Étiquetage immunologique post-enrobage des protéines synaptiques dans l'hippocampe cultures Slice

La localisation et la distribution des protéines fournissent des informations importantes pour la compréhension de leurs fonctions cellulaires. La résolution spatiale supérieure de la microscopie électronique (EM) peut être utilisé pour déterminer la localisation subcellulaire d'un antigène donné à la suite immunohistochimie. Pour les tissus du système nerveux central (SNC), la préservation de l'intégrité structurelle tout en maintenant antigénicité a été particulièrement difficile en EM études. Ici, nous adoptons une procédure qui a été utilisée pour préserver les structures et les antigènes du système nerveux central d'étudier et de caractériser les protéines synaptiques dans l'hippocampe de rat neurones pyramidaux CA1.

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer un marquage ImmunoGold pour déterminer la localisation ultra structurelle des protéines synaptiques dans les neurones paramétalliques de l’hippocampe du rat. Ceci est accompli en enlevant d’abord la région CA une de la tranche organotypique, en coupant le coin supérieur pour se souvenir de l’orientation correcte et en l’incubant dans un fixateur sans osmium sur de la glace. La deuxième étape consiste à déshydrater le tissu fixé et à le laisser durcir en l’infiltrant avec de la résine.

Ensuite, des sections ultra-minces sont découpées dans des tissus incrustés dans de la résine et elles sont placées sur des grilles de nickel. La dernière étape consiste à effectuer une immunohistochimie sur les tissus de la section. En fin de compte, l’immunomicroscopie électronique est utilisée pour déterminer la localisation des protéines dans la synapse. D’accord.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la plasticité synaptique, telles que la façon dont la localisation des protéines dans les épines dendritiques peut aider à comprendre leur rôle dans la fonction synaptique. Bien que cette méthode soit optimisée pour les coupes organotypiques d’hippocampe, elle peut également être extrêmement précieuse pour d’autres préparations neuronales, y compris les coupes de cerveau aiguës et les cultures neuronales primaires. Commencez cette procédure en plaçant la tranche d’hippocampe organotypique dans une boîte de Pétri en polystyrène contenant du tampon de phosphate de Sorensen frais et glacé.

Ajoutez un à deux millilitres supplémentaires de tampon glacé directement sur les tranches. Afin d’isoler le sous-champ de l’AC de la tranche, utilisez un scalpel jetable pour couper doucement la tranche à côté du gyrus denté, qui est parallèle à la couche cellulaire de l’AC. Coupez ensuite la tranche restante verticalement pour supprimer le sous-champ CA trois et le sulu.

Ensuite, coupez un coin de la tranche CA pour aider à identifier la surface supérieure du tissu et retirez soigneusement le tissu de la membrane à l’aide de l’arrière du scalpel. Transférez doucement le tissu dans une plaque à 12 puits contenant du tampon de Sorensen glacé. Retirez le tampon et ajoutez 0,5 à un millilitre de fixateur glacé à pH 7,3 dilué dans le tampon de Sorensen afin qu’il recouvre adéquatement l’échantillon.

Ensuite, incubez pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, retirez le fixateur du puits et lavez les échantillons trois fois pendant 20 minutes dans un tampon de Sorensen glacé. Ensuite, incubez l’échantillon dans 1 % d’acide tannique en poids par volume dans un tampon de malate de 0,1 molaire à un pH de 6,0.

Après 40 minutes, rincez l’acide tannique en lavant l’échantillon deux fois pendant 20 minutes dans le tampon de malate. Ensuite, incubez l’échantillon pendant 40 minutes dans 1 %Acétate d’urinoir dans un tampon de malate L’acétate d’urinoir est sensible à la lumière et est radioactif. Manipulez donc avec précaution et placez l’échantillon dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant l’incubation.

Après l’incubation, rincer les échantillons deux fois pendant 20 minutes chacun dans un tampon de malate glacé, puis incuber pendant 20 minutes dans du chlorure de platine à 0,5 % dans un tampon de détenu. Enfin, rincez tout chlorure de platine résiduel en lavant deux fois pendant 20 minutes. Chaque zone tampon de détenu stocke les échantillons dans une zone tampon de malate à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour un traitement ultérieur.

Pour commencer l’immunohistochimie, les régions fixes de CA one sont d’abord enrobées de résine déshydratée et coupées pour obtenir des sections ultra-minces de 60 nanomètres sur des grilles de nickel comme décrit dans le protocole textuel de cette vidéo. Ensuite, placez une goutte de tampon phosphate 1 % entre 20 à pH 7,5 sur un morceau de paraform propre. Ensuite, prenez doucement la grille avec une pince propre et faites-la flotter sur le tampon avec la section vers le bas, incubez ainsi pendant 10 minutes à température ambiante après l’incubation, égouttez l’excès de liquide de la grille en plaçant la section vers le haut sur du papier filtre.

