Name: Isolement et quantification des ARNm axonaux à l’aide d’inserts membranaires poreux et RTddPCR (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Découvrez l'isolation des ARNm axonaux par inserts membranaires poreux et leur quantification par RT-ddPCR. Cette méthode permet d'étudier le transport et la traduction locale des ARNm dans les neurones avec une sensibilité élevée.

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<table><tbody><tr><td>Inserts de culture cellulaire pour plaque à 6 puits, 1,0 & nbsp ; &mu ; m Taille des pores, stérile</td><td>Corning</td><td>353102</td><td>Consommables</td></tr><tr><td>Inserts de culture cellulaire pour plaque à 6 puits, 3,0 & nbsp ; &mu ; m Taille des pores, stérile</td><td>CELLTREAT</td><td>230603</td><td>Consommables</td></tr><tr><td>Élévateur à cellules avec lame étroite</td><td>VWR</td><td>76036-006</td><td>Consommables</td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire à 6 puits CELLSTAR</td><td>VWR</td><td>82050-842</td><td>Consommables</td></tr><tr><td>ddPCR Plaques à 96 puits &nbsp ;</td><td>Bio-rad</td><td>12001925</td><td>Consommables</td></tr><tr><td>ddPCR Huile de lecteur de gouttelettes &nbsp ;</td><td>Bio-rad</td><td>1863004</td><td>Réactifs</td></tr><tr><td>Cartouches DG8 pour générateur de gouttelettes QX200/QX100</td><td>Bio-rad</td><td>1864008</td><td>Consommables</td></tr><tr><td>Laminine</td><td>Gibco/Fisher Scientific</td><td>23017-015</td><td>Réactifs</td></tr><tr><td>LunaScript RT SuperMix Kit</td><td>NEB</td><td>E3010L</td><td>Réactifs</td></tr><tr><td>Microplaques pour noirs à base de fluorescence à 96 puits</td><td>Thermo Fisher</td><td>M33089</td><td>Consommables</td></tr><tr><td>Étanchéité thermique de la plaque PCR, feuille d’aluminium, perforable</td><td>Bio-rad</td><td>1814040</td><td>Consommables</td></tr><tr><td>Poly-lysine</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td>Réactifs</td></tr><tr><td>PTC Tempo 96 Thermal Cycler</td><td>Bio-rad</td><td>12015382</td><td>Équipement</td></tr><tr><td>Logiciel QuantaSoft</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Logiciels d’analyse de données PCR</td></tr><tr><td>Kit de test Quant-it RiboGreen et de test ARN</td><td>Thermo Fisher</td><td>R11490</td><td>Réactifs</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio-rad</td><td>1864034</td><td>Réactifs</td></tr><tr><td>Huile de génération de gouttelettes QX200 pour EvaGreen</td><td>Bio-rad</td><td>1864005</td><td>Réactifs</td></tr><tr><td>Générateur de gouttelettes QX200</td><td>Bio-rad</td><td>17005227</td><td>Équipement</td></tr><tr><td>Lecteur de gouttelettes QX200</td><td>Bio-rad</td><td>17005228</td><td>Équipement</td></tr><tr><td>Réactif de Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15-596-026</td><td>Réactifs</td></tr></tbody></table>

isolement et quantification des arnm axonaux à l’aide d’inserts membranaires poreux et rtddpcr

Isolation and Quantification of Axonal mRNAs Using Porous Membrane Inserts and RTddPCR

