Name: Étiquetage immunologique post-enrobage des protéines synaptiques dans lhippocampe cultures Slice (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 50 s
Description: Apprenez le marquage ImmunoGold pour localiser les protéines synaptiques dans les neurones pyramidaux de l'hippocampe du rat. Cette méthode combine microscopie électronique et immunohistochimie pour préserver l'intégrité structurale et l'antigénicité des tissus du système nerveux central.

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Les auteurs tiennent à remercier Matthew Florence pour la préparation des cultures de tranches d&#39;hippocampe. Ce travail a été soutenu par des subventions de l&#39;Institut national américain sur le vieillissement et l&#39;Association Alzheimer NZG.

1. Fixation Fixateurs sont cancérigènes, porter des gants et manipuler les fixateurs dans une hotte. Sauf indication contraire, toutes les incubations sont effectuées sur la glace et toutes les solutions doivent être filtrés avant utilisation. Utilisez la microscopie électronique réactifs de qualité. Jour 1 <ol><li class="jove_content"> Après conditions expérimentales (par exemple, injection virale, le traitement médicamenteux), placez la membrane avec organotypiques coupes d&#39;hippocampe dans un 60 x 15 mm boîte de Petri en polystyrène contenant glacée phosphate 0,1 M de tampon (tampon phosphate de Sorensen), pH 7,3. Ajouter 1 à 2 ml de tampon phosphate 0,1 M directement sur le dessus des tranches de les garder au froid. </li></ol> ÉTAPE CRITIQUE: Utilisez toujours fraîchement préparés tampons et fixateurs. Assurez-vous que le pH du tampon est dans la plage souhaitée. A défaut de le faire pourrait endommager les structures cellulaires. <ol start="2"><li> Pour isoler le sous-champ CA1 de la tranche, utilisez unscalpel jetable en douceur couper à travers la tranche suivante à la DG, parallèlement à la couche CA1 cellule (figure 1). Ensuite, couper la tranche restante à la verticale pour enlever le sous-champ CA3 et le subiculum. Couper un coin de la tranche d&#39;aider à identifier la surface supérieure du tissu. </li></ol> REMARQUE: En cas pas de livraison virale de la protéine d&#39;intérêt est nécessaire, la tranche de tissu ensemble peut être fixé après que les médias est enlevée avec un rinçage délicat de tampon glacé. Cette étape est suivie par découpage de la CA1. ÉTAPE CRITIQUE: Gardez la trace de la face supérieure du tissu afin de sectionnement adéquate des grilles plus tard. <ol start="3"><li> Enlever soigneusement le tissu de la membrane à l&#39;aide de la face arrière du scalpel. Utiliser une pipette Pasteur en douceur transférer le tissu sur une plaque à 12 puits contenant 0,1 M de tampon phosphate. </li><li> Retirer le tampon dans le puits de la plaque et ajouter 500 m etu, L - 1 ml de fixatif glacé (pH 7,3) constituées des éléments suivants: 0,1% d&#39;acide picrique, du paraformaldéhyde à 1%, et 2,5% de glutaraldéhyde dans un tampon phosphate 0,1 M. Incuber pendant 2 heures à 4 ° C. </li></ol> REMARQUE: L&#39;acide picrique peut être explosif à l&#39;état sec. Gardez-le mouillé avec de l&#39;eau dans un récipient hermétiquement fermé. Conserver dans un endroit sec et bien aéré. <ol start="5"><li> Retirer le fixateur du puits et laver les échantillons 3 fois (20 min chacun) dans 0,1 M de tampon phosphate. </li><li> Incuber pendant 40 min dans de l&#39;acide tannique à 1% (p / v) dans 0,1 M de tampon maléate pH 6,0. </li><li> Rincer deux fois (20 min chacun) dans un tampon maléate. </li><li> Incuber pendant 40 min dans de l&#39;acétate d&#39;uranyle 1% (p / v) dans du tampon maléate dans