Name: Visualisation des variations du cycle cellulaire et détermination de nucléation dans postnatales cardiomyocytes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Apprenez à visualiser le cycle cellulaire des cardiomyocytes postnataux et à déterminer leur nucléarité à l'aide de souris transgéniques et de microscopie à fluorescence. Cette méthode permet d'étudier la régénération cardiaque.

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Nous remercions S. Grünberg (Bonn, Allemagne) et P. Freitag (Bonn, Allemagne) pour leur assistance technique.

<ol><li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science. 324 (5923), 98-102 (2009).</li>
<li>Raulf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+systems+for+unequivocal+identification+of+cardiac+myocyte+nuclei+and+analysis+of+cardiomyocyte+cell+cycle+status%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res.Cardiol%22%5BJournal%5D)">Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status.</a> Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33(2015).</li>
<li>Field, C. M., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anillin%2C+a+contractile+ring+protein+that+cycles+from+the+nucleus+to+the+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex.</a> J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).</li>
<li>Hesse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+cell+division+using+high-resolution+imaging+of+M-phase+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Commun%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle.</a> Nat.Commun. 3, 1076(2012).</li>
<li>Eulalio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+identifies+miRNAs+inducing+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration.</a> Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).</li>
<li>Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors+induces+cardiomyocyte+re-entry+in+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle.</a> J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).</li>
<li>Hosoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonality+of+mouse+and+human+cardiomyogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).</li>
<li>Soonpaa, M. H., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cardiomyocyte+DNA+synthesis+in+normal+and+injured+adult+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts.</a> Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).</li>
<li>Ang, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).</li>
<li>Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16889791">Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation.</a> J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).</li>
<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Cell+Generation+and+Turnover+in+the+Human+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart.</a> Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Il y a une controverse quant à savoir si cardiomyocytes sont en mesure de réintégrer le cycle cellulaire et de diviser après une blessure et pendant l&#39;homéostasie tissulaire. Les valeurs pour le chiffre d&#39; affaires de base de cardiomyocytes ont été donnés dans la plage comprise entre 1% 1 et 80% 7. De plus , après une lésion cardiaque, l&#39;induction de l&#39; activité du cycle cellulaire et la production de nouveaux cardiomyocytes ont été signalés dans la zone de...

L&#39;identification correcte des noyaux de cardiomyocytes et l&#39;état du cycle cellulaire est d&#39;une importance cruciale pour la détermination du chiffre d&#39;affaires du muscle cardiaque et de la régénération. Cela est particulièrement vrai pour l&#39;utilisation de marqueurs nucléaires, tels que pHH3, Ki-67, ou des analogues de la thymidine pour identifier l&#39;activité du cycle cellulaire. Comme la capacité proliférative des cardiomyocytes de mammifères adultes est très faible 1, une fausse identification d&#39;un noyau positif pour un marqueur d&#39;un noyau de cardiomyocytes de prolifération pourrait faire une différence cruciale dans l&#39;issue d&#39;un essai de prolifération. En outre, les cardiomyocytes sont sujettes à des variations du cycle cellulaire, tels que endoréduplication et la mitose acytokinetic qui conduisent à des cellules polyploïdes et multinucléées plutôt que dans la division cellulaire. À cette fin, l&#39;interprétation de la coloration des anticorps contre des marqueurs du cycle cellulaire communs ne sont pas concluantes dans tous les cas. Ici, nous présentons les méthodes pour la ligne droite-forwa<html> reconnaissance rd des cardiomyocytes de souris et de leur nucléarité dans des cellules isolées indigènes et des coupes de tissus épais aux stades postnataux et des adultes par l&#39;identification sans équivoque de leurs noyaux. À cette fin, une lignée de souris transgéniques avec une expression spécifique de cardiomyocytes d&#39;une protéine de fusion consistant en histone H2B humaine et mCherry sous le contrôle du promoteur Myh6 (Myh6-H2B-MCH) a été utilisé 2. Le croisement de cette ligne de souris avec une lignée de souris transgénique de l&#39;indicateur de la prolifération, dans laquelle l&#39;expression d&#39;une protéine de fusion eGFP anillin est sous le contrôle de l&#39;ubiquité promoteur d&#39;actine de poulet avec un activateur de CMV (ACG-eGFP anillin), permet la détermination de l&#39;état du cycle cellulaire. Anillin la protéine d&#39;échafaudage est spécifiquement exprimée dans le cycle cellulaire des cellules actives 3 et son différentiel localisation subcellulaire au cours du cycle cellulaire permet un suivi en temps réel, progression du cycle cellulaire avec une résolution élevée de la phase Mef &quot;&gt; 4. Par conséquent, les souris transgéniques doubles peuvent être utilisées pour établir une discrimination entre les cardiomyocytes qui prolifèrent et celles qui subissent des variations du cycle cellulaire. Cela montre particulièrement utile dans le criblage de substances induisant la prolifération in vitro.