Les neurones corticaux des rongeurs embryonnaires primaires, les neurones hippocampiques et les BFCN placés sur des inserts de 1 μm recouverts de PLL adhèrent solidement et étendent les neurites à travers la membrane pendant 5 à 7 jours in vitro (DIV). À 11 DIV, les cultures présentent des réseaux denses. Pour les DRG de rats adultes, ajouter une couche de laminine à des inserts de 3 μm recouverts de PLL permet d’obtenir une extension axonale comparable de 5 DIV. Ces observations confirment la capacité des inserts à soutenir la croissance neuronale à long terme et à fournir suffisamment de matériel axonal pour l’extraction d’ARN en aval. En cas de besoin d’échelle, nous combinons plusieurs inserts pour fournir suffisamment de matériau.
L’extraction de TRIzol à partir d’inserts individuels permet de produire suffisamment d’ARN pour la transcription inverse et la ddPCR ultérieure. La quantification RiboGreen confirme des rendements ARN constants provenant des fractions entières des neurones (212,85 ng/insert) et des rendements plus faibles provenant des fractions de neurite (42,75 ng/insert) (Figure 2). On obtient généralement ~5 à 7 fois l’ARN provenant de la fraction entière du neurone par rapport à la fraction enrichie par neurite.
Tous les amorces sont validés avant les expériences RTddPCR. Pour chaque transcript cible, au moins deux ensembles d’amorces sont ordonnés et testés à l’aide de la PCR conventionnelle sur cDNA généré à partir des mêmes échantillons neuronaux. La paire d’amorce produisant la bande la plus forte et la plus spécifique est sélectionnée pour la RTddPCR (Figure 3A). Par exemple, nous avons choisi l’ensemble d’amorces 1 pour Gap43. Dans les cas de résultats ambigus, comme ceux obtenus pour Actγ, nous réalisons une PCR en gradient pour optimiser les températures de recuit (Figure 3B). Cela garantit que seuls des amorces bien validés sont utilisés pour la quantification absolue, réduisant ainsi la probabilité d’artefacts lors de la séparation des gouttelettes.
La procédure de grattage et de prélèvement sépare de manière fiable les compartiments somatiques et névritiques. L’ARN isolé de l’ensemble des fractions neuronales montre un enrichissement de transcriptes, tels que Actγ 46,47,48,49 (Figure 4). En revanche, les fractions d’axons/neurite produisent un ARN total nettement plus faible, cohérent avec leur volume restreint, mais montrent un enrichissement de transcrits connus pour se localiser dans des processus distals, tels que Gap43 (Figure 4). Une détection croisée minimale des transcrits restreints par soma indique une grande pureté compartimentée lorsque les inserts sont manipulés avec soin et placés à une densité optimale.
Les résultats positifs se caractérisent par : (1) une morphologie neuronale intacte avec une extension axonale claire, (2) une séparation nette des compartiments sans rupture de la membrane, (3) des amorces validées produisant une séparation nette entre gouttelettes positives et négatives, et (4) des signaux RTddPCR forts pour les transcrits axonaux. Des expériences sous-optimales entraînent un faible rendement d’ARN, une contamination croisée attestée par des marqueurs de soma dans les fractions de neurites, ou des artefacts RTddPCR tels qu’une augmentation de la « pluie » de gouttelettes due à la dimérisation de l’amorce. Ces problèmes sont le plus souvent liés à des dommages à la membrane d’insert, à une pression de grattage excessive ou à une optimisation insuffisante de la température de recuit des amorces.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1 : Aperçu de l’isolation de l’ARN spécifique au compartiment à l’aide d’inserts membranaires. Les neurones des rongeurs ont été cultivés sur des inserts semi-perméables d’une taille poreuse de 1 à 3 μm, ce qui permet l’extension des neurites tout en restreignant le soma. Pour la préparation du neurone entier, les cellules du compartiment supérieur ont été grattées à l’aide d’un grattoir stérile, comprimées, puis lysées dans du TRIzol pour l’isolement de l’ARN, la synthèse d’ADNc et la RTddPCR. Les débris cellulaires résiduels ont été retirés de la membrane d’insertion à l’aide d’un coton-tige stérile. Pour la préparation des neurites, la membrane d’insertion contenant désormais uniquement des neurites a été inversée et coupée avec une lame de scalpel, puis directement immergée dans le TRIzol, suivie d’une isolation d’ARN, d’une synthèse d’ADNc et d’une RTddPCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2 : Courbe standard de concentration d’ARN à l’aide du test RiboGreen. (A) L’intensité de fluorescence a été mesurée à l’aide du test de quantification de l’ARN RiboGreen à travers une série de dilution d’étalons d’ARN. Une analyse de régression linéaire a révélé une forte corrélation entre la concentration d’ARN et le signal de fluorescence (R² = 0,9956). La valeur R² proche de un démontre une excellente linéarité et fiabilité du test RiboGreen pour une quantification précise de l’ARN. (B) À l’aide de l’équation (y=19,738x + 14,905) pour la pente obtenue dans A, l’ARN total a été calculé pour chaque fraction. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3 : Validation de l’amorce par PCR et électrophorèse sur gel d’agarose. (A) Les produits d’amplification par PCR utilisant cDNA pour Actγ et Gap43 ont été résolus sur un gel d’agarose à 2 % pour évaluer la spécificité de la primer. Pour chaque gène, deux ensembles d’amorces indépendants (ensemble 1 et ensemble 2) ont été testés. Les marqueurs de taille de l’ADN (échelles) sont affichés dans les voies adjacentes avec des poids moléculaires indiqués (10 kb, 0,5 kb, 0,1 kb). Des bandes simples distinctes de taille attendue confirment une amplification réussie et la spécificité des ensembles d’amorces sélectionnés. (B) L’amplification par PCR a été réalisée à l’aide d’un amorce Actγ placé 2 sur un gradient de température (55-65 °C) afin de déterminer la température optimale de recuit. Les produits amplifiés ont été résolus sur un gel d’agarose à 2 % à côté d’une échelle ADN (voie 2, tailles indiquées). Des bandes uniques constantes de la taille attendue ont été observées sur toute la plage testée, l’amplification la plus forte étant détectée à 55 °C, ce qui suggère que c’est la température optimale pour cet ensemble d’amorces. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig3v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Figure 4 : Analyse RTddPCR de transcrits sélectionnés et quantification des copies d’ARNm. (A,B) Graphiques d’amplitude unidimensionnelle représentatifs montrant la séparation des gouttelettes pour (A) Actγ et (B) Gap43. Chaque point représente une gouttelette unique, les gouttelettes bleues indiquant l’amplification positive et les gouttelettes grises indiquant l’amplification négative. L’axe Y représente l’amplitude, et l’axe X indique la position du puits dans la plaque ddPCR. Une séparation nette entre les gouttelettes positives (bleues) et négatives (grises) confirme une détection robuste des transcriptions cibles avec les ensembles d’amorces indiqués. (C) Tableau résumant le nombre de copies/μL et les copies par ng d’ARN total pour les transcriptes Actγ et Gap43 dans les fractions de neurones entiers et de neurites. Les estimations du nombre de copies ont été obtenues à partir de quantification absolue à l’aide des comptages de gouttelettes ddPCR (illustrés dans les panneaux A, B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.</a>

Isolement et quantification des ARNm axonaux à l’aide d’inserts membranaires poreux et RTddPCR

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