l&#39;obscurité. L&#39;acétate d&#39;uranyle est sensible à la lumière et est radioactif. Couvrir le bécher avec du Parafilm lors de la dissolution et de stocker n&#39;importe quel tampon utilisé dans l&#39;obscurité à 4 ° C. </li><li> Rincer deux fois (20 min chacun) dans un tampon maléate. </li><li> Incuber pendant 20 min dans du chlore de platine de 0,5%IDE (p / v) dans du tampon maléate. </li><li> Rincer deux fois (20 min chacun) dans un tampon maléate. Conserver les échantillons à 4 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient prêts pour un traitement ultérieur. </li></ol> 2. La déshydratation et la Embedding L&#39;oxyde de propylène est cancérigène. Éviter les vapeurs en travaillant avec lui dans une hotte. Utilisez absolue, l&#39;éthanol pur à 100% qui ne contient aucune trace d&#39;eau. Diluer cette éthanol absolu pour produire des concentrations différentes de déshydratation. Jour 2 <ol><li> Incuber pendant 5 min dans de l&#39;éthanol 50% puis pendant 5 min dans de l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Incuber pendant 15 min à 1% fraîchement préparée p-phénylènediamine (PPD) dans l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Rincer trois fois dans de l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Incuber pendant 5 min dans de l&#39;éthanol 80% puis pendant 5 min dans de l&#39;éthanol à 95%. </li><li> Incuber dans l&#39;éthanol à 100% deux fois 5 min à chaque fois. </li><li> Préparer des flacons en verre avec bouchon à vis et assurez-vous qu&#39;ils sont propres et sèches. Transfert tranches de flacons en verre etétiqueter chaque flacon simple et claire. </li><li> Incuber pendant 5 min dans un mélange 1:1 éthanol: l&#39;oxyde de propylène. </li><li> Incuber dans l&#39;oxyde de propylène à 100% deux fois 5 min à chaque fois. </li><li> Ajouter de la résine (Epon) dans chaque flacon pour faire un mélange 1:1 avec de l&#39;oxyde de propylène. Mélanger doucement pendant 2 heures. Ne pas secouer les flacons avec trop de rigueur pour éviter les bulles qui pourraient interférer avec encastrement. </li><li> Ajouter de la résine pour faire un mélange 3:1 avec l&#39;oxyde de propylène, et mélanger pendant 2 heures. </li><li> Transfert à la résine 100% et incuber O / N. </li></ol> Jour 3 <ol start="12"><li> Échantillons en sandwich entre des bandes de plastique ACLAR et la guérison de 24 heures à 60 ° C. </li></ol> 3. La coupe et de montage sur les grilles Jour 4 <ol><li> Couper semi-fines (0,5 um) sections et colorer avec 1% de bleu de toluidine + 1% de borax pour déterminer l&#39;orientation correcte des échantillons. </li><li> Couper coupes ultrafines (60 nm) et monter sur des grilles de nickel, une section par grille. </li></ol>4. Immunohistochimie Tous les tampons et l&#39;eau doit être filtrée avant utilisation. Jour 5 <ol><li> Déposer une goutte (~ 50 pi) de tampon Tween-20/phosphate 1% (T / PB), pH 7,5, sur un morceau de parafilm propre sur une surface plane. Délicatement ramasser la grille avec des pinces propres par le bord et le faire flotter sur le tampon, la section vers le bas, et incuber pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Égoutter l&#39;excès de liquide de la grille en plaçant côté de la partie sur un papier filtre puis flotter sur la glycine 50 mM dans T / PB pendant 15 min à température ambiante. </li></ol> ÉTAPE CRITIQUE: Pour éviter de trop «report» de solutions d&#39;une gouttelette de solution à l&#39;autre au cours des incubations, les égoutter l&#39;excès de liquide par un léger toucher le bord de la grille n ° 1 sur du papier filtre entre chaque changement de solution. Également éliminer