Protocole pour la formation du biofilm Streamer dans un dispositif microfluidique avec micro-piliers

Des protocoles pour l’étude de la formation de biofilms dans un dispositif microfluidique qui imite les milieux poreux sont discutés. Le dispositif microfluidique se compose d’un réseau de micro-piliers et la formation de biofilms par Pseudomonas fluorescens dans ce dispositif est étudiée.

L’objectif global de cette procédure est de démontrer la formation de serpentins bactériens dans un dispositif microfluidique avec des micro-piliers. Ceci est accompli en fabriquant d’abord la puce microfluidique. La deuxième étape de la procédure consiste à cultiver les bactéries testées, dans ce cas la fluorescence du pseudomonas.

Les dernières étapes consistent à assembler le dispositif expérimental, à injecter les bactéries dans la puce microfluidique et à collecter des données. En fin de compte, les résultats peuvent montrer l’évolution temporelle des serpentins à travers des images de microscopie à fluorescence de la grippe. La démonstration visuelle de ce métal est essentielle car les différentes étapes sont difficiles à apprendre.

En raison de la nature interdisciplinaire de l’expérience, cette procédure nécessite des plaquettes de silicium avec une gravure ionique réactive profonde. La résine photosensible sur les plaquettes doit être lavée. Commencez par faire taire le moule maître.

Ajoutez deux ou trois gouttes de trichloréthylène dans un flacon et placez-le dans un dessiccation avec le motif du moule vers le haut à côté. Dans deux ou trois heures, le moule sera siloisé. Pendant la siloïsation, préparez le mélange de cigare PDMS 1 8 4 base de silicone avec un agent de durcissement dans un rapport de 10 pour un.

Ensuite, dégazez le PDMS sous vide pendant environ deux heures. Transférez maintenant une plaquette siloisée dans un support et versez le PDMS dessus, en veillant à ce qu’aucune bulle ne se forme. Laissez le PDMS durcir sur la plaquette à 80 degrés Celsius pendant deux heures.

Cela fabrique le tampon A-P-D-M-S à partir du moule en silicone dimensionné. Une fois le durcissement terminé, décollez le tampon PDMS à l’aide d’un cutter. Découpez ensuite le tampon en une puce microfluidique à l’aide du cutter.

Maintenant, à l’aide d’une carotte de coupe, percez des trous aux positions d’entrée et de sortie sur le tampon. L’étape suivante consiste à coller le timbre sur du verre. Exposez une lamelle de 24 millimètres et le tampon PDMS au plasma d’oxygène pendant 30 secondes.

Après l’exposition, fixez la lamelle de couverture sur la face inférieure du tampon PDMS et une liaison se formera. Placez l’ensemble dans un four à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes. Pour compléter le processus de ce protocole, préparez des plaques LB faites avec de l’eau ultrapure et dosées avec 50 microgrammes par millilitre de tétracycline ajoutés à 50 à 55 degrés Celsius.

Lors du versement des assiettes, les bulles peuvent être éclatées en les flambant. Les plaques refroidies et solidifiées doivent être datées et stockées à quatre degrés Celsius dans une pellicule de papier d’aluminium. Préparez également un bouillon LB à base d’eau ultra pure et dosé avec 50 microgrammes par millilitre de tétracycline.

Conservez le bouillon à quatre degrés Celsius et enveloppé dans du papier d’aluminium. Maintenant, les stocks de culture de fluorescence de pseudomonas stockés à moins 80 degrés Celsius sur les plaques LB, strient les plaques en zigzag et les incubent toute la nuit à 30 degrés Celsius dans l’obscurité. Le lendemain, prélevez une colonie dans l’assiette et inoculez une fiole de S one fraîchement préparée, incubée toute la nuit à 30 degrés Celsius avec 150 tr/min d’agitation.

Mesurer la densité optique de la culture après l’incubation. Faites ensuite la solution S deux. Ajoutez cinq millilitres de LB dans un tube en plastique, puis ajoutez suffisamment de la solution S un pour un DO à 600 nanomètres de 0,1, ce qui est typique d’une expérience sur le biofilm.

Tout d’abord, configurez l’expérience à l’aide d’une pince à épiler Connectez des tubes en plastique d’un diamètre intérieur de 0,20 pouce aux entrées et sorties de la puce préparée. Les tubes doivent être souples et suffisamment longs. Ici, ils mesurent environ 20 pouces.

Remplissez ensuite les seringues avec la solution S two. Fixez des aiguilles émoussées de calibre 30 et retirez les bulles. Empêcher les bulles d’air de pénétrer dans le canal est une étape critique, notamment en raison de la durée de la ligne de l’expérience.

Les bulles peuvent endommager les structures molles formées par les bactéries. Connectez ensuite les seringues aux tubes d’entrée et connectez les tubes de sortie aux conteneurs à déchets. Positionnez maintenant les seringues dans un pousse-seringue et réglez la pompe sur le débit souhaité, par exemple huit microlitres par heure sur un microscope équipé d’une chambre cellulaire réglée sur la température d’incubation.

Utilisez un objectif 40x, peut-être pour voir la puce microfluidique. Maintenant, démarrez la pompe. Lorsque les bactéries sont introduites dans la chambre, la formation d’un biofilm est également initiée.

Le biofilm va se former et mûrir pendant des heures, des jours, prendre des images pour suivre sa progression. À l’aide de SEMA, une puce microfluidique fabriquée a été imagée. L’entrée en forme de fourche est créée pour égaliser la tête de pression à travers l’appareil.

On peut également voir que les murs des piliers sont presque verticaux. Pour examiner la formation du biofilm, la fluorescence a été injectée dans l’appareil à huit microlitres par heure. La formation du biofilm a commencé après quelques minutes d’infusion de la culture bactérienne diluée.

Cependant, après quelques heures, l’apparition de structures filamenteuses s’étendant entre les micro-piliers a été observée près de la section médiane. L’ellipse pointillée délimite une banderole en formation de serpentins, attachée à une extrémité à la région polaire de l’un des micro-piliers. Des banderoles ont également été observées le long de la diagonale entre deux micro-piliers.

L’épaisseur des serpentins a augmenté avec le temps en raison de la division cellulaire, ainsi que de l’incorporation de bactéries planctoniques. Ils ont également proliféré avec des streamers temporels occupant un grand volume dans le dispositif a conduit à la formation d’un biofilm mature, qui pourrait obstruer le dispositif. Une simulation mécanique de l’écoulement à travers le dispositif montre que les serpentins s’orientent initialement le long des lignes de courant des fluides.

De plus, dans la phase initiale, les serpentins proviennent d’endroits où la vitesse d’écoulement est la plus élevée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la formation et de l’évolution des serpentins de biofilm dans un environnement microfluidique. N’oubliez pas que travailler avec des bactéries peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que des protocoles de biosécurité doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.