Silenciamento de BRCA2 Identificar funções biológicas regulada-BRCA2 romance em células humanas de cultura

O objetivo geral deste procedimento é silenciar a expressão de B RCA dois por transfecção de SIR A. Isso é feito preparando primeiro os complexos reagentes de transfecção SIR a. Em seguida, uma primeira rodada de transfecção é realizada adicionando complexos gota a gota a uma monocamada de células que estão em 80% de fluência de co. Em seguida, uma segunda rodada de SIR uma transfecção é realizada usando uma proporção mais alta de SIR, A para reagente de transfecção.

Finalmente, as monocamadas de células lavadas com PBS gelado e as células são lisadas a quatro graus Celsius com um tampão de lise à base de detergente. Em última análise, a análise de Western blotting é usada para mostrar B RCA A dois silenciamento no nível da proteína. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes é que ela permite o silenciamento eficiente de genes, bem como a detecção ideal de proteínas de alto peso molecular, como o supressor de tumor B RCA dois Para começar após o crescimento de monocamadas de células epiteliais humanas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em uma câmara umidificada, remova o meio de crescimento e use PBS em temperatura ambiente para lavar as células.

Para separar as células da placa, adicione dois mililitros de solução de EDTA 0,25% tripsina 0,53 milimolar e incube por três a cinco minutos, dependendo do tipo de célula. Neutralize a tripsina adicionando dois mililitros de meio de crescimento completo contendo 10% de FBS antes de transferir as células para um tubo de 15 mililitros. Coloque os tubos em um rotor de caçamba oscilante e centrifugue a 320 a 330 Gs e quatro graus Celsius por três minutos.

Use cinco mililitros de meio livre de antibióticos para ressuspender os pellets antes de usar uma câmara de burker ou sistema de contagem automatizado para contar as células. Em seguida, coloque aproximadamente 0,5 a uma vezes 10 para as seis células em dois mililitros de meio livre de antibióticos em cada poço de seis placas de poços e incube por 24 horas a 80% de fluência. Após a incubação, prossiga com uma primeira rodada de transfecção diluindo seis microlitros de reagente de transfecção específico para irna à base de lipídios em 130 microlitros de meio de soro reduzido.

Diluir três microlitros de Sirna 10 micromolares em 130 microlitros de meio sérico reduzido. Combine o irna diluído com um reagente de transfecção diluído e incube por cinco a 10 minutos em temperatura ambiente. Durante a incubação, remova o meio das células e adicione dois mililitros de meio fresco sem antibióticos.

Pré-aqueça a 37 graus Celsius. Em seguida, 250 microlitros dos complexos de reagentes de transfecção de siRNA para cada poço de células em uma placa de seis poços. Em seguida, incube as células em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

Após 24 horas, diluir cinco microlitros de 10 microlitros de irna micromolar em 130 microlitros de meio sérico reduzido e prosseguir com uma segunda rodada de transfecção é apenas demonstrado. A alta concentração de sarna na segunda rodada é essencial para obter alta eficiência de B rca. Um silenciamento de dois.

Incube as células a 37 graus Celsius por um a dois dias antes da análise para preparar o lisado celular para análise de immuno blotting. Prepare um novo tampão de lise de acordo com a receita mostrada aqui. Remova o meio das células e adicione dois mililitros por poço de PBS gelado para lavar as células.

Depois de remover completamente o PBS da placa e adicionar 200 microlitros de tampão de lise gelada a cada um. Gire suavemente a placa para distribuir uniformemente o tampão de lise e incube em um rotador a quatro graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, usando um raspador de células.

Colete o lisado celular em um tubo de microcentrífuga em centrífuga de gelo a 17.900 Gs e quatro graus Celsius por 25 minutos e colete o supernat para realizar a análise de immunoblotting. Prepare o tampão de corrida diluindo 50 mililitros de 20 x tris acetato SDS com 950 mililitros de água destilada. Prepare a amostra da seguinte forma.