toute solution emprisonnée entre les branches de l&#39;EM Pince de maintien de la grille par effet de mèche doucement avec un ruban de papier-filtre entre les branches de pince tout en ENSUsonner les sections ne se dessèchent pas complètement. <ol start="3"><li> Séchez la grille avec du papier filtre, puis flotter sur une solution de blocage contenant de la BSA 2,5% et 2,5% de sérum de l&#39;animal de l&#39;anticorps secondaire dans T / PB pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Incuber avec l&#39;anticorps primaire (en T / PB) à la température ambiante ou O / N à 4 ° C. Le temps optimal et la température d&#39;incubation, ainsi que la concentration d&#39;anticorps, doivent être déterminées expérimentalement. </li><li> Laver la grille à trois reprises (2 min chacun) avec T / PB. </li><li> Incuber avec l&#39;anticorps secondaire (1:20 anti-lapin ou anti-souris couplé à 10 nm d&#39;or) pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Laver trois fois (2 min chacun) avec T / PB. </li><li> Postfix avec le glutaraldéhyde à 2% en T / PB pendant 5 min. </li><li> Laver trois fois (2 min chacun) avec T / PB et ensuite trois fois (2 min chacun) avec de l&#39;eau filtrée. </li><li> Incuber avec de l&#39;acétate d&#39;uranyle 2% dans de l&#39;eau pendant 10 min. </li></ol> Alors que la grille est la coloration, préparer une émission de CO 2 par chambre Placinpar pièce de Parafilm au centre d&#39;un plat en verre de Pétri. Puis placer 4-6 pastilles de NaOH dans le plat autour du Parafilm à absorber le CO 2 dans l&#39;air. Gardez le couvercle fermé pendant quelques minutes. Utiliser une pipette Pasteur et de transférer rapidement un petit volume de solution de citrate de plomb de Reynolds à l&#39;Parafilm dans le plat en verre de Pétri. Ouvrez le haut juste assez pour insérer la pipette Pasteur afin de minimiser la réintroduction de CO 2 dans la chambre. REMARQUE: Pour faire une solution de Reynolds citrate de plomb, faire bouillir 100 ml d&#39;eau déminéralisée dans un four à micro-ondes et laisser refroidir dans un récipient hermétique. Dans un ballon volumétrique de 50 ml avec bouchon, mélange de nitrate de plomb 1,33 g, 1,76 g de citrate de sodium et 30 ml de l&#39;eau bouillie en agitant vigoureusement pendant 1 min. Puis serrer de façon intermittente pendant 30 min. A cette solution trouble, ajouter 8 ml d&#39;hydroxyde de sodium 1 M et lentement inverser le flacon plusieurs fois. Solution deviendra clair. Porter la solution à 50 ml avec le wa bouillieter. Conserver la solution hermétiquement fermés. Si un précipité apparaît, le jeter et en faire une nouvelle. <ol start="11"><li> Dans trois béchers petits préparer de l&#39;eau chaude bouillante désionisée. Laver l&#39;acétate d&#39;uranyle par trempage de la grille dans le premier bécher et doucement tourbillonner autour pendant 30 sec. Répétez cette étape pour les deux autres béchers. </li><li> Ouvrez la partie supérieure de la boîte de Petri en verre juste assez pour placer la grille sur la goutte de solution de Reynolds citrate de plomb. Si possible, portez un masque tout en faisant ceci pour éviter de respirer le citrate de plomb et d&#39;empêcher la formation d&#39;un précipité. Incuber pendant 10 min. </li><li> Ouvrez le haut juste assez pour retirer la grille. Éviter de respirer sur le citrate de plomb. Laver la grille à trois reprises en le plongeant successivement dans trois béchers avec de l&#39;eau chaude distillée fraîchement bouillie. Laissez sécher la grille sur un morceau de papier filtre, section vers le haut. L&#39;échantillon est maintenant prêt pour le microscope électronique. </li></ol>

