Name: Visualisation des variations du cycle cellulaire et détermination de nucléation dans postnatales cardiomyocytes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Apprenez à visualiser le cycle cellulaire des cardiomyocytes postnataux et à déterminer leur nucléarité à l'aide de souris transgéniques et de microscopie à fluorescence. Cette méthode permet d'étudier la régénération cardiaque.

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Nous remercions S. Grünberg (Bonn, Allemagne) et P. Freitag (Bonn, Allemagne) pour leur assistance technique.

<ol><li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science. 324 (5923), 98-102 (2009).</li>
<li>Raulf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+systems+for+unequivocal+identification+of+cardiac+myocyte+nuclei+and+analysis+of+cardiomyocyte+cell+cycle+status%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res.Cardiol%22%5BJournal%5D)">Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status.</a> Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33(2015).</li>
<li>Field, C. M., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anillin%2C+a+contractile+ring+protein+that+cycles+from+the+nucleus+to+the+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex.</a> J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).</li>
<li>Hesse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+cell+division+using+high-resolution+imaging+of+M-phase+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Commun%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle.</a> Nat.Commun. 3, 1076(2012).</li>
<li>Eulalio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+identifies+miRNAs+inducing+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration.</a> Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).</li>
<li>Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors+induces+cardiomyocyte+re-entry+in+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle.</a> J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).</li>
<li>Hosoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonality+of+mouse+and+human+cardiomyogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).</li>
<li>Soonpaa, M. H., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cardiomyocyte+DNA+synthesis+in+normal+and+injured+adult+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts.</a> Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).</li>
<li>Ang, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).</li>
<li>Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16889791">Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation.</a> J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).</li>
<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Cell+Generation+and+Turnover+in+the+Human+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart.</a> Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Il y a une controverse quant à savoir si cardiomyocytes sont en mesure de réintégrer le cycle cellulaire et de diviser après une blessure et pendant l&#39;homéostasie tissulaire. Les valeurs pour le chiffre d&#39; affaires de base de cardiomyocytes ont été donnés dans la plage comprise entre 1% 1 et 80% 7. De plus , après une lésion cardiaque, l&#39;induction de l&#39; activité du cycle cellulaire et la production de nouveaux cardiomyocytes ont été signalés dans la zone de...

L&#39;identification correcte des noyaux de cardiomyocytes et l&#39;état du cycle cellulaire est d&#39;une importance cruciale pour la détermination du chiffre d&#39;affaires du muscle cardiaque et de la régénération. Cela est particulièrement vrai pour l&#39;utilisation de marqueurs nucléaires, tels que pHH3, Ki-67, ou des analogues de la thymidine pour identifier l&#39;activité du cycle cellulaire. Comme la capacité proliférative des cardiomyocytes de mammifères adultes est très faible 1, une fausse identification d&#39;un noyau positif pour un marqueur d&#39;un noyau de cardiomyocytes de prolifération pourrait faire une différence cruciale dans l&#39;issue d&#39;un essai de prolifération. En outre, les cardiomyocytes sont sujettes à des variations du cycle cellulaire, tels que endoréduplication et la mitose acytokinetic qui conduisent à des cellules polyploïdes et multinucléées plutôt que dans la division cellulaire. À cette fin, l&#39;interprétation de la coloration des anticorps contre des marqueurs du cycle cellulaire communs ne sont pas concluantes dans tous les cas. Ici, nous présentons les méthodes pour la ligne droite-forwa<html> reconnaissance rd des cardiomyocytes de souris et de leur nucléarité dans des cellules isolées indigènes et des coupes de tissus épais aux stades postnataux et des adultes par l&#39;identification sans équivoque de leurs noyaux. À cette fin, une lignée de souris transgéniques avec une expression spécifique de cardiomyocytes d&#39;une protéine de fusion consistant en histone H2B humaine et mCherry sous le contrôle du promoteur Myh6 (Myh6-H2B-MCH) a été utilisé 2. Le croisement de cette ligne de souris avec une lignée de souris transgénique de l&#39;indicateur de la prolifération, dans laquelle l&#39;expression d&#39;une protéine de fusion eGFP anillin est sous le contrôle de l&#39;ubiquité promoteur d&#39;actine de poulet avec un activateur de CMV (ACG-eGFP anillin), permet la détermination de l&#39;état du cycle cellulaire. Anillin la protéine d&#39;échafaudage est spécifiquement exprimée dans le cycle cellulaire des cellules actives 3 et son différentiel localisation subcellulaire au cours du cycle cellulaire permet un suivi en temps réel, progression du cycle cellulaire avec une résolution élevée de la phase Mef &quot;&gt; 4. Par conséquent, les souris transgéniques doubles peuvent être utilisées pour établir une discrimination entre les cardiomyocytes qui prolifèrent et celles qui subissent des variations du cycle cellulaire. Cela montre particulièrement utile dans le criblage de substances induisant la prolifération in vitro.