<table><tbody><tr><td>Boîte de Pétri 10 cm</td><td>Sarstedt</td><td>821472</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro ; Crépine à cellules m</td><td>Becton Dickinson GmbH/Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Monxime de 2,3-butanedione (BDM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>G20x1 &frac12 ; canule d’injection, Sterican</td><td>Braun, Melsungen</td><td>4657519</td><td></td></tr> aiguille <tr><td>de calibre 20</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>301300</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 24 puits</td><td>Becton Dickinson GmbH/Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>2-Méthyl-butane</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3927.1</td><td></td></tr><tr><td>solution de formaldéhyde à 37 %</td><td>AppliChem GmbH&nbsp ;</td><td>A0936,1000</td><td></td></tr><tr><td>Robinet d’arrêt à 3 voies</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>16494C</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 50 mL</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>8728810F</td><td></td></tr><tr><td>70 % éthanol</td><td>Otto Fischar GmbH</td><td>27669</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire conjugué à Alexa-Fluor</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-605-205</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-Aktinin EA-53, souris IgG</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Microplaque de culture cellulaire, 96 puits, Demi-zone</td><td>Greiner bio-one</td><td>675986</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase B</td><td>Roche</td><td>11088815001</td><td></td></tr><tr><td>microscope confocal Eclipse Ti-E</td><td>Cryostat Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM 3050S</td> Sérum d’âne <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Jackson Immuno Research, Suffolk, GB</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>sérum de veau fœtal</td><td>PromoCell, Heidelberg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution de formaldéhyde (4 %)</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3697</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine de peau de porc, Type A</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>G2500</td><td></td></tr><tr><td>lamelles de verre</td><td>VWR</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Tube d’extension Heidelberger</td><td>IMPROMEDIFORM GmbH</td><td>MF 1833</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natrium</td><td>Ratiopharm</td><td>5394.02.00</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>HistoBond lames de microscope</td><td>Marienfeld</td><td>0810000</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (1&nbsp ; mg/mL)</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Seringue à insuline</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>300334</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s ModifiéDulbecco' s Medium (IMDM)</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstadt</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Corning</td><td>354221</td><td></td></tr><tr><td>Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti</td><td>Nikoninstruments, D&uuml ; </td><td></td><td></td>sseldorf</tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt</td><td>13778075</td><td></td></tr><tr><td>Souris IgG Cy5 (âne)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-175-151</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifugeuse tube</td><td>Sarstedt</td><td>72690</td><td></td></tr><tr><td>Mini shaker</td><td>VWR</td><td>12620-940</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA mimic, has-miR199a-3p</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4464066</td><td></td></tr><tr><td>Biopsie Moule</td><td>Sakura Finetek/ VWR</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>M-slide 8-well ibiTreat</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck Millipore</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>négatif control(ARN brouillé)</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>AM4611</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dissociation cardiaque néonatale</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach</td><td>130-098-373</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit</td><td>Nikoninstruments, D&uuml ; </td><td></td><td></td>sseldorf</tr><tr><td>Acides aminés non essentiels, NEAA</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstad</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM, Sérum réduit</td><td>Medium Gibco</td><td>51985-026</td><td></td></tr><tr><td>P21-siRNA</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4390771</td><td></td></tr><tr><td>P27-siRNA</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4390771</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstadt</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de montage à l’alcool polyvinylique avec DABCO&reg ;, anti-décoloration</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10981</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>1007885</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>récipients pour échantillons</td><td>Vitlab</td><td>80731</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique</td><td>Greiner</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>logiciel NIS Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek/ VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>ToPro3 iodure (642/661)</td><td>Moléculaire sondes/ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>Fluka</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>Agglutinine de germe de blé (WGA) Fluorescéine marquée Vector</td><td>Laboratories</td><td>VEC-FL-1021-5</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-alpha-actinine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-Mercaptoéthanol</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation des variations du cycle cellulaire et détermination de nucléation dans postnatales cardiomyocytes

