrôlé.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs tiennent à remercier le professeur Howard Ceri, du Département des sciences biologiques de l’Université de Calgary, d’avoir fourni des souches bactériennes. A. Kumar remercie le CRSNG pour son soutien. T. Thundat remercie le Programme des chaires d’excellence en recherche du Canada (CERC) pour son soutien financier. Les auteurs tiennent également à remercier Mme Zahra Nikakhtari pour son aide en matière de vidéographie.

Effectuez les protocoles expérimentaux ici dans l&#39;ordre décrit ci-dessous. les protocoles de microfabrication pour la création de la plate-forme microfluidique sont examinées à l&#39;étape 1 étape 2 décrit le protocole de culture bactérienne (figure 2), et l&#39;étape 3 se rapporte à l&#39;assemblage du dispositif expérimental (figure 3). Enfin, l&#39;étape expérimentale réel est décrit à l&#39;étape 4. Procédure de fabrication 1 Chip REMARQUE: les procédures de sécurité doivent être suivies pour les procédés décrits ci-dessous. Consultez l&#39;agent de sécurité institutionnel pour plus de détails. <ol><li> Concevoir le masque avec un logiciel approprié (par exemple, L-Edit). La conception de la chaîne se compose d&#39;un micro-canal principal 625 um de largeur. La région centrale de la chaîne contient un réseau de micro-messages 50 m de diamètre, espacés de 25 um à part (voir Fichiers supplémentaires). </li><li> Imprimez le design sur verre (5 &quot;x 5&quot; verre sodocalcique), Qui a une épaisseur de 0,09 &quot;et est recouvert par environ 70 couche épaisse nm de chrome (Cr), en utilisant le masquage de manière à préparer un masque de photo. Utilisation AZ400K développeur pendant 1 min. Ensuite graver la couche de Cr en utilisant du Cr décapant pendant environ 1 min de l&#39;acétone pour enlever la résine et le nettoyer avec une solution piranha froid. (H 2 SO 4 et H 2 O 2 dans un rapport de 3: 1). </li><li> Photolithographie <ol><li> Nettoyer une plaquette 4 &quot;de silicium norme chimiquement avec une solution piranha pendant 20 min. </li><li> Rincer la plaque avec de l&#39;eau déminéralisée et sécher. </li><li> Chauffer la pastille sur une plaque chauffante (200 ° C pendant 15 min). </li><li> Enduire la plaque de silicium de résine photosensible. Ici, l&#39;AZ4620 de résine photosensible positive a été enduite par centrifugation sur une tranche de silicium à 2000 tours par minute pendant 25 secondes pour obtenir une couche épaisse de 12,5 um. </li><li> Retirez tout le solvant par cuisson douce de la tranche sur une plaque chauffante en faisant flotter la tranche de 90 secondes sur les flux d&#39;azote à 100 ° C. Alors, gardez-le dans le vide à til même température pendant 60 sec. </li><li> Placez la tranche dans une boîte sombre pendant 24 heures pour la déshydratation. </li><li> Exposer la tranche à de la lumière UV afin de transférer le motif conçu à la résine photosensible. </li><li> Immerger la plaquette dans une solution de révélateur de résine photosensible (AZ400K) à 240 sec. Ensuite, rincer la tranche avec de l&#39;alcool isopropylique et le sécher en le plaçant dans un flux d&#39;azote gazeux. </li></ol></li><li> ICP-DRIE (Plasma à couplage inductif - Deep Reactive Ion Etching) Process <ol><li> Appliquer gravure DRIE. Choisissez la profondeur de gravure appropriée en fonction de la profondeur finale requise pour le dispositif (50 um dans cette enquête). Résine photosensible agit comme une couche de masquage au cours de ce processus. </li><li> Retirer la résine photosensible restante avec de l&#39;acétone et nettoyer la plaquette. </li></ol></li><li> PDMS (polydiméthylsiloxane) Castings <ol><li> Utilisez trichlorométhylsilane (SMTC) pour silaniser la moule maître de silicium. Versez 2 ou 3 gouttes de trichlorométhylsilane dans un flacon et le placer dans un dessiccateur à côté de lasilicium moule maître. Autoriser 2-3 h pour le processus de silanisation pour terminer. </li><li> Dans un récipient séparé, mélanger la base de silicone Sylgard 184 avec l&#39;agent de durcissement par rapport en poids de 10: 1 pour préparer des PDMS. Dégazer les PDMS en le soumettant à des conditions sous vide (environ 2 h). </li><li> Mettez le moule maître de silicium dans un support. Puis verser le PDMS sur le moule maître de silicium pour former le tampon en PDMS. Veiller à ce que les bulles ne se forment pas dans les PDMS cours de ce processus. </li><li> Guérir les PDMS pendant 2 heures à 80 ° C. </li><li> Décollez le timbre de PDMS du moule maître. Ensuite, couper les PDMS timbre en puces distinctes. Enfin, l&#39;utilisation d&#39;un noyau de coupe pour percer des trous pour l&#39;entrée (s) et sortie (s). </li></ol></li><li> Collage de PDMS à verre <ol><li> Dégager la lamelle et PDMS tampon à un plasma d&#39;oxygène pendant 30 secondes. Bond PDMS timbre à la lamelle. </li><li> Pour obtenir une bonne étanchéité entre le timbre de PDMS et la lamelle couvre-objet, le dispositif de recuit en le plaçant dans un four à 70 ° C pendant 10 min. </li&gt; </ol></li></ol> 2. culture bactérienne REMARQUE: Les protocoles de biosécurité doivent