Visualisation des variations du cycle cellulaire et détermination de nucléation dans postnatales cardiomyocytes

L’objectif global de cette procédure est de visualiser l’activité du cycle cellulaire dans les cardiomyocytes postnatals et de déterminer leur nucléarité. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la régénération cardiaque, telles que : un cardiomyocyte se divise-t-il vraiment ou augmente-t-il simplement sa ploïdie ou devient-il multinucléé ? Les principaux avantages de cette technique sont que la phase M du cycle cellulaire peut être visualisée en haute résolution spatio-temporelle et que les noyaux de cardiomyocytes peuvent être identifiés par fluorescence.

Patricia Freitag, technicienne de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Si vous utilisez des couples reproducteurs non homozygotes, identifiez d’abord les cœurs transgéniques par microscopie fluorescente pour vérifier leur expression d’analine EGFP et de H2B-mCherry. Les signaux nucléaires de l’analyine EGFP peuvent être plus facilement détectés sur les bords des oreillettes en se concentrant à travers ses couches tissulaires.

Pour isoler les cardiomyocytes, placez le nombre approprié de cœurs dans des tubes de réaction de 1,5 millilitre contenant un millilitre de mélange d’enzymes provenant d’un kit de dissociation cardiaque néonatale et coupez les cœurs en petits morceaux avec des ciseaux. Ensuite, transférez la solution dans des tubes de réaction de 15 millilitres. Placez le tube dans une position presque horizontale à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes, en mélangeant le tissu cinq à 10 fois avec une pipette de cinq millilitres à la fin de l’incubation.

À la fin de la troisième digestion, arrêtez la réaction avec 7,5 millilitres de milieu deux et filtrez la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 70 microns. Rincez la crépine cellulaire avec trois millilitres de milieu deux, en regroupant le lavage avec les cellules collectées et collectez les cellules par centrifugation. Remettez le granulé en suspension dans 500 microlitres de moyen pour le comptage.

Ensuite, ensemencez une fois dix à quatre cellules par puits dans 120 microlitres de milieu un dans une plaque à fond plat de 96 puits et centrifugez les cellules avant leur culture pendant la nuit dans un incubateur de culture cellulaire. Le lendemain, la plupart des cardiomyocytes devraient battre. Avant de commencer la transfection, essuyez le banc et tous les matériaux de transfection avec une solution de décontamination à l’ARNase pour éliminer toute ARNase.

Lorsque tout le matériel est prêt, ajoutez 20 microlitres de mélange d’ARNi fraîchement préparé dans chaque puits et retournez les cellules dans l’incubateur pendant 48 heures. Après deux jours, remplacez le surnageant dans chaque puits par 120 microlitres de milieu un et remettez les cellules dans l’incubateur pendant au moins 24 heures supplémentaires. À la fin de l’incubation, laver une fois les cellules avec du PBS, puis les fixer dans une solution de formaldéhyde à 4 % pendant 20 minutes.

Pour analyser les cellules par vidéomicroscopie confocale, transférez la plaque sur la platine du microscope confocal et démarrez le logiciel d’imagerie. Ouvrez les paramètres A1plus et cochez les cases des canaux un, deux, trois et quatre. Dans le menu déroulant, définissez le canal un sur DAPI, le canal deux sur eGFP, le canal trois sur RFP et le canal quatre sur Cy5.

Cliquez sur la tension du canal et utilisez les barres coulissantes pour régler la tension sur 80 pour chaque canal. Utilisez les barres coulissantes pour régler le décalage à zéro et cliquez sur le bouton d’accueil pour régler le sténopé sur la position d’origine. Définissez la taille de numérisation sur 1024 x 1024 pixels dans le menu déroulant.

Cliquez sur optimiser pour ouvrir la fenêtre de configuration de la taille XYZ et cochez la case de voxel parfaite sous l’étape Z suggérée.Sélectionnez l’objectif 20x et ajustez les intensités laser jusqu’à ce que l’image ne soit ni sous-exposée ni surexposée. Lorsque tous les paramètres ont été définis, ouvrez le menu d’acquisition. Sélectionnez Numériser une grande image, puis choisissez La position actuelle se trouve dans le coin supérieur gauche sous Zone.

Définissez ensuite le nombre de champs dans X et Y sur trois par trois, puis cliquez sur Analyser. Pour définir le nombre de noyaux de cardiomyocytes, cliquez sur mesurer, mesure manuelle et compter. Sélectionner les noyaux avec des signaux H2B-mCherry, ainsi les marquer et les compter.

Ensuite, sélectionnez les cellules alpha-actinine positives pour déterminer le nombre de cardiomyocytes. Pour compter les cardiomyocytes en phase G1, S et G2 avec des signaux analiens EGFP nucléaires, sélectionnez mesure, mesure manuelle et compte. Marquez les noyaux exprimant l’analine EGFP et H2B-mCherry en cliquant et comptez manuellement les cardiomyocytes avec les signaux analines EGFP spécifiques à la mitose, tels que les anneaux contractiles et les corps médians.

Ensuite, cliquez sur mesurer, mesurer manuellement, compter et cliquer sur les cardiomyocytes avec des signaux analines EGFP spécifiques à la mitose, des signaux cytoplasmiques, des anneaux contractiles et des corps médians. Par rapport aux témoins négatifs, les cardiomyocytes transfectés par miARN et siARN démontrent une induction de l’activité du cycle cellulaire. Les cardiomyocytes qui effectuent une endoréduplication présentent une expression exclusivement nucléaire de l’analine EGFP, tandis que les cardiomyocytes subissant une division cellulaire présentent une expression de l’EGFP analine dans les localisations typiques de la phase M.

Après la digestion enzymatique du tissu cardiaque au niveau de l’appareil de Langendorff, les oreillettes et les ventricules peuvent être séparés mécaniquement et analysés indépendamment, ce qui permet de visualiser les cardiomyocytes ventriculaires transgéniques H2B-mCherry avec un nombre élevé de cardiomyocytes binucléés positifs pour H2B-mCherry. En revanche, la majorité des cardiomyocytes auriculaires sont mononucléés. La digestion enzymatique ne permet pas d’obtenir une population unicellulaire à 100 %, ce qui révèle un modèle de striation croisée par coloration à l’alpha-actinine, ce qui facilite davantage la discrimination entre les cardiomyocytes binucléés en tant que modèle continu de striation croisée et les doublets cellulaires.

Pour analyser l’indice de bi-nucléation des cardiomyocytes en tranches épaisses, il est nécessaire de faire défiler manuellement la pile car les noyaux ne se trouvent pas nécessairement dans un plan Z, avec une coloration des agglutinines de germe de blé permettant la détection de la cellule borders. 3D des reconstructions de tranches fixes de cœurs de souris transgéniques adultes permettent la détection et le comptage automatisé des crochets, colorés et H2B-mCherry positifs pour déterminer la proportion de noyaux de cardiomyocytes dans des conditions physiologiques au sein du tissu. Une fois maîtrisée, la dissociation cardiaque peut être réalisée en deux à trois heures si elle est effectuée correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de travailler continuellement pour maintenir la viabilité des cellules tout au long de l’expérience. À la suite de cette procédure, il est possible de cribler des microARN ou d’autres petites substances pour leurs effets induisant la prolifération dans les cardiomyocytes postnatals.