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Les cardiomyocytes sont sujets à des variations du cycle cellulaire, telles que l’endoréduplication (cycles continus de synthèse de l’ADN sans caryokinésie ni cytokinèse) et la mitose acytocinétique (caryokinèse mais pas de cytokinèse). De telles variations atypiques du cycle cellulaire aboutissent à des cellules polyploïdes et multinucléées plutôt qu’à une division cellulaire. Par conséquent, pour déterminer le renouvellement et la régénération cardiaques, il est d’une importance cruciale d’identifier correctement les noyaux des cardiomyocytes, le nombre de noyaux par cellule et l’état de leur cycle cellulaire. Cela est particulièrement vrai pour l’utilisation de marqueurs nucléaires pour identifier l’activité du cycle cellulaire, tels que les analogues de la thymidine Ki-67, PCNA ou pHH3. Nous présentons ici des méthodes de reconnaissance des cardiomyocytes et de leur nucléarité et de détermination de l’activité de leur cycle cellulaire. Nous utilisons deux systèmes transgéniques publiés : la lignée de souris transgéniques Myh6-H2B-mCh, pour l’identification sans équivoque des noyaux de cardiomyocytes, et la lignée de souris CAG-eGFP-anilline, pour distinguer la division cellulaire des variations du cycle cellulaire. Combinés, ces deux systèmes facilitent l’étude de la régénération et de la plasticité cardiaques.

Afin d&#39;analyser les effets de siRNA / miARN sur l&#39;activité du cycle cellulaire de cardiomyocytes postnatales in vitro, les cardiomyocytes de souris Myh6-H2B-MCH / CAG-eGFP-anillin double transgéniques ont été isolés le jour postnatal 3 (P3) et transfectées avec activité induisant le cycle cellulaire miR199 5 ARNsi de p27 et FZR1 ARNsi. Par rapport au témoin négatif (figure 1A), les images de miR199- (figure 1B) et...

Pour distinguer la division cellulaire des variations du cycle cellulaire dans les cardiomyocytes, nous présentons des protocoles utilisant deux lignées de souris transgéniques : les souris transgéniques Myh6-H2B-mCh, pour l’identification sans équivoque des noyaux de cardiomyocytes, et les souris CAG-eGFP-anillin, pour distinguer la division cellulaire des variations du cycle cellulaire.

