Utilisant la stratégie capside-Incorporation Antigen pour le développement d'approches adénovirus sérotype 5 Vectored vaccins

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser la stratégie d’incorporation des capuchons d’antigène pour le développement d’approches de vaccin à vecteur de sérotype cinq à adénovirus en utilisant un vecteur adénoviral divalent recombinant comme preuve de principe en utilisant la stratégie d’incorporation de capside d’antigène, plusieurs étapes de clonage sont utilisées pour construire le plasmide modifié, A D cinq R un K-W-S-H-V-R cinq sifflement. Ensuite, le vecteur viral divalent de l’adényle. R un K était HVR cinq.

Hiss est sauvé, propagé et purifié. Ensuite, les titres viraux et l’affichage antigénique des antigènes incorporés sur la capside virale sont caractérisés. Enfin, le potentiel du vecteur viral divalent d’Aden à contourner la neutralisation par un sérum D cinq positifs est évalué à l’aide de la stratégie d’incorporation de la capside de l’antigène.

Plusieurs étapes de clonage sont utilisées pour construire le plasmide modifié, A D cinq R un K-W-A-S-H-V-R cinq sifflements. Aujourd’hui, nous allons démontrer la stratégie d’incorporation de la capside antigénique. Cette stratégie est bénéfique par rapport à d’autres stratégies telles que la méthode d’expression transgénique, car non seulement elle affiche l’antigène d’intérêt sur l’adénovirus captif sous forme de protéine, mais elle permet une réponse humorale robuste contre cet antigène.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes concernant la génération de l’adénovirus modificateur de la coiffe sont difficiles à apprendre car de nombreuses variables contribuent au développement des vecteurs viraux recommandés, telles que la sélection des enzymes de restriction, la lentille de l’énergie d’intérêt chez d’autres Démonstration des procédures. Aujourd’hui, ce seront mes deux postdoctorants, le Dr Lin Lin Gu et le Dr Nitra Farrow. Pour construire le plasmide de la navette, il faut ajouter six unités d’une unité GE et d’une unité CCC à six microgrammes du HVR d’un fragment KWA.

Incuber la réaction de digestion à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Résoudre le fragment digestif dans un gel agros à 2 % par électrophorèse et utiliser un kit d’extraction de gel d’ADN selon le protocole du fabricant pour purifier le fragment. Ensuite, ligaturez 12 nanogrammes du fragment purifié dans les sites a G un et ACC un des 100 nanogrammes du plasmide navette précédemment construit.

HVR cinq siffle six pH cinq s et un volume de réaction de 10 microlitres à température ambiante pendant deux heures. Ajoutez ensuite un microlitre de la réaction de ligature à 50 microlitres de cellules DH cinq alpha électrocompétentes, un électro huit avant d’ajouter 950 microlitres de milieu SOC. Incuber les cellules transformées à 37 degrés Celsius et 200 tr/min pendant une heure avant d’étaler 100 à 200 microlitres de la culture sur une plaque LB CANY.

Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius. Utilisez six unités d’Echo R one et de PME one pour digérer six microgrammes du plasmide de la navette purifié à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Après avoir purifié le fragment contenant les bras de recombinaison homologue et le gène de l’exon cinq modifié double, utilisez SUA un pour linéariser le plasmide de base, PAD cinq, delta H cinq pour effectuer la recombinaison homologue.

Utilisez l’électroporation pour co-transformer 100 nanogrammes chacun du fragment de navette purifié et du plasmide de base en 50 microlitres de BJ 5 180 3 cellules électro-compétentes. Comme démontré plus tôt dans cette vidéo, le lendemain, prélevez environ 10 colonies dans trois millilitres de mycine liquide contenant de la conserve LB et cultivez-les pendant la nuit avant de les dépister selon le protocole textuel. Transformez ensuite 100 nanogrammes de plasmide purifié en cellules DH cinq alpha, comme il a été démontré précédemment pour sauver le vecteur viral add.

Commencez par utiliser PAC one pour linéariser 15 microlitres du vecteur dans un volume de 100 microlitres. Incuber à 37 degrés Celsius pendant trois heures après la digestion. Pour extraire le plasmide linéarisé sous une hotte.

Ajouter un volume égal de phénol chloroforme, d’alcool isoamylique dans la centrifugeuse à réaction à 10 000 g pendant une minute et recueillir le surnageant avant de répéter l’extraction et de tourner jusqu’au volume extrait. Ajoutez 300 microlitres d’éthanol à 100 % et 10 microlitres d’acétate à 10 000 g pendant 10 minutes. Ensuite, après avoir jeté le surnageant, ajoutez 700 microlitres d’éthanol à 70 % avant de tourner à nouveau.

Une fois que la pastille a été remise en suspension et que l’ADN a été quantifié, transfectez trois microgrammes du plasmide linéarisé avec un réactif de transfection liposomale commercial dans une fiole T 25 préalablement préparée de cellules HEK 2 93 à 80 % confluentes selon les instructions du fabricant. Après une incubation de six heures, remplacez le milieu de transfection par un milieu complet avant de remettre le ballon dans l’incubateur. Lorsque les plaques développent un effet cytopathique complet ou EPC sous un capuchon stérile, grattez les cellules restantes du ballon et centrifugez la culture à 300 G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Utilisez ensuite un millilitre de milieu contenant 2 % de FBS pour remettre en suspension la pastille cellulaire. Ensuite, cassez les cellules en effectuant quatre cycles de congélation-décongélation, puis centrifugez le lysat à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Prélever le surnageant S contenant le virus sauvé pour propager le vecteur viral sur une culture à grande échelle.