De plus, retirez toute solution coincée entre les bras de la pince EM en évacuant doucement l’humidité avec un ruban de papier filtre tout en veillant à ce que les sections ne se dessèchent pas complètement. Placez ensuite une goutte de glycine de 50 millimolaires sur le film para et faites flotter la section de la grille côté vers le bas sur la solution de glycine à température ambiante. Pendant que l’échantillon incube pendant 15 minutes, ajoutez 2,5 % de sérum de l’animal de l’anticorps secondaire à une solution de BSA à 2,5 % et placez une goutte de ce mélange sur le film para

Après l’incubation de 15 minutes, séchez la grille avec du papier filtre et faites flotter sur la solution de blocage pendant 30 minutes. À température ambiante, préparez la chambre d’incubation en plaçant des lingettes Kim enroulées à l’intérieur d’une boîte de Pétri en plastique propre. Placez un morceau de param propre au centre de la boîte de Pétri, puis ajoutez de l’eau filtrée aux lingettes Kim.

Ensuite, placez une goutte de la solution d’anticorps primaire sur le paraforme et faites flotter l’échantillon dessus à température ambiante ou pendant la nuit. À quatre degrés Celsius, le moment et la température optimaux d’incubation ainsi que la concentration d’anticorps doivent être déterminés expérimentalement. Après l’incubation avec l’anticorps primaire, laver la grille trois fois pendant deux minutes chacune avec un tampon phosphate de 1 % entre 20 %. Ensuite, incuber avec un anticorps secondaire en utilisant un à 20 anti lapin ou anti-US, couplé à 10 nanomètres d’or après une heure.

À température ambiante, laver trois fois pendant deux minutes chacune avec 1 % de tampon phosphate entre 20 %. Ensuite, postfixez l’échantillon dans du glutaraldéhyde tamponné à 2 % pendant cinq minutes. Éliminez l’excès d’aldéhyde gluaire en rinçant trois fois avec 1 % de tampon de phosphate d’entrejama, 20 %, puis trois fois avec un rinçage à l’eau filtrée pendant deux minutes à chaque fois.

Une fois rincé, incubez la grille dans de l’acétate d’urinoir à 2 % pendant 10 minutes. Pendant l’incubation, préparez une chambre sans CO2 en plaçant un morceau de paraform au centre d’une boîte de Pétri en verre. Placez ensuite 10 à 15 pastilles d’hydroxyde de sodium dans le plat autour de la paraforme pour absorber le CO2 de l’air.

Gardez le haut fermé pendant quelques minutes. Ensuite, utilisez une pipette de pâturage et transférez rapidement un petit volume de solution de citrate de plomb Reynolds fraîchement préparée dans le paraforme. Ouvrez le haut juste assez pour insérer la pipette de pâturage afin de minimiser la réintroduction de CO2 dans la chambre.

Dans trois petits béchers, préparez de l’eau déminéralisée chaude fraîchement bouillie, lavez l’acétate d’urinoir en trempant la grille dans le premier bec et faites-la tourner doucement pendant 30 secondes. Répétez cette étape dans les deux autres béchers. Une fois rincé, ouvrez le haut de la boîte de Pétri en verre juste assez pour placer la grille sur la goutte de solution de citrate de plomb Reynolds.

Si possible, portez un masque pendant cette opération pour éviter de respirer sur le citrate de plomb et pour éviter la formation d’un précipité. Au bout de 10 minutes, ouvrez légèrement le haut et retirez la grille. Lavez-le trois fois en le trempant séquentiellement dans trois gobelets frais d’eau distillée tiède.

Laissez ensuite sécher la grille sur un morceau de papier filtre, section vers le haut. L’échantillon est maintenant prêt à être visualisé au microscope électronique : des coupes de tissu ultra-minces de la région environ une de l’hippocampe, montrée ici sous forme de micrographie électronique à transmission, contiennent des dendrites et des épines facilement distinguables de neurones paramétalliques. L’identification des synapses asymétriques entre la terminaison axonale désignée par un T et les épines dendritiques désignées par un S est facilitée par la présence d’une densité post-synaptique et d’une membrane plasmique bien définie.

La distribution de la neuro Grandin dans les épines dendritiques peut être observée à l’aide du marquage EM ImmunoGold et est accentuée dans ces images TEM par les flèches. La distance radiale de Neuro Grandin entre le centre de la colonne vertébrale et la membrane plasmique de la colonne vertébrale peut être mesurée comme la distance radiale normalisée. Une distance de zéro correspond à une particule posée sur la membrane, et une valeur de distance de un représente une particule au centre de la colonne vertébrale.

La distance entre le neurograndin et l’épine dendritique peut alors être représentée graphiquement. Ici, sa distribution sous forme de distance radiale normalisée est indiquée en bleu, et par rapport à une distribution aléatoire indiquée en rose, ce graphique montre que le neuro Grandin est situé près de la membrane plasmique. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs qui étudient le système nerveux pour explorer la localisation et la distribution des récepteurs, des protéines interagissant avec les récepteurs, des transporteurs et des canaux ioniques, et bien d’autres dans différents tissus cérébraux, notamment le cortex, le thalamus, le bulbe olfactif et le cervelet.

N’oubliez pas que travailler avec des fixateurs peut être extrêmement dangereux et que les précautions telles que le port de gants et d’une blouse de laboratoire et la manipulation des fixateurs dans la cagoule de film doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.