Visualisation des variations du cycle cellulaire et détermination de nucléation dans postnatales cardiomyocytes

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

L'objectif général de cette procédure est de visualiser l'activité du cycle cellulaire dans les cardiomyocytes postnataux et de déterminer leur nuclearité. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la régénération cardiaque, telles que : un cardiomyocyte se divise-t-il réellement ou augmente-t-il simplement sa ploïdie ou devient-il multinucléé ? Les principaux avantages de cette technique sont que la phase M du cycle cellulaire peut être visualisée avec une haute résolution spatiotemporelle et que les noyaux des cardiomyocytes peuvent être identifiés par fluorescence.La procédure sera démontrée par Patricia Freitag, technicienne de notre laboratoire. Si l'on utilise des couples reproducteurs non homozygotes, identifier d'abord les cœurs transgéniques par microscopie fluorescente afin de vérifier leur expression d'EGFP analyine et d'H2B-mCherry. Les signaux nucléaires d'EGFP analyine peuvent être détectés le plus facilement aux bords des oreillettes en focalisant à travers les différentes couches du tissu.Pour isoler les cardiomyocytes, placez le nombre approprié de cœurs dans des tubes à réaction de 1,5 millilitre contenant un millilitre de mélange enzymatique provenant d'un kit de dissociation cardiaque néonatal et découpez les cœurs en petits morceaux à l’aide de ciseaux. Ensuite, transférez la solution dans des tubes à réaction de 15 millilitres. Placez le tube en position presque horizontale à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes, en mélangeant le tissu cinq à dix fois avec une pipette de cinq millilitres à la fin de l'incubation.À la fin de la troisième digestion, arrêter la réaction avec 7,5 millilitres de milieu deux et filtrer la suspension cellulaire à travers un tamis cellulaire de 70 microns. Rincer le tamis cellulaire avec 3 millilitres de milieu deux, rassembler le rinçage avec les cellules collectées et récupérer les cellules par centrifugation. Resuspendre le culot dans 500 microlitres de milieu un pour le comptage.Ensuite, ensemencer une fois dix puissance quatre cellules par puits dans 120 microlitres de milieu un dans une plaque de 96 puits à fond plat et centrifuger les cellules avant leur culture nocturne dans une étuve à culture cellulaire. Le jour suivant, la majorité des cardiomyocytes devraient battre. Avant de commencer la transfection, nettoyer la paillasse et tous les matériaux de transfection avec une solution de décontamination anti-RNase afin d'éliminer toute RNase.Lorsque tous les matériaux sont prêts, ajouter 20 microlitres de mélange d'ARNsi fraîchement préparé dans chaque puits et remettre les cellules à l'incubateur pendant 48 heures. Après deux jours, remplacer le surnageant de chaque puits par 120 microlitres de milieu un et remettre les cellules à l'incubateur pendant au moins 24 heures supplémentaires. À la fin de l'incubation, laver les cellules une fois avec du PBS, puis les fixer dans une solution de formaldéhyde à 4 % pendant 20 minutes.Pour analyser les cellules par microscopie vidéo confocale, transférez la plaque sur la platine du microscope confocal et lancez le logiciel d'acquisition. Ouvrez les paramètres A1plus et cochez les cases des canaux un, deux, trois et quatre. Dans le menu déroulant, réglez le canal un sur DAPI, le canal deux sur eGFP, le canal trois sur RFP, et le canal quatre sur Cy5.Cliquez sur la tension du canal et utilisez les barres de défilement pour régler la tension à 80 pour chaque canal. Utilisez les barres de défilement pour régler le décalage à zéro et cliquez sur le bouton d'origine pour positionner le diaphragme en position initiale. Réglez la taille de balayage à 1024 par 1024 pixels dans le menu déroulant.Cliquez sur optimiser pour ouvrir la fenêtre de configuration de la taille XYZ et cochez la case voxel parfait sous l'étape suggérée en Z. Sélectionnez l'objectif 20x et ajustez les intensités laser jusqu'à ce que l'image ne soit ni sous-exposée ni surexposée. Une fois tous les paramètres définis, ouvrez le menu d'acquisition. Sélectionnez balayer une grande image, puis choisissez que la position actuelle se trouve en haut à gauche sous la zone.Ensuite, définissez le nombre de champs en X et Y à trois sur trois, puis