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<li>Kehle, T., Herzog, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+protein-gold+complexes+and+cell+surfaces%3A+a+method+for+precise+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions between protein-gold complexes and cell surfaces: a method for precise quantitation.</a> Eur. J. Cell Biol. 45, 80-87 (1987).</li>
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</ol>

Nous n&#39;avons rien à déclarer.

Dans ce protocole, nous avons adopté la méthode Phend et Weinberg pour le cerveau et les tissus de la moelle épinière pour étudier épines dendritiques dans les cultures rat tranche d&#39;hippocampe. Épines dendritiques dans l&#39;hippocampe CA3-CA1 région sont délicates structures contenant une grande variété de protéines qui jouent un rôle important dans la régulation des fonctions neuronales. La méthode présentée permet une approche équilibrée pour atteindre antigénicité accrue tout en conservant une bonne préservatio...

<table><tbody><tr><td>60 x 15 mm polystyrène boîte de Pétri</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel jetable</td><td>EXELINT</td><td>29552</td><td></td></tr><tr><td>Inserts de culture cellulaire</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>10 nm Chèvre-anti-lapin or</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>25108</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-Neurogranine</td><td>Millipore</td><td>AB5620</td><td></td></tr><tr><td>100 % Acide picrique</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>19550</td><td></td></tr><tr><td>96 % Paraformaldéhyde</td><td>Acros Organics</td><td>AC41678-0030</td><td></td></tr><tr><td>25 % Glutaraldéhyde (grade EM)</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’uranyle</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>p-Phénylènediamine</td><td>Sigma</td><td>P6001</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td> <td>de platine (IV)Sigma</td><td>379840</td><td></td></tr><tr><td>Microscopie électronique à acide</td><td>tannique</td> Sciences <td>21710</td><td></td></tr></tbody></table>

Étiquetage immunologique post-enrobage des protéines synaptiques dans l&#39;hippocampe cultures slice

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoélectromicroscopie est un outil puissant pour étudier les molécules biologiques au niveau subcellulaire. Anticorps couplés à des marqueurs denses aux électrons tels que l&#39;or colloïdal peut révéler la localisation et la distribution des antigènes spécifiques dans différents tissus 1. Les deux techniques les plus utilisées sont des techniques de pré-enrobage et de post-intégration. En pré-enrobage immuno-microscopie électronique (EM) techniques, le tissu doit être perméabilisées pour permettre la pénétration d&#39;anticorps avant d&#39;être embarqué. Ces techniques sont idéales pour la préservation des structures, mais la faible pénétration de l&#39;anticorps (souvent, seuls les quelques premiers micromètres) est un inconvénient considérable 2. Les méthodes de marquage post-enrobage peut éviter ce problème, parce que l&#39;étiquetage se fait sur des coupes de tissus fixes où les antigènes sont plus facilement accessibles. Au fil des ans, un certain nombre de modifications ont permis d&#39;améliorer les méthodes de post-enrobage à améliorer l&#39;immunoréactivité et de préserver l&#39;ultrastructure <sup&gt; 3-5. La fixation des tissus est un élément essentiel des études EM. Fixateurs chimiquement réticuler les macromolécules pour verrouiller les structures tissulaires en place. Le choix du fixateur affecte non seulement la préservation mais aussi structurelle antigénicité et le contraste. Tétroxyde d&#39;osmium (OsO 4), le formaldéhyde et le glutaraldéhyde ont été les fixateurs standards depuis des décennies, y compris pour le système nerveux central (SNC) des tissus qui sont particulièrement exposés à des dommages structurels au cours de traitement chimique et physique. Malheureusement, OsO 4 est très réactif et a été montré pour masquer les antigènes 6, résultant en mauvais étiquetage et insuffisante. Des approches alternatives pour éviter la fixation chimique comprennent le gel des tissus. Mais ces techniques sont difficiles à réaliser et nécessitent des instruments coûteux. Pour résoudre certains de ces problèmes et d&#39;améliorer l&#39;étiquetage des tissus du système nerveux central, Phend et al. remplacé OsO 4 avec de l&#39;acétate d&#39;uranyle (UA) et tannique acid (TA), et introduit avec succès des modifications supplémentaires pour améliorer la sensibilité de détection de l&#39;antigène et de préservation de structure dans le cerveau et les tissus de la moelle épinière 7. Nous avons adopté cette osmium sans post-intégration méthode aux tissus du cerveau de rat et d&#39;optimiser la technique de marquage immunologique pour détecter et étudier les protéines synaptiques. Nous présentons ici une méthode pour déterminer la localisation ultrastructurale des protéines synaptiques dans l&#39;hippocampe de rat neurones pyramidaux CA1. Nous utilisons organotypiques d&#39;hippocampe en culture tranches. Ces tranches de maintenir le circuit trisynaptic de l&#39;hippocampe, et sont donc particulièrement utiles pour l&#39;étude de la plasticité synaptique, un mécanisme largement considéré comme sous-tendent l&#39;apprentissage et la mémoire. Organotypiques de coupes d&#39;hippocampe postnatales jour 5 et 6 souris / rat chiots peuvent être préparés comme décrit précédemment 8, et sont particulièrement utiles pour effet de choc aiguë ou surexpriment les protéines exogènes. Nous avons déjà utilisé ce protocole pour characterize neurogranine (Ng), une protéine spécifique des neurones avec un rôle critique dans la régulation de la fonction synaptique 8,9. Nous avons aussi utilisé pour caractériser la localisation ultrastructurale de la calmoduline (CaM) et Ca 2 + / CaM-dépendante protéine kinase II (CaMKII) 10. Comme le montrent les résultats, ce protocole permet une bonne préservation ultrastructurale des épines dendritiques et d&#39;étiquetage efficace de Ng pour aider à caractériser sa distribution dans la colonne 8. En outre, la procédure décrite ici peut avoir une large applicabilité dans l&#39;étude de nombreuses autres protéines impliquées dans les fonctions neuronales.