Un tiers de la totalité du lysat viral du ballon T 25 dans un ballon T 75 contenant 2 93 cellules HEK. Après avoir laissé la CPE complète se développer et récolter le supinate comme démontré précédemment, propager la moitié de tout le virus dans un ou plusieurs virus. Les flacons T 1 75 de cellules HK 2 93 propagent ensuite le virus isolé des flacons T 1 75 dans une douzaine ou plus.

T 1 75 flacons de cellules après préparation d’un point 33 grammes par millilitre et 1,45 gramme par millilitre. Les solutions de chlorure de césium ajoutent quatre millilitres, 1,33 gramme par millilitre, du chlorure de césium dans un tube d’ultracentrifugation et ajoutent quatre millilitres, 1,45 gramme par millilitre, du chlorure de césium contre le fond du même tube. Ajoutez quatre millilitres de lysat viral de supinate dans le haut du même tube, puis centrifugez le tube à 110 000 G et quatre degrés Celsius pendant trois heures.

Cela séparera la bande virale inférieure mature de la bande virale supérieure défectueuse sous le capot. Utilisez une aiguille de calibre 33 attachée à une seringue de trois millilitres pour recueillir la bande inférieure. Utilisez ensuite cinq hippies pour amener la solution jusqu’à quatre millilitres.

Ensuite, après avoir préparé deux autres gradients de chlorure de césium, chargez le virus dilué sur le dessus et centrifugez les gradients à 110 000 G et quatre degrés Celsius pendant la nuit. Sous le capot. Collectez la bande virale comme nous venons de le démontrer.

Ensuite, à l’aide d’une aiguille de calibre 33 et d’une seringue de trois millilitres, injectez la solution virale dans une cassette de dialyse. Placez une cassette dans 700 millilitres d’un tampon de dialyse préparé selon le protocole texte, en remplaçant le tampon quatre fois toutes les trois heures. Puis à l’aide d’une aiguille et d’une seringue.

Prélever la solution virale de la cassette pour déterminer le titre physique viral. Utilisez le tampon de lyse virale pour diluer à la fois le virus et le tampon de dialyse utilisé comme contrôle de fond à un à 10 et de un à 20 et incubez tous les tubes à 56 degrés Celsius pendant 10 minutes. Allumez un biophotomètre et réglez le mode d’absorbance sur une densité optique de 260 nanomètres.

Utilisez le tampon de dialyse dilué à 1 à 10 pour équilibrer le signal de fond en cliquant sur le bouton vide. Tapez 10 plus 90 sur l’écran du biophotomètre. Remplacez le tube par un tube de virus dilué à un à 10 et lisez le signal du virus dilué à un à 10.

Pour mesurer la dilution de un à 20, utilisez le tampon de dialyse dilué de un à 20 pour équilibrer l’arrière-plan en tapant cinq plus 95 sur l’écran avant de remplacer le tube tampon par un tube de virus dilué de un à 20 et de lire le signal. Multipliez les deux numéros de lecture du virus par 1,1 fois 10 puissance 12 et calculez le titre moyen avec des unités de VP par millilitre en fonction des deux titres individuels des deux dilu. Évaluer le virus chez la souris selon le protocole textuel pour démontrer si le virus sauvé présente l’antigène antigénique du VIH et l’étiquette hist à la surface de la capside virale.

Protéine majeure Heon cinq. Eliza a été réalisée avec l’anticorps monoclonal humain deux F cinq et l’anticorps monoclonal anti-sifflement de souris respectivement, comme indiqué ici, les deux anticorps humains F cinq et l’anticorps anti-sifflement de souris liés à la particule virale divalente add five, alors qu’il n’y avait aucune liaison au contrôle négatif. Une analyse sanguine occidentale à cinq vecteurs a été utilisée pour confirmer les données d’Eize, car deux anticorps humains F cinq et un anticorps anti-sifflement de souris ont détecté des bandes spécifiques d’environ 117 kilodaltons seulement.

Dans le DIVALENT, ajoutez cinq virus, ce qui correspond à la taille de la protéine Heon cinq. Pour évaluer le potentiel du virus construit add five à contourner la neutralisation par add five positifs, un test de neutralisation a été effectué. Les résultats montrent que les unités luminescentes relatives, ou rlu, étaient 12 fois plus élevées lorsque le vecteur témoin add five était traité sans sérum positif que lorsqu’il était traité avec du sérum, ce qui suggère que le virus était neutralisé.

En revanche, il y avait peu de différence dans l’utilisation de R pour le virus divalent AD cinq construit entre les échantillons traités et non traités, ce qui suggère que le virus construit a échappé à la neutralisation. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une meilleure compréhension de l’approche d’incorporation de la capside de l’antigène pour le développement d’un vaccin à cinq vecteurs. Actuellement, nous utilisons cette stratégie en combinaison avec des vecteurs de sérotypes rares.

Vous pouvez également le faire.