cliquez sur analyser. Pour déterminer le nombre de noyaux de cardiomyocytes, cliquez sur mesurer, mesure manuelle, puis sur décomptes. Sélectionnez les noyaux présentant des signaux H2B-mCherry afin de les marquer et de les compter.Ensuite, sélectionnez les cellules positives pour l'alpha-actinine afin de déterminer le nombre de cardiomyocytes. Pour compter les cardiomyocytes en phase G1, S et G2 présentant des signaux nucléaires d'EGFP-analine, sélectionnez « mesurer », « mesure manuelle » et « comptages ». Marquez les noyaux exprimant l'EGFP-analine et l'H2B-mCherry en cliquant, puis comptez manuellement les cardiomyocytes présentant des signaux d'EGFP-analine spécifiques à la mitose, tels que les anneaux contractiles et les milieux corporels.Ensuite, cliquez sur Mesurer, Mesure manuelle et Comptages, puis cliquez sur les cardiomyocytes présentant des signaux d'EGFP-analine spécifiques de la mitose, des signaux cytoplasmiques, des anneaux contractiles et des milieux corporels. Par rapport aux contrôles négatifs, les cardiomyocytes transfectés avec des miARN et des siARN montrent une induction de l'activité du cycle cellulaire. Les cardiomyocytes qui effectuent une endoréplication présentent une expression nucléaire exclusive de l'EGFP-analine, tandis que les cardiomyocytes en cours de division cellulaire affichent une expression de l'EGFP-analine localisée de manière typique en phase M.Après la digestion enzymatique du tissu cardiaque sur l'appareil de Langendorff, les oreillettes et les ventricules peuvent être séparés mécaniquement et analysés indépendamment, permettant la visualisation de cardiomyocytes ventriculaires transgéniques exprimant H2B-mCherry, avec un grand nombre de cardiomyocytes bi-nucléés positifs pour H2B-mCherry. En revanche, la majorité des cardiomyocytes atriaux sont mono-nucléés. La digestion enzymatique ne donne pas une population de cellules individuelles à 100 %, révélant un motif de striation transversale par la coloration de l'alpha-actinine, facilitant ainsi la discrimination entre les cardiomyocytes bi-nucléés, qui présentent un motif continu de striation transversale, et les doublets cellulaires.Pour analyser l'indice de binucléation des cardiomyocytes dans des tranches épaisses, il est nécessaire de parcourir manuellement la pile d'images, car les noyaux ne se situent pas nécessairement dans un seul plan Z, la coloration par l'agglutinine de germe de blé permettant la détection des limites cellulaires. Des reconstructions 3D de tranches fixées de cœurs de souris transgéniques adultes permettent la détection et le comptage automatisé des crochets, ainsi que des noyaux colorés positifs pour H2B-mCherry, afin de déterminer la proportion de noyaux de cardiomyocytes dans des conditions physiologiques au sein du tissu. Une fois maîtrisée, la dissociation cardiaque peut être réalisée en deux à trois heures si elle est effectuée correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de travailler de manière continue afin de maintenir la viabilité des cellules tout au long de l'expérience. Après avoir suivi cette procédure, il est possible de tester des microARN ou d'autres petites substances pour leurs effets inducteurs de prolifération dans les cardiomyocytes postnataux.

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Developmental Biology

Biologie du développement

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Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CM) offrent une alternative à l’utilisation d’animaux pour le dépistage cardiotoxique préclinique. Une limite à l’adoption généralisée des CSPhi-CM dans le dépistage de la toxicité préclinique est le phénotype immature, semblable au fœtus des cellules. Les protocoles pour une maturation robuste et rapide des CM-HIPSC sont présentés ici.

Criblage de cardiotoxicité à haut débit utilisant des monocouches de cardiomyocytes de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme mature

Apprenez à visualiser le cycle cellulaire des cardiomyocytes postnataux et à déterminer leur nucléarité à l'aide de souris transgéniques et de microscopie à fluorescence. Cette méthode permet d'étudier la régénération cardiaque.

Visualisation des variations du cycle cellulaire et détermination de nucléation dans postnatales cardiomyocytes

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