<table><tbody><tr><td>Boîte de Pétri 10 cm</td><td>Sarstedt</td><td>821472</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro ; Crépine à cellules m</td><td>Becton Dickinson GmbH/Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Monxime de 2,3-butanedione (BDM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>G20x1 &frac12 ; canule d’injection, Sterican</td><td>Braun, Melsungen</td><td>4657519</td><td></td></tr> aiguille <tr><td>de calibre 20</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>301300</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 24 puits</td><td>Becton Dickinson GmbH/Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>2-Méthyl-butane</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3927.1</td><td></td></tr><tr><td>solution de formaldéhyde à 37 %</td><td>AppliChem GmbH&nbsp ;</td><td>A0936,1000</td><td></td></tr><tr><td>Robinet d’arrêt à 3 voies</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>16494C</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 50 mL</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>8728810F</td><td></td></tr><tr><td>70 % éthanol</td><td>Otto Fischar GmbH</td><td>27669</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire conjugué à Alexa-Fluor</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-605-205</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-Aktinin EA-53, souris IgG</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Microplaque de culture cellulaire, 96 puits, Demi-zone</td><td>Greiner bio-one</td><td>675986</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase B</td><td>Roche</td><td>11088815001</td><td></td></tr><tr><td>microscope confocal Eclipse Ti-E</td><td>Cryostat Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM 3050S</td> Sérum d’âne <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Jackson Immuno Research, Suffolk, GB</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>sérum de veau fœtal</td><td>PromoCell, Heidelberg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution de formaldéhyde (4 %)</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3697</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine de peau de porc, Type A</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>G2500</td><td></td></tr><tr><td>lamelles de verre</td><td>VWR</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Tube d’extension Heidelberger</td><td>IMPROMEDIFORM GmbH</td><td>MF 1833</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natrium</td><td>Ratiopharm</td><td>5394.02.00</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>HistoBond lames de microscope</td><td>Marienfeld</td><td>0810000</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (1&nbsp ; mg/mL)</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Seringue à insuline</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>300334</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s ModifiéDulbecco' s Medium (IMDM)</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstadt</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Corning</td><td>354221</td><td></td></tr><tr><td>Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti</td><td>Nikoninstruments, D&uuml ; </td><td></td><td></td>sseldorf</tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt</td><td>13778075</td><td></td></tr><tr><td>Souris IgG Cy5 (âne)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-175-151</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifugeuse tube</td><td>Sarstedt</td><td>72690</td><td></td></tr><tr><td>Mini shaker</td><td>VWR</td><td>12620-940</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA mimic, has-miR199a-3p</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4464066</td><td></td></tr><tr><td>Biopsie Moule</td><td>Sakura Finetek/ VWR</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>M-slide 8-well ibiTreat</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck Millipore</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>négatif control(ARN brouillé)</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>AM4611</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dissociation cardiaque néonatale</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach</td><td>130-098-373</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit</td><td>Nikoninstruments, D&uuml ; </td><td></td><td></td>sseldorf</tr><tr><td>Acides aminés non essentiels, NEAA</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstad</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM, Sérum réduit</td><td>Medium Gibco</td><td>51985-026</td><td></td></tr><tr><td>P21-siRNA</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4390771</td><td></td></tr><tr><td>P27-siRNA</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4390771</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstadt</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de montage à l’alcool polyvinylique avec DABCO&reg ;, anti-décoloration</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10981</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>1007885</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>récipients pour échantillons</td><td>Vitlab</td><td>80731</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique</td><td>Greiner</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>logiciel NIS Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek/ VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>ToPro3 iodure (642/661)</td><td>Moléculaire sondes/ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>Fluka</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>Agglutinine de germe de blé (WGA) Fluorescéine marquée Vector</td><td>Laboratories</td><td>VEC-FL-1021-5</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-alpha-actinine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-Mercaptoéthanol</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation des variations du cycle cellulaire et détermination de nucléation dans postnatales cardiomyocytes

