Isolement et quantification des ARNm axonaux à l’aide d’inserts membranaires poreux et RTddPCR

Nos recherches étudient comment la synthèse protéique locale est régulée et leur rôle dans la réparation, le développement et la dégénérescence neuronale. Les avancées récentes incluent des techniques de détection d’ARNm à haute sensibilité, comme la gdPCR, pour identifier les ARNm axonaux à faible abondance, et compartimenter les cultures neuronales. Pour commencer, 250 microlitres de triazole dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre correspondant à chaque insert dans un puits ou une plaque à six puits.

Gardez les tubes de côté jusqu’à ce que ce soit nécessaire. Ajoutez deux millilitres de PBS stérile dans chaque puits d’une deuxième plaque à six puits, en veillant à ce que le nombre de puits ou de plaques corresponde au nombre d’inserts. Faites sortir le milieu de culture à partir du bas de l’insert et transférez l’insert dans la plaque à six puits contenant le PBS.

Maintenant, avec une pince, placez doucement l’insert, puis ajoutez deux millilitres de PBS par-dessus. Aspirez le PBS des deux côtés et répétez le lavage deux fois. Ensuite, laissez l’insert dans un PBS frais.

Ensuite, utilisez un racleur à cellules stériles pour gratter toute la fraction neuronale du haut de l’insert. Prélève le lysat de soma de l’insert. Transférez-le dans un tube microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.

Centrifugez le tube à 10 000 à 15 000 G pendant deux minutes. Jetez le surnageant et resuspendez la pellete dans 250 microlitres de trizol. Étiquetez ce tube comme la fraction neuronale entière.

Pour collecter la fraction de neurite, déplacez lentement une extrémité d’un coton stérile en zigzag de haut en bas sur tout le côté neuronal de l’insert. Faites pivoter l’insert de 90 degrés et répétez en utilisant l’autre extrémité du coton. Ensuite, jetez le prélèvement.

Utilisez un nouveau couvillon et avancez en cercles concentriques, en partant du centre de l’insert vers l’extérieur, en veillant à nettoyer aussi la circonférence. Inversez l’insert pour que le côté neurite soit vers le haut. Coupez la membrane avec une nouvelle lame de scalpel stérile.

Placez la membrane coupée dans la plaque à six puits contenant le trizol, avec le côté neurite orienté vers le bas. Assurez-vous que la membrane est immergée. Maintenant, collectez le trizol contenant le lysat de neurite dans le puits.

Transférez-le dans un tube microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Procéder à l’isolement de l’ARN ou stocker les lyses de soma et de neurite à moins 80 degrés Celsius pour un traitement ultérieur. Préparez des réactions PCR numériques par gouttelettes à transcription inverse à l’aide d’un mélange universel prêt à utiliser par PCR numérique à gouttelettes et ciblez des amorces spécifiques avec de l’ADN complémentaire approprié.

Pipettez le mélange de réaction dans la cartouche de génération de goutteles. Ensuite, ajoutez l’huile de production dans les puits désignés de la cartouche. Maintenant, scellez la cartouche avec le joint.

Générez les gouttelettes en utilisant le générateur de goutteles. Une fois les gouttelettes générées, transférez-les dans une plaque PCR de 96 puits et scellez-les avec du papier aluminium avant de placer la plaque dans le thermocycleur. Ouvrez le logiciel QX Manager pour commencer l’analyse.

Cliquez sur l’option Parcourir et ouvrez le fichier pour analyser. Lorsque le fichier est chargé, la vue tableau de bord apparaît dans le panneau gauche. Sélectionnez les puits d’intérêt en maintenant la touche Contrôle en cliquant.

Cliquez sur 1D Amplitude pour visualiser un diagramme de points. Sélectionnez Threshold Multiple Wells pour appliquer le même seuil à plus d’un puits. Entrez la valeur seuil basée sur l’endroit où une séparation claire est observée entre les gouttelettes positives et négatives.

Examinez maintenant bien la section des données, montrant la description de l’échantillon, les valeurs de concentration, le nombre de gouttelettes acceptées, ainsi que les décomptes positifs et négatifs de gouttelettes. Cliquez sur Enregistrer pour enregistrer les résultats de seuil. La quantification de l’ARN à l’aide du test ribo green a révélé que les fractions entières du neurone produisaient 212,85 nanogrammes d’ARN par insert, tandis que les fractions de neurite en donnaient 42,75 nanogrammes.

La validation PCR a identifié l’ensemble d’amorces un comme le plus spécifique pour la transcription Gap43, montrant une bande unique distincte. Des résultats de PCR ambigus pour la gamma-actine ont nécessité un test de gradient de température utilisant le jeu d’amorces deux, qui a montré une amplification maximale à 55 degrés Celsius. Les graphiques d’amplitude RT-ddPCR ont montré une séparation claire des gouttelettes pour la gamma-actine dans des échantillons entiers de neurones et de neurites, confirmant une détection fiable des transcrits.

Pour Gap43, près de 23 % du pool d’ARNm est présent dans les neurites, contrairement à la gamma-actine, où seulement 5 % du pool d’ARNm est présent dans les neurites, comparé à la fraction totale des neurones. Nous avons montré la présence de structures granulaires de stress dans les axones dans des conditions physiologiques, qui inhibent la synthèse locale des protéines. Notre protocole offre une méthode fiable et cohérente pour isoler les compartiments neuronaux et détecter les ARNm en bas environnement.

Les analyses futures se concentreront sur l’isolement et la caractérisation de sous-domaines axonaux distincts, tels que les cônes de croissance et le puits axonal au-delà de l’analyse de masse.