Visualisation des variations du cycle cellulaire et détermination de nucléation dans postnatales cardiomyocytes

L'objectif général de cette procédure est de visualiser l'activité du cycle cellulaire dans les cardiomyocytes postnataux et de déterminer leur nuclearité. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la régénération cardiaque, telles que : un cardiomyocyte se divise-t-il réellement ou augmente-t-il simplement sa ploïdie ou devient-il multinucléé ? Les principaux avantages de cette technique sont que la phase M du cycle cellulaire peut être visualisée avec une haute résolution spatiotemporelle et que les noyaux des cardiomyocytes peuvent être identifiés par fluorescence.

La procédure sera démontrée par Patricia Freitag, technicienne de notre laboratoire. Si l'on utilise des couples reproducteurs non homozygotes, identifier d'abord les cœurs transgéniques par microscopie fluorescente afin de vérifier leur expression d'EGFP analyine et d'H2B-mCherry. Les signaux nucléaires d'EGFP analyine peuvent être détectés le plus facilement aux bords des oreillettes en focalisant à travers les différentes couches du tissu.

Pour isoler les cardiomyocytes, placez le nombre approprié de cœurs dans des tubes à réaction de 1,5 millilitre contenant un millilitre de mélange enzymatique provenant d'un kit de dissociation cardiaque néonatal et découpez les cœurs en petits morceaux à l’aide de ciseaux. Ensuite, transférez la solution dans des tubes à réaction de 15 millilitres. Placez le tube en position presque horizontale à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes, en mélangeant le tissu cinq à dix fois avec une pipette de cinq millilitres à la fin de l'incubation.

À la fin de la troisième digestion, arrêter la réaction avec 7,5 millilitres de milieu deux et filtrer la suspension cellulaire à travers un tamis cellulaire de 70 microns. Rincer le tamis cellulaire avec 3 millilitres de milieu deux, rassembler le rinçage avec les cellules collectées et récupérer les cellules par centrifugation. Resuspendre le culot dans 500 microlitres de milieu un pour le comptage.

Ensuite, ensemencer une fois dix puissance quatre cellules par puits dans 120 microlitres de milieu un dans une plaque de 96 puits à fond plat et centrifuger les cellules avant leur culture nocturne dans une étuve à culture cellulaire. Le jour suivant, la majorité des cardiomyocytes devraient battre. Avant de commencer la transfection, nettoyer la paillasse et tous les matériaux de transfection avec une solution de décontamination anti-RNase afin d'éliminer toute RNase.

Lorsque tous les matériaux sont prêts, ajouter 20 microlitres de mélange d'ARNsi fraîchement préparé dans chaque puits et remettre les cellules à l'incubateur pendant 48 heures. Après deux jours, remplacer le surnageant de chaque puits par 120 microlitres de milieu un et remettre les cellules à l'incubateur pendant au moins 24 heures supplémentaires. À la fin de l'incubation, laver les cellules une fois avec du PBS, puis les fixer dans une solution de formaldéhyde à 4 % pendant 20 minutes.

Pour analyser les cellules par microscopie vidéo confocale, transférez la plaque sur la platine du microscope confocal et lancez le logiciel d'acquisition. Ouvrez les paramètres A1plus et cochez les cases des canaux un, deux, trois et quatre. Dans le menu déroulant, réglez le canal un sur DAPI, le canal deux sur eGFP, le canal trois sur RFP, et le canal quatre sur Cy5.

Cliquez sur la tension du canal et utilisez les barres de défilement pour régler la tension à 80 pour chaque canal. Utilisez les barres de défilement pour régler le décalage à zéro et cliquez sur le bouton d'origine pour positionner le diaphragme en position initiale. Réglez la taille de balayage à 1024 par 1024 pixels dans le menu déroulant.

Cliquez sur optimiser pour ouvrir la fenêtre de configuration de la taille XYZ et cochez la case voxel parfait sous l'étape suggérée en Z. Sélectionnez l'objectif 20x et ajustez les intensités laser jusqu'à ce que l'image ne soit ni sous-exposée ni surexposée. Une fois tous les paramètres définis, ouvrez le menu d'acquisition. Sélectionnez balayer une grande image, puis choisissez que la position actuelle se trouve en haut à gauche sous la zone.

Ensuite, définissez le nombre de champs en X et Y à trois sur trois, puis cliquez sur analyser. Pour déterminer le nombre de noyaux de cardiomyocytes, cliquez sur mesurer, mesure manuelle, puis sur décomptes. Sélectionnez les noyaux présentant des signaux H2B-mCherry afin de les marquer et de les compter.

Ensuite, sélectionnez les cellules positives pour l'alpha-actinine afin de déterminer le nombre de cardiomyocytes. Pour compter les cardiomyocytes en phase G1, S et G2 présentant des signaux nucléaires d'EGFP-analine, sélectionnez « mesurer », « mesure manuelle » et « comptages ». Marquez les noyaux exprimant l'EGFP-analine et l'H2B-mCherry en cliquant, puis comptez manuellement les cardiomyocytes présentant des signaux d'EGFP-analine spécifiques à la mitose, tels que les anneaux contractiles et les milieux corporels.

Ensuite, cliquez sur Mesurer, Mesure manuelle et Comptages, puis cliquez sur les cardiomyocytes présentant des signaux d'EGFP-analine spécifiques de la mitose, des signaux cytoplasmiques, des anneaux contractiles et des milieux corporels. Par rapport aux contrôles négatifs, les cardiomyocytes transfectés avec des miARN et des siARN montrent une induction de l'activité du cycle cellulaire. Les cardiomyocytes qui effectuent une endoréplication présentent une expression nucléaire exclusive de l'EGFP-analine, tandis que les cardiomyocytes en cours de division cellulaire affichent une expression de l'EGFP-analine localisée de manière typique en phase M.

Après la digestion enzymatique du tissu cardiaque sur l'appareil de Langendorff, les oreillettes et les ventricules peuvent être séparés mécaniquement et analysés indépendamment, permettant la visualisation de cardiomyocytes ventriculaires transgéniques exprimant H2B-mCherry, avec un grand nombre de cardiomyocytes bi-nucléés positifs pour H2B-mCherry. En revanche, la majorité des cardiomyocytes atriaux sont mono-nucléés. La digestion enzymatique ne donne pas une population de cellules individuelles à 100 %, révélant un motif de striation transversale par la coloration de l'alpha-actinine, facilitant ainsi la discrimination entre les cardiomyocytes bi-nucléés, qui présentent un motif continu de striation transversale, et les doublets cellulaires.

Pour analyser l'indice de binucléation des cardiomyocytes dans des tranches épaisses, il est nécessaire de parcourir manuellement la pile d'images, car les noyaux ne se situent pas nécessairement dans un seul plan Z, la coloration par l'agglutinine de germe de blé permettant la détection des limites cellulaires. Des reconstructions 3D de tranches fixées de cœurs de souris transgéniques adultes permettent la détection et le comptage automatisé des crochets, ainsi que des noyaux colorés positifs pour H2B-mCherry, afin de déterminer la proportion de noyaux de cardiomyocytes dans des conditions physiologiques au sein du tissu. Une fois maîtrisée, la dissociation cardiaque peut être réalisée en deux à trois heures si elle est effectuée correctement.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de travailler de manière continue afin de maintenir la viabilité des cellules tout au long de l'expérience. Après avoir suivi cette procédure, il est possible de tester des microARN ou d'autres petites substances pour leurs effets inducteurs de prolifération dans les cardiomyocytes postnataux.