La figure 2B représente un exemple de la distribution des molécules endogènes Ng à épines dendritiques des neurones pyramidaux CA1 hippocampique. Grilles de nickel avec ultrafines (60 nm) tissus contenant la région CA1 de l&#39;hippocampe (comme on le voit sur ​​la figure 2A) étaient couverts de 1% T / PB, 50 mM de glycine, puis bloquées avec de la BSA 2,5% et 2,5% de sérum avant l&#39;incubation avec des anticorps anti Ng-anticorps. Après lavage avec T / PB, les grilles ont ensuite été...

La localisation et la distribution des protéines fournissent des informations importantes pour la compréhension de leurs fonctions cellulaires. La résolution spatiale supérieure de la microscopie électronique (EM) peut être utilisé pour déterminer la localisation subcellulaire d&#39;un antigène donné à la suite immunohistochimie. Pour les tissus du système nerveux central (SNC), la préservation de l&#39;intégrité structurelle tout en maintenant antigénicité a été particulièrement difficile en EM études. Ici, nous adoptons une procédure qui a été utilisée pour préserver les structures et les antigènes du système nerveux central d&#39;étudier et de caractériser les protéines synaptiques dans l&#39;hippocampe de rat neurones pyramidaux CA1.

Étiquetage immunologique post-enrobage des protéines synaptiques dans l&#39;hippocampe cultures Slice