être suivies pour les étapes 2-4. Consultez l&#39;agent de sécurité institutionnel pour plus de détails. <ol><li> Préparer des plaques de gélose LB <ol><li> Ajouter 20 g de Luria-Bertani (LB) gélose (Miller) des poudres et 500 ml d&#39;eau ultra-pure à une fiole de 1 L. Remuez pour dissoudre la poudre. </li><li> Stériliser à l&#39;autoclave à 15 psi, 121 ° C pendant 15 min. </li><li> Laisser le flacon refroidir à 50-55 ° C sur un banc ou dans un bain d&#39;eau dans la hotte de biosécurité. </li><li> Ajouter l&#39;antibiotique tétracycline pour obtenir une concentration finale de 50 pg / ml. Bien mélanger en tourbillonnant. </li><li> Verser le mélange dans des assiettes. Remplir chaque plaque jusqu&#39;à 1.2 à 2.3 complet. </li><li> Air flamme bulles brièvement pour les faire éclater si elles se forment. Bulles d&#39;air solidifiées sont difficiles à diffuser la culture bactérienne sur. </li><li> Laisser les plaques refroidir à la température ambiante pendant une nuit. </li><li> Quand ils sont froids,mettre des plaques de retour dans leur manche, sceller le sac, l&#39;étiquette (antibiotique et la date), et conserver à 4 ° C. REMARQUE: Couvrir le stock de plaques avec du papier d&#39;aluminium, comme la lumière désactive de nombreux antibiotiques. </li></ol></li><li> Préparation du bouillon LB <ol><li> Ajouter 20 g de Luria-Bertani (LB) (Miller) des poudres et 1 L d&#39;eau ultra-pure à un ballon. Remuez pour dissoudre la poudre. </li><li> Stériliser à l&#39;autoclave à 15 psi, 121 ° C pendant 15 min. </li><li> Laisser refroidir ballon à 50-55 ° C sur un banc ou dans un bain d&#39;eau dans la hotte de biosécurité. </li><li> Ajouter l&#39;antibiotique tétracycline pour obtenir une concentration finale de 50 pg / ml. Bien mélanger en tourbillonnant. </li><li> Une fois refroidi, placez la bouteille étiquetée à 4 ° C. REMARQUE: Couvrir la bouteille avec du papier d&#39;aluminium, comme la lumière désactive de nombreux antibiotiques. </li></ol></li><li> Les bactéries de la culture sur une plaque de gélose LB (Ce protocole utilise Pseudomonas fluorescens) <ol><li> Prenez le stock bactérienne du congélateur (-80 °; C) et placez-le sur la glace. </li><li> Placez le -80 ° C stocks bactérienne et une plaque de gélose LB dans une hotte de sécurité biologique. </li><li> La série de souches bactériennes sur une plaque de gélose LB dans un motif en zigzag. Couvrir la plaque de gélose et incuber à 30 ° C pendant la nuit. Enfin, stocker la plaque au réfrigérateur à 4 ° C. </li></ol></li><li> Préparer la solution bactérienne (S1) <ol><li> Verser 50 ml de milieu de bouillon LB à un ballon autoclave. Effectuez cette opération dans une hotte de sécurité biologique. </li><li> Transférer une colonie bactérienne unique de la gélose LB plaque dans le ballon. Cette opération doit également être effectuée à l&#39;intérieur d&#39;une hotte de sécurité biologique. </li><li> Mettre la fiole dans un incubateur agitateur à 30 ° C et 150 tours par minute pendant un temps suffisant (4 heures). </li></ol></li><li> Préparer la solution bactérienne diluée (de S2) <ol><li> Verser 5 ml de milieu LB de bouillon dans un tube en plastique stérilisé. </li><li> Diluer S1 par mélange avec un bouillon LB. Ensuite, vortex la solution. Diluer la solution atteindre l&#39;optique désiréedensité al (DO mesurée à 600 nm = 0,1). REMARQUE: expériences biofilm utilisent généralement des valeurs de DO dans ce voisinage. </li></ol></li></ol> 3 Préparer la configuration expérimentale <ol><li> Utilisation des pinces connecter des tubes souples en matière plastique (0,20 &quot;d&#39;identification) dans l&#39;entrée (s) et sortie (s) de la puce électronique. Les entrées et les sorties ont été préalablement percés dans la partie de PDMS de la puce (étape 1.5.5). Dans cette enquête , la puce électronique est constitué de deux entrées et une sortie. </li><li> Remplir la seringue (s) avec une solution bactérienne (solution S2) et enlever toutes les bulles dans la seringue (s). </li><li> Connectez embout de la seringue (s) (30 G 0,5 &quot;d&#39;aiguille émoussée) dans le tube (s) d&#39;entrée. Ensuite, connectez le tube de sortie (s) de perdre conteneur. </li></ol> 4 Réalisation de l&#39;expérience <ol><li> Fixez la seringue (s) à la pointe (s) de la seringue. </li><li> Place et fixe seringue (s) sur la pompe à seringue. Ensuite, placez la puce sous un microscope optique avec lentilles de l&#39;objectif de desired grossissement (par exemple, 40X). Couvrir la puce avec un dispositif de chambre de cellules vivantes de maintenir un environnement à température constante pour la croissance bactérienne (à 30 ° C pour P. fluorescens). </li><li> Placer la pompe au niveau du débit souhaité (par exemple 10 pi / h) et de lancer pompage de fluide. </li><li> Une fois que les bactéries sont introduites dans la chambre, la formation du biofilm est également déclenchée. La formation du biofilm et la maturation se produisent généralement sur une période de plusieurs heures, voire plusieurs jours. Observer et prendre des images de la croissance du biofilm à travers le microscope. </li></ol>