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Les cardiomyocytes sont sujets à des variations du cycle cellulaire, telles que l’endoréduplication (cycles continus de synthèse de l’ADN sans caryokinésie ni cytokinèse) et la mitose acytocinétique (caryokinèse mais pas de cytokinèse). De telles variations atypiques du cycle cellulaire aboutissent à des cellules polyploïdes et multinucléées plutôt qu’à une division cellulaire. Par conséquent, pour déterminer le renouvellement et la régénération cardiaques, il est d’une importance cruciale d’identifier correctement les noyaux des cardiomyocytes, le nombre de noyaux par cellule et l’état de leur cycle cellulaire. Cela est particulièrement vrai pour l’utilisation de marqueurs nucléaires pour identifier l’activité du cycle cellulaire, tels que les analogues de la thymidine Ki-67, PCNA ou pHH3. Nous présentons ici des méthodes de reconnaissance des cardiomyocytes et de leur nucléarité et de détermination de l’activité de leur cycle cellulaire. Nous utilisons deux systèmes transgéniques publiés : la lignée de souris transgéniques Myh6-H2B-mCh, pour l’identification sans équivoque des noyaux de cardiomyocytes, et la lignée de souris CAG-eGFP-anilline, pour distinguer la division cellulaire des variations du cycle cellulaire. Combinés, ces deux systèmes facilitent l’étude de la régénération et de la plasticité cardiaques.

Afin d&#39;analyser les effets de siRNA / miARN sur l&#39;activité du cycle cellulaire de cardiomyocytes postnatales in vitro, les cardiomyocytes de souris Myh6-H2B-MCH / CAG-eGFP-anillin double transgéniques ont été isolés le jour postnatal 3 (P3) et transfectées avec activité induisant le cycle cellulaire miR199 5 ARNsi de p27 et FZR1 ARNsi. Par rapport au témoin négatif (figure 1A), les images de miR199- (figure 1B) et...

Pour distinguer la division cellulaire des variations du cycle cellulaire dans les cardiomyocytes, nous présentons des protocoles utilisant deux lignées de souris transgéniques : les souris transgéniques Myh6-H2B-mCh, pour l’identification sans équivoque des noyaux de cardiomyocytes, et les souris CAG-eGFP-anillin, pour distinguer la division cellulaire des variations du cycle cellulaire.

Visualisation des variations du cycle cellulaire et détermination de nucléation dans postnatales cardiomyocytes

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

L'objectif général de cette procédure est de visualiser l'activité du cycle cellulaire dans les cardiomyocytes postnataux et de déterminer leur nuclearité. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la régénération cardiaque, telles que : un cardiomyocyte se divise-t-il réellement ou augmente-t-il simplement sa ploïdie ou devient-il multinucléé ? Les principaux avantages de cette technique sont que la phase M du cycle cellulaire peut être visualisée avec une haute résolution spatiotemporelle et que les noyaux des cardiomyocytes peuvent être identifiés par fluorescence.La procédure sera démontrée par Patricia Freitag, technicienne de notre laboratoire. Si l'on utilise des couples reproducteurs non homozygotes, identifier d'abord les cœurs transgéniques par microscopie fluorescente afin de vérifier leur expression d'EGFP analyine et d'H2B-mCherry. Les signaux nucléaires d'EGFP analyine peuvent être détectés le plus facilement aux bords des oreillettes en focalisant à travers les différentes couches du tissu.Pour isoler les cardiomyocytes, placez le nombre approprié de cœurs dans des tubes à réaction de 1,5 millilitre contenant un millilitre de mélange

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Developmental Biology

Biologie du développement

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Dérivation efficace des ressources humaines précurseurs cardiaques et les cardiomyocytes à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

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Apprenez à visualiser le cycle cellulaire des cardiomyocytes postnataux et à déterminer leur nucléarité à l'aide de souris transgéniques et de microscopie à fluorescence. Cette méthode permet d'étudier la régénération cardiaque.

Visualisation des variations du cycle cellulaire et détermination de nucléation dans postnatales cardiomyocytes

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