Utilizando Genómica Funcional de triagem para identificar alvos de drogas potencialmente romance em Spheroid culturas de células de câncer
26 de dezembro de 2016
Identificar novos alvos de medicamentos que fazem a transição de testes pré-clínicos para testes em humanos é uma prioridade científica. Para esse fim, descrevemos aqui uma abordagem genômica funcional para examinar o impacto da depleção de genes em esferóides de linhas de células cancerígenas, que modelam mais apropriadamente cânceres humanos in vivo.
O objetivo deste protocolo de triagem de siRNA é investigar o impacto do silenciamento de genes no crescimento de esferóides de linhas de células cancerígenas. Em comparação com as técnicas tradicionais de cultura de células bidimensionais, os esferoides de câncer exibem condições mais semelhantes às encontradas em tumores in vivo. Este método é útil para a avaliação funcional de genes frequentemente alterados em cânceres humanos e, mais importante, pode ser usado para determinar quais genes são potenciais oncogenes ou supressores de tumor em condições de cultura mais complexas, como as observadas em cultura tridimensional e, em particular, sob hipóxia.
A principal vantagem dessa técnica é que ela é facilmente adaptável para que os pesquisadores possam usá-la para estudar seus genes específicos de interesse em suas linhagens celulares preferidas. Acreditamos que ele se baseia nas atuais abordagens de triagem de sRNA direcionadas. É geralmente apreciado que as telas direcionadas