Adicione 15 microgramas de lisado celular total. Cinco microlitros de quatro x tampão de amostra contendo sulfato de lítio ESAL pH 8,42 microlitros de 0,5 molar DTT e tampão de lise para um volume total de 20 microlitros. Desnature as amostras a 55 graus Celsius por 10 minutos.

É crucial usar essa temperatura, pois a proteína b RCA two é termossensível. Em seguida, configure a câmara eletroforética de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, carregue as amostras em 10 microlitros de um padrão de proteína de alta coloração de peso molecular em um gel pré-moldado e execute a 120 volts por cerca de duas horas.

Enquanto isso, prepare o tampão de transferência com 50 mililitros de tampão de transferência 20 x, 100 mililitros de metanol 100% e 850 mililitros de água. Ative a membrana de PVDF embebendo em 100% de metanol por cinco minutos. Enxágüe com água destilada e equilibre em tampão de transferência por pelo menos cinco minutos.

Mergulhe as esponjas do aparelho de transferência em tampão de transferência a quatro graus Celsius até o uso. Pare a corrida antes que o marcador azul de 55 kilodalton deixe o gel pré-moldado e monte o sanduíche começando com três esponjas embebidas em tampão de transferência. Em seguida, um papel de três mm saturado em tampão de transferência.

Em seguida, adicione o gel, depois a membrana PVDF ativada, seguida por um papel de grau 3M embebido em tampão e, finalmente, três esponjas embebidas. Coloque a pilha no aparelho e transfira as proteínas a 350 miliamperes por quatro horas e quatro graus Celsius ou a 180 miliamperes e quatro graus Celsius durante a noite. Após a transferência, use TBS para lavar a membrana e bloquear por uma hora com TBST e leite em pó desnatado a 5%.

Em seguida, substitua o tampão por nove mililitros de tampão de leite TBST contendo 30 microlitros de anticorpo policlonal anti-BCA dois coelhos e incube a quatro graus Celsius durante a noite. Depois de usar TBST para lavar a membrana três vezes por 10 minutos cada, incubar o filtro por uma hora com um microlitro de anticorpo secundário anti-coelho conjugado com peroxidase de rabanete diluído em 10 mililitros de tampão de leite TBST. Depois de lavar a membrana três vezes, execute a imunodetecção de luminescência KEMMA seguindo as instruções do fabricante.

Visualize as bandas em filmes ECL de alta resolução para confirmar a especificidade de B rca. Um silenciamento de dois. Uma irna embaralhada foi usada lado a lado com B RCA dois irna como mostrado aqui, como mencionado anteriormente, é importante realizar uma segunda rodada de transfecção de irna com uma alta proporção de irna para transfecção para obter uma alta eficiência de silenciamento B RCA A dois.

Os resultados aqui mostram a diferença na eficiência de knockdown entre o uso de uma proporção baixa e alta de siRNA para transfecção, dependendo do tipo de célula. O tempo mínimo ideal para obter o nível mais alto de silenciamento gênico pode variar após a segunda rodada de transfecção de siRNA, por exemplo, como mostrado nesta figura, 24 horas são suficientes para células tireoidianas NTHY, mas até 48 horas são necessárias para um knockdown eficiente de B RCA A dois em PNT um A células da próstata b RCA dois silenciamento é bastante estável até o sétimo dia após a segunda rodada de transfecção. Como mencionado anteriormente, a desnaturação dos lisados celulares a uma temperatura acima de 55 graus Celsius resulta em até 50% de perda da proteína B RCA A dois.

Neste experimento, a sensibilidade de B RCA A duas células PNT silenciadas e uma A ao inibidor de PARP rucaparib foi examinada após um tratamento de 24 horas com a droga. Uma diminuição dependente do tempo na proliferação celular foi observada em B RCA duas células PNT e A empobrecidas em comparação com os controles. Depois de assistir a este vídeo, ele deve ter uma boa compreensão de como silenciar genes codificadores de proteínas longas por um CRNA e como detectar com eficiência seu produto proteico por meio de um procedimento de imunobloqueio otimizado além do BRC dois.

Esta questão pode ser aplicada a muitas outras proteínas grandes desafiadoras, particularmente quando são expressas em níveis muito baixos nas células.