<ol><li>Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+web+of+streamers%3A+biofilm+formation+in+a+porous+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device.</a> Lab Chip. 12, 5133-5137 (2012).</li>
<li>Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Biofilms%3A+A+Common+Cause+of+Persistent+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).</li>
<li>Wong, G. C. L., O’Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+together+now%3A+Integrating+biofilm+research+across+disciplines%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bulletin%22%5BJournal%5D)">All together now: Integrating biofilm research across disciplines.</a> MRS Bulletin. 36, 339-342 (2011).</li>
<li>Yazdi, S., Ardekani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+aggregation+and+biofilm+formation+in+a+vortical+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Bacterial aggregation and biofilm formation in a vortical flow.</a> Biomicrofluidics. 6, 044114(2012).</li>
<li>Rusconi, R., Lecuyer, S., Guglielmini, L., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+flow+around+corners+triggers+the+formation+of+biofilm+streamers%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Laminar flow around corners triggers the formation of biofilm streamers.</a> J R Soc Interface. 7, 1293-1299 (2010).</li>
<li>Drescher, K., Shen, Y., Bassler, B. L., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+streamers+cause+catastrophic+disruption+of+flow+with+consequences+for+environmental+and+medical+systems%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Biofilm streamers cause catastrophic disruption of flow with consequences for environmental and medical systems.</a> P Natl Acad Sci USA. 110, 4345-4350 (2013).</li>
<li>Marty, A., Roques, C., Causserand, C., Bacchin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+bacterial+streamers+during+filtration+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Formation of bacterial streamers during filtration in microfluidic systems.</a> Biofouling. 28, 551-562 (2012).</li>
<li>Taherzadeh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+Study+of+the+Drag+and+Oscillatory+Movement+of+Biofilm+Streamers+in+Fast+Flows%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Computational Study of the Drag and Oscillatory Movement of Biofilm Streamers in Fast Flows.</a> Biotechnol Bioeng. 105, 600-610 (2010).</li>
<li>Vrouwenvelder, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+flow+regime+on+pressure+drop+increase+and+biomass+accumulation+and+morphology+in+membrane+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Impact of flow regime on pressure drop increase and biomass accumulation and morphology in membrane systems.</a> Water Res. 44, 689-702 (2010).</li>
<li>Mitchell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+enhanced+geologic+sequestration+of+supercritical+CO2%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Greenhouse+Gas+Control%22%5BJournal%5D)">Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2.</a> International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).</li>
<li>Soleimani, S., Van Geel, P. J., Isgor, O. B., Mostafa, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+biological+clogging+in+unsaturated+porous+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+Contam+Hydrol%22%5BJournal%5D)">Modeling of biological clogging in unsaturated porous media.</a> J Contam Hydrol. 106, 39-50 (2009).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+confinement+features+can+affect+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Microscale confinement features can affect biofilm formation.</a> Microfluid Nanofluid. 14, 895-902 (2013).</li>
<li>Neethirajan, S., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNeethirajan%2C+S+%22Encylopedia+of+Nanotechnology%22">Encylopedia of Nanotechnology</a>. Bhushan, B., et al. , Springer. (2012).</li>
<li>Barathi, S., Vasudevan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+petroleum+hydrocarbons+by+Pseudomonas+fluorescens+isolated+from+a+petroleum-contaminated+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Int%22%5BJournal%5D)">Utilization of petroleum hydrocarbons by Pseudomonas fluorescens isolated from a petroleum-contaminated soil.</a> Environ Int. 26, 413-416 (2001).</li>
<li>Das, S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+post-formation+dynamics+of+bacterial+biofilm+streamers+as+highly+viscous+liquid+jets%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv+preprint+arXiv%3A1312.6056%22%5BJournal%5D)">Formation and post-formation dynamics of bacterial biofilm streamers as highly viscous liquid jets.</a> arXiv preprint arXiv:1312.6056. , (2013).</li>
<li>Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commonality+of+elastic+relaxation+times+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Commonality of elastic relaxation times in biofilms.</a> Phys Rev Lett. 93, (2004).</li>
<li>Berejnov, V., Djilali, N., Sinton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-chip+methodologies+for+the+study+of+transport+in+porous+media%3A+energy+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Lab-on-chip methodologies for the study of transport in porous media: energy applications.</a> Lab Chip. 8, 689-693 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous avons démontré un dispositif microfluidique simple qui imite les milieux poreux pour étudier le développement de biofilm dans des habitats complexes. Il ya plusieurs étapes critiques qui dictent les résultats des expériences. Ils comprennent la géométrie de l&#39;appareil. Alors que la géométrie de poste peut varier, pores suffisamment d&#39;espace pour banderoles pour former est nécessaire. En outre, Valiei et al. 1 ont démontré que la formation de banderoles a lieu seulement dans une certaine ...