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

L'objectif général de cette procédure est d'effectuer un marquage ImmunoGold afin de déterminer la localisation ultrastructurale des protéines synaptiques dans les neurones paramédians CA1 de l'hippocampe de rat. Cette opération s'effectue tout d'abord en retirant la région CA1 de la tranche organotypique, en coupant le coin supérieur afin de conserver l'orientation correcte, puis en l'incubant dans un fixateur sans osmium sur de la glace. La deuxième étape consiste à déshydrater le tissu fixé et à le faire durcir par infiltration avec de la résine.Ensuite, des coupes ultraminces sont réalisées à partir de tissus inclus dans de la résine, puis déposées sur des grilles en nickel. La dernière étape consiste à réaliser une immunohistochimie sur les tissus en coupe. Enfin, la microscopie électronique immunocytochimique est utilisée pour déterminer la localisation des protéines dans la synapse. D'accord.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la plasticité synaptique, notamment comment la localisation des protéines au sein des épines dendritiques permet de comprendre leur rôle dans la fonction synaptique. Bien que cette méthode soit optimisée pour des tranches hippocampiques organotypiques, elle peut également s'avérer extrêmement utile pour d'autres préparations neuronales, notamment des tranches cérébrales aiguës et des cultures primaires de neurones. Commencez cette procédure en plaçant la tranche hippocampique organotypique dans une boîte de Petri en polystyrène contenant un tampon phosphate de Sorensen frais, froid glacial.Ajoutez un à deux millilitres supplémentaires de tampon glacé directement au-dessus des tranches. Afin d'isoler le sous-champ CA1 de la tranche, utilisez un scalpel jetable pour effectuer une incision douce parallèlement à la couche cellulaire de CA1, à côté du gyrus denté. Ensuite, coupez verticalement la tranche restante afin d'extraire le sous-champ CA3 et le sulu.Ensuite, découpez un coin du CA d'une tranche afin d'identifier la surface supérieure du tissu, puis retirez délicatement le tissu de la membrane à l'aide de l'envers du scalpel. Transférez doucement le tissu dans une plaque de 12 puits contenant du tampon de Sorensen glacé. Éliminez le tampon et ajoutez de 0,5 à 1 millilitre de fixateur glacé, à pH 7,3, dilué dans le tampon de Sorensen, de sorte qu'il recouvre correctement l'échantillon.Puis incuber pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Après l'incubation, retirer le fixateur du puits et laver les échantillons trois fois pendant 20 minutes dans du tampon Sorensen glacé. Ensuite, incuber l'échantillon dans de l'acide tanique à 1 % poids par volume dans un tampon malate 0,1 molaire à un pH de 6,0.Après 40 minutes, rincez l'acide tannique en lavant l'échantillon deux fois pendant 20 minutes dans le tampon malate. Ensuite, incubez l'échantillon pendant 40 minutes dans 1 % d'acétate d'urane dans le tampon malate. L'acétate d'urane est sensible à la lumière et radioactif. Manipulez-le donc avec précaution et placez l'échantillon à l'obscurité à quatre degrés Celsius pendant l'incubation.Après l'incubation, rincer les échantillons deux fois pendant 20 minutes chacun dans du tampon malate glacé, puis les incuber pendant 20 minutes dans du chlorure de platine à 0,5 % dans du tampon inmate. Enfin, éliminer tout résidu de chlorure de platine par deux lavages de 20 minutes. Conserver chaque tampon inmate et les échantillons dans du tampon malate à quatre degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils soient prêts pour un traitement ultérieur.Pour commencer l'immunohistochimie, les régions CA1 fixées sont d'abord déshydratées, incluses dans une résine et coupées afin d'obtenir des sections ultrafines de 60 nanomètres sur des grilles en nickel, comme décrit dans le protocole écrit de cette vidéo. Ensuite, déposez une goutte de tampon phosphate contenant 1 % de Tween 20 à pH 7,5 sur un morceau de parafilm propre. Puis, prélevez délicatement la grille à l’aide de pinces propres et faites-la flotter sur le tampon, la section tournée vers le bas. Incubez ainsi pendant 10 minutes à température ambiante. Après l’incubation, retirez le liquide excédentaire en plaçant la grille, côté section vers le haut, sur du papier filtre.En outre, éliminer délicatement toute solution piégée entre les branches de la pince électromagnétique en utilisant un fin morceau de papier filtre, tout en veillant à ce que les sections ne s’assèchent pas complètement. Ensuite, déposer une goutte de glycine à 50 millimolaire sur du film parafilm et placer la grille, côté section vers le bas, à la surface de la solution de glycine à température ambiante. Pendant que l’échantillon incube pendant 15 minutes, ajouter 2,5 % de sérum provenant de l’animal de l’anticorps secondaire à une solution à 2,5 % de BSA, puis placer une goutte de ce mélange sur le film parafilm.Après l'incubation de 15 minutes, séchez la grille avec du papier filtre