Récemment, nous avons démontré bactériennes dynamique de formation d&#39;un biofilm dans un dispositif microfluidique qui imite un milieu poreux 1. Les biofilms bactériens sont essentiellement des colonies de bactéries de surface agrégées qui sont encastrés par des substances polymériques extracellulaires (EPS) 2-4. Ces films minces de bactéries peuvent se former dans presque toutes les niches imaginables allant de surfaces lisses à l&#39;habitat beaucoup plus complexe de milieux poreux. Valiei et al. 1 a utilisé un dispositif microfluidique avec une matrice de micro-piliers pour simuler une structure de support poreuse et a étudié la formation de biofilms dans ce dispositif en fonction du débit de fluide. Ils ont constaté que dans un certain régime d&#39;écoulement, les biofilms filamenteux appelés banderoles ont commencé à émerger entre les différents piliers. Les banderoles peuvent être attachés à une ou deux extrémités de surfaces solides, mais le reste de la structure est suspendue dans un liquide. Serpentin formation commence typiquement après une première couche de biofilm est formé et son formation peut dicter l&#39;évolution à long terme de biofilm dans des habitats complexes. Récemment, plusieurs chercheurs ont étudié la dynamique de la formation de banderoles. Yazdi et al. 5 a montré que les banderoles peuvent se former dans les flux tourbillonnaire provenant d&#39;une bulle oscillante. Dans une autre expérience, Rusconi et al. Six étudié l&#39;effet de la courbure de la voie et de la géométrie de la voie de la formation de flammes. Ils ont constaté que les flammes peuvent se former dans les sections courbes de microcanaux, et streamer morphologie est liée à la mobilité. Des recherches récentes ont démontré que les banderoles peuvent avoir d&#39;importantes répercussions dans divers scénarios naturels et artificiels, car ils peuvent agir comme précurseurs pour la formation de structures matures dans les interfaces poreuses, conduire à une prolifération rapide et catastrophique biofilm dans un systèmes biomédicaux, et aussi causer accréditives importante interactions de structure, etc 1,7-9. banderoles de biofilms forment souvent ihabitats n complexes tels que les milieux poreux. La croissance du biofilm compréhension poreux environnement médiatique est pertinente à plusieurs procédés industriels et environnementaux tels que le traitement biologique des eaux usées 10, le maintien du bien-alésage intégrité dans des situations comme capture du CO 2 11 et le colmatage des pores dans le sol 12. Observer la formation de biofilm dans ces habitats complexes peut souvent être difficile en raison de l&#39;opacité du milieu poreux. Dans de telles situations, les plates-formes de médias poreux microfluidiques à base peuvent s&#39;avérer extrêmement avantageux car ils permettent en temps réel et le suivi in situ. Un autre avantage de la microfluidique est la possibilité de construire plusieurs bioréacteurs sur une seule plate-forme de bio-microfluidique et en même temps permettre le suivi et / ou l&#39;intégration de capteurs en ligne. La flexibilité de mettre en œuvre des expériences de laboratoire multiples dans un seul appareil et la capacité de recueillir des données pertinentes importantes pour l&#39;analyse statistique précise est une importante advantage de systèmes microfluidiques 13,14. Dans le contexte de la discussion ci-dessus, la compréhension dynamique de formation de banderoles dans un environnement de milieux poreux serait bénéfique à plusieurs applications. Dans cette étude, nous développons le protocole d&#39;enquête pour la formation de banderoles dans un appareil qui imite les milieux poreux. La fabrication de la plate-forme microfluidique, les mesures nécessaires pour la culture cellulaire et l&#39;expérimentation est décrite. Dans nos expériences, la souche bactérienne de type sauvage de Pseudomonas fluorescens a été utilisé. P. fluorescens, qui se trouve naturellement dans le sol, joue un rôle clé dans le maintien de l&#39;écologie du sol 15. La souche bactérienne utilisée a été génétiquement modifié pour exprimer la protéine fluorescente verte (GFP) constitutive.

<table><tbody><tr><td>Microscope fluorescent</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB agar</td><td>Fisher</td><td>BP1425-500</td><td>suspendre 40 g dans 1 L d’eau purifiée</td></tr><tr><td>bouillon LB</td><td>Fisher</td><td>BP1427-500</td><td>suspendre 20 g dans 1 L d’eau purifiée</td></tr><tr><td>Capot de biosécurité</td><td>Microzone corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>Fisher</td><td>875712</td><td>stérile 100 mm x 15 mm polystyrène Boîte de Pétri</td></tr><tr><td>Agitateur d’incubateur</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>Excella E24 série d’agitateurs</td></tr><tr><td>50 ml tube centrifuge stérilisé</td><td>Corning</td><td>430828</td><td>Polypropylène RNase-/DNase sans</td></tr><tr><td>tétracycline</td><td>Base MP Biomedicals</td><td>103012</td><td>50 &#956 ; g/ml</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 silicone</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>68037-59-2</td><td>Élastomère Base et agent de durcissement</td></tr><tr><td>Photorésine positive (AZ4620)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube en plastique</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocole pour la formation du biofilm streamer dans un dispositif microfluidique avec micro-piliers

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Plusieurs espèces bactériennes possèdent la capacité de se fixer sur les surfaces et dans les coloniser la forme de films minces appelées biofilms. Les biofilms qui se développent dans les milieux poreux sont pertinentes pour plusieurs procédés industriels et environnementaux tels que le traitement des eaux usées et séquestration du CO 2. Nous avons utilisé Pseudomonas fluorescens, une bactérie aérobie Gram-négatif, à étudier la formation de biofilm dans un dispositif microfluidique qui imite les milieux poreux. Dispositif microfluidique est constituée d&#39;une matrice de micro-messages, qui ont été fabriqués en utilisant la lithographie molle. Par la suite, la formation de biofilms dans ces dispositifs à écoulement a été étudiée et nous démontrons la formation de biofilms filamenteux appelés banderoles dans notre dispositif. Les protocoles détaillés pour la fabrication et l&#39;assemblage de dispositif microfluidique sont fournis ici avec les protocoles de culture bactérienne. Les procédures détaillées pour l&#39;expérimentation avec le dispositif microfluidique sont également présentées, ainsi que représentantrésultats.

En utilisant le protocole de microfabrication mentionné ci-dessus, un dispositif microfluidique à base de PDMS a été construit. Figure 1 montre le microscope électronique à balayage (MEB) d&#39;images de l&#39;appareil PDMS. Figure 1a représente la section d&#39;entrée du dispositif. Une entrée en forme de fourche est créé pour égaliser la pression à travers la tête de l&#39;appareil. De plus l&#39;imagerie SEM a montré également que les parois de pilier sont presque verticale (...

Des protocoles pour l’étude de la formation de biofilms dans un dispositif microfluidique qui imite les milieux poreux sont discutés. Le dispositif microfluidique se compose d’un réseau de micro-piliers et la formation de biofilms par Pseudomonas fluorescens dans ce dispositif est étudiée.

Protocole pour la formation du biofilm Streamer dans un dispositif microfluidique avec micro-piliers