et placez-la à la surface de la solution de blocage pendant 30 minutes. À température ambiante, préparez la chambre d'incubation en disposant des feuilles Kim roulées le long de la paroi intérieure d'une boîte de Pétri en plastique propre. Placez un morceau de parafilm propre au centre de la boîte de Pétri, puis ajoutez de l'eau filtrée sur les feuilles Kim.Ensuite, déposez une goutte de la solution d'anticorps primaire sur le paraforme et laissez flotter l'échantillon dessus à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. La durée et la température d'incubation optimales, ainsi que la concentration en anticorps, doivent être déterminées expérimentalement. Après l'incubation avec l'anticorps primaire, lavez la grille trois fois pendant deux minutes chacune avec du tampon phosphate contenant 1 % de Tween 20. Incubez ensuite avec l'anticorps secondaire en utilisant un anticorps anti-lapin ou anti-US dilué entre 1 et 20, couplé à de l'or de 10 nanomètres, pendant une heure.À température ambiante, effectuez trois lavages de deux minutes chacun avec du tampon phosphate contenant 1 % de Tween 20. Ensuite, post-fixez l'échantillon dans du glutaraldéhyde tamponné à 2 % pendant cinq minutes. Éliminez l'excès de glutaraldéhyde par trois rinçages avec du tampon phosphate contenant 1 % de Tween 20, puis par trois rinçages supplémentaires avec de l'eau filtrée, chacun durant deux minutes.Une fois rincée, incuber la grille dans de l'acide urique à 2 % pendant 10 minutes. Pendant l'incubation, préparer une chambre exempte de CO₂ en plaçant un morceau de paraforme au centre d'une boîte de Pétri en verre. Puis disposer 10 à 15 pastilles d'hydroxyde de sodium dans la boîte autour du paraforme afin d'absorber le CO₂ présent dans l'air.Gardez le couvercle fermé pendant quelques minutes. Ensuite, utilisez une pipette Pasteur pour transférer rapidement un petit volume de solution fraîchement préparée de citrate de plomb de Reynolds dans le paraforme. Ouvrez le couvercle juste assez pour insérer la pipette Pasteur afin de minimiser la réintroduction de CO2 dans la chambre.Dans trois petits béchers, préparez de l’eau déionisée tiède fraîchement bouillie afin de rincer l’acétate uranyle en plongeant la grille dans le premier bécher et en l’agitant doucement pendant 30 secondes. Répétez cette étape dans les deux autres béchers. Une fois rincée, ouvrez légèrement le couvercle de la boîte de Petri en verre juste assez pour placer la grille sur la goutte de solution de citrate de plomb de Reynolds.Si possible, portez un masque pendant cette manipulation afin d'éviter d'expirer sur le citrate de plomb et de prévenir la formation d'un précipité. Après 10 minutes, ouvrez légèrement le couvercle et retirez la grille. Rincez-la trois fois en la trempant successivement dans trois béchers frais d'eau distillée tiède.Ensuite, laissez sécher la grille sur un morceau de papier filtre. L'échantillon est maintenant prêt à être observé au microscope électronique. Des coupes ultrafines de tissu de la région CA1 de l'hippocampe, présentées ici sous forme de micrographie en transmission, contiennent des dendrites et des épines facilement identifiables de neurones paramédiaux. L'identification des synapses asymétriques entre les terminaisons axonales désignées par un T et les épines dendritiques désignées par un S est facilitée par la présence d'une densité post-synaptique et d'une membrane plasmique bien définie.La répartition de la neurograndin dans les épines dendritiques peut être observée à l’aide du marquage ImmunoGold en microscopie électronique, et est mise en évidence dans ces images de TEM par les flèches. La distance radiale de la neurograndin, depuis le centre de l’épine jusqu’à la membrane plasmique de l’épine, peut être mesurée sous forme de distance radiale normalisée. Une distance égale à zéro correspond à une particule située sur la membrane, tandis qu’une valeur de distance égale à un représente une particule située au centre de l’épine. La distance entre neuro Grandin et l'épine dendritique peut ensuite être représentée graphiquement. Ici, sa distribution en tant que distance radiale normalisée est indiquée en bleu, et comparée à une distribution aléatoire indiquée en rose ; ce graphique montre que neuro Grandin se situe près de la membrane plasmique. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs qui étudient le système nerveux pour explorer la localisation et la répartition des récepteurs, des protéines interagissant avec les récepteurs, des transporteurs et des canaux ioniques, ainsi que de nombreux autres éléments dans différents tissus cérébraux, notamment le cortex, le thalamus, le bulbe olfactif et le cervelet.N'oubliez pas que le travail avec des fixateurs peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de gants et d'une blouse de laboratoire, ainsi que la manipulation des fixateurs sous hotte chimique, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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