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

L'objectif général de cette procédure est de démontrer la formation de filaments bactériens dans un dispositif microfluidique comportant des micro-piliers. Cela est réalisé en premier lieu par la fabrication de la puce microfluidique. La deuxième étape de la procédure consiste à cultiver les bactéries testées, dans ce cas Pseudomonas fluorescens.Les étapes finales consistent à assembler le dispositif expérimental, à injecter les bactéries dans la puce microfluidique et à recueillir les données. En fin de compte, les résultats peuvent montrer l'évolution temporelle des filamentations à l'aide d'images de microscopie par fluorescence. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les différentes étapes sont difficiles à apprendre.En raison de la nature interdisciplinaire de l'expérience, cette procédure nécessite des tranches de silicium munies de gravure ionique réactive profonde. Le photo-résist sur les tranches doit être éliminé. Commencez par le moule principal silencieux.Ajoutez deux ou trois gouttes de trichloroéthylène dans un flacon et placez-le dans un dessiccateur, en laissant le moule en position orientée vers le haut à côté. En deux ou trois heures, le moule sera silanisé. Pendant la silanisation, préparez le mélange de PDMS en mélangeant la base de silicone Cigar 1 8 4 avec un agent de réticulation selon un rapport de 10 à 1.Ensuite, dégazer le PDMS sous vide pendant environ deux heures. Transférer maintenant une plaquette silanisée vers un support et verser le PDMS dessus, en veillant à ce qu'aucune bulle ne se forme. Laisser le PDMS polymériser sur la plaquette à 80 degrés Celsius pendant deux heures.Ceci permet de fabriquer un tampon A-P-D-M-S à partir du moule en silicium dimensionné. Une fois le durcissement terminé, détacher délicatement le tampon PDMS à l’aide d’un cutter. Ensuite, découper le tampon pour former une puce microfluidique à l’aide du cutter.À présent, utilisez un foret carottier pour percer des trous aux positions d'entrée et de sortie sur le tampon. L'étape suivante consiste à coller le tampon sur du verre. Exposez une lame de couverture de 24 millimètres et le tampon en PDMS à un plasma d'oxygène pendant 30 secondes.Après l'exposition, fixer la lame couvre-objet sur le côté inférieur du tampon en PDMS afin qu'un collage se forme. Placer l'ensemble dans un four à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes. Pour terminer le processus de ce protocole, préparer des boîtes de milieu LB fabriquées avec de l'eau ultrapure et additionnées de 50 microgrammes par millilitre de tétracycline ajoutée à une température de 50 à 55 degrés Celsius.Lors de la coulée des boîtes, les bulles peuvent être éliminées en les passant brièvement à la flamme. Les boîtes refroidies et solidifiées doivent être datées et conservées à quatre degrés Celsius, enveloppées dans du papier d’aluminium. Préparez également du bouillon LB à l’eau ultra-pure, additionné de 50 microgrammes par millilitre de tétracycline.Conserver le bouillon à quatre degrés Celsius et également enveloppé dans du papier d'aluminium. Maintenant, cultiver des stocks de Pseudomonas fluorescens conservés à moins 80 degrés Celsius sur des géloses LB ; tracer les géloses selon un motif en zigzag et les incuber toute la nuit à 30 degrés Celsius à l'abri de la lumière. Le lendemain, prélever une colonie sur la gélose et ensemencer un flacon contenant un milieu S1 fraîchement préparé, incubé toute la nuit à 30 degrés Celsius avec agitation à 150 tr/min.Mesurez la densité optique de la culture après l'incubation. Préparez ensuite la solution S deux. Ajoutez cinq millilitres de LB dans un tube en plastique, puis ajoutez suffisamment de la solution S un pour obtenir une DO à 600 nanomètres de 0,1, ce qui est typique pour une expérience de biofilm.Commencez par installer l'expérience à l'aide de pincettes. Reliez des tubes en plastique d'un diamètre intérieur de 0,20 pouce aux entrées et sorties de la puce préparée. Les tubes doivent être flexibles et suffisamment longs. Ici, ils mesurent environ 20 pouces.Ensuite, remplir les seringues avec la solution S2. Fixer des aiguilles émoussées de calibre 30 et éliminer les bulles. Il est essentiel d'empêcher l'entrée de bulles d'air dans le canal, en particulier en raison de la durée prolongée de l'expérience.Les bulles peuvent endommager les structures fragiles formées par les bactéries. Ensuite, connectez les seringues aux tubes d'entrée et reliez les tubes de sortie à des récipients pour déchets. Placez maintenant les seringues dans une pompe à seringue et réglez la pompe à la vitesse d'écoulement souhaitée, par exemple huit microlitres par heure, sur un microscope équipé d'une chambre à cellules maintenue à la température d'incubation.Utilisez un objectif 40 x pour observer la puce microfluidique. Démarrez maintenant la pompe. Lorsque les bactéries sont introduites dans la chambre, la formation du biofilm commence également.Le biofilm va se former et mûrir pendant plusieurs heures, voire plusieurs jours ; prenez des images pour suivre son évolution. Une puce microfluidique fabriquée par SEMA a été utilisée pour l'imagerie. L'entrée en forme de fourche est créée afin d'égaliser la pression hydraulique sur l'ensemble du dispositif.On peut également observer que les parois des piliers sont presque verticales. Pour examiner la formation de biofilm, des fluorophores ont été injectés dans le dispositif à un débit de huit microlitres par heure. La formation du biofilm a commencé quelques minutes après l'infusion de la culture bactérienne diluée.Cependant, après quelques heures, l'apparition de structures filamenteuses s'étendant entre les micro-piliers a été observée près de la région médiane. L'ellipse en pointillés délimite un flux en formation ; les flux se formaient fixés par une extrémité à la région polaire de l'un des micro-piliers. Des flux ont également été observés le long de la diagonale entre deux micro-piliers.L'épaisseur des filaments augmentait au fil du temps en raison de la division cellulaire ainsi que de l'incorporation de bactéries planctoniques. Ils proliféraient également au fil du temps, et l'occupation d'un volume important dans le dispositif menait à la formation d'un biofilm mature, pouvant entraîner un colmatage du dispositif. Une simulation mécanique de l'écoulement à travers le dispositif montre que les filaments s'orientent initialement le long des lignes de courant du fluide.De plus, lors de la phase initiale, les filaments se forment à des endroits où la vitesse d'écoulement est maximale. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment les filaments de biofilm se forment et évoluent dans un environnement microfluidique. N'oubliez pas que manipuler des bactéries peut présenter un danger extrême, et que des précautions telles que le respect des protocoles de biosécurité doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

protocol-for-biofilm-streamer-formation-microfluidic-device-with

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Nous décrivons un protocole pour la fabrication de dispositifs microfluidiques qui peut permettre la capture cellulaire et de culture. Dans cette approche microstructures motifs tels que des rainures dans les canaux microfluidiques sont utilisés pour créer les régions à faible contrainte de cisaillement dans lequel la cellule peut quai.

Un dispositif microfluidique avec des modèles Groove pour étudier le comportement cellulaire

Ce protocole décrit une microfluidique de co-culture de modèle pour la culture simultanée et localisée des cellules épithéliales et des bactéries. Ce modèle peut être utilisé pour étudier le rôle des différents signaux moléculaires solubles sur la pathogenèse ainsi que l'écran de l'efficacité des souches bactériennes probiotiques putatifs.

Microfluidiques Co-culture de cellules épithéliales et des bactéries d&#39;enquête sur les Soluble signal médiée par des interactions

Source : Kurz, D. L., et al. Plateforme microfluidique pour étudier le bioclogging dans des milieux poreux. J. Vis. Exp. (2022)La vidéo montre l’utilisation d’un dispositif microfluidique pour étudier la formation de biofilms. Une suspension bactérienne est introduite dans le microcanal, suivie d’une incubation pour permettre le développement du biofilm. Le débit est ensuite repris, et la surveillance de la pression ainsi que l’imagerie sont utilisées pour détecter la formation de biofilms et...

Un dispositif microfluidique pour l’imagerie en temps réel et le suivi de la pression lors de la formation du biofilm

Un procédé pour créer et imager des ponts capillaires dans la géométrie de fente-pore est présenté. La création de ponts capillaires repose sur la formation de piliers pour fournir une hétérogénéité physique et chimique directionnelle pour épingler le fluide.  Les ponts capillaires sont formés et manipulés à l’aide de micro-scènes et visualisés à l’aide d’une caméra CCD.

Fabrication et visualisation de ponts capillaires en géométrie des pores fendus

Le but de ce document sur les méthodes est de décrire l'utilisation d'un système microfluidique pour le développement de biofilms multi-espèces qui contiennent généralement des espèces identifiées dans la plaque dentaire supra-gingival humain. Méthodes pour décrire l'architecture du biofilm, biofilm viabilité, et une approche de la récolte biofilm pour les analyses de culture-dépendante ou indépendante de la culture sont mis en évidence.

Utilisation d&#39;un haut-débit<em&gt; In Vitro</em&gt; Système microfluidique pour développer orales biofilms multi-espèces

Les biofilms ont des interactions complexes avec leur environnement. Pour étudier de manière exhaustive les interactions biofilm-environnement, nous présentons ici une série de méthodes permettant de créer un environnement chimique hétérogène pour le développement de biofilms, de quantifier la vitesse d’écoulement locale et d’analyser le transport de masse dans et autour des colonies de biofilms.

Méthodes de caractérisation de la Co-développement de biofilms et Habitat Hétérogénéité

Ce protocole décrit l’utilisation d’un dispositif microfluidique automatisées personnalisables pour visualiser la formation de biofilms de Candida albicans dans des conditions physiologiques hôte.

Visualisation de la Formation de biofilms Candida albicans à l’aide d’un dispositif automatisé de microfluidique

Les courbes révolutionnaires sont des outils efficaces pour étudier le transport des bactéries dans les médias poreux. Ici, nous introduisons des outils basés sur des dispositifs fluidiques en combinaison avec la microscopie et le comptage cytométrique de flux pour obtenir des BTCs.

Combiner des dispositifs fluides avec la microscopie et la cytométrie de débit pour étudier le transport microbien dans les médias poreux à travers les échelles spatiales

Nous présentons une technologie qui utilise l’assemblage assisté par capillarité dans une plate-forme microfluidique pour modeler des objets de taille micro en suspension dans un liquide, tels que des bactéries et des colloïdes, dans des réseaux prescrits sur un substrat de polydiméthylsiloxane.

Modelage de micro-organismes et de microparticules par assemblage séquentiel assisté par capillarité

Le présent protocole décrit une plateforme microfluidique pour étudier le développement de biofilms dans des milieux poreux quasi-2D en combinant l’imagerie microscopique à haute résolution avec des mesures simultanées de différence de pression. La plateforme quantifie l’influence de la taille des pores et des débits de fluide dans les milieux poreux sur le biocolmatage.

Une plateforme microfluidique pour étudier le biocolmatage en milieu poreux

Apprenez la formation de biofilms streamers dans un dispositif microfluidique avec micro-piliers. Cette méthode utilise Pseudomonas fluorescens pour étudier la dynamique des biofilms en milieu poreux contrôlé.

Protocole pour la formation du biofilm Streamer dans un dispositif microfluidique avec micro-piliers

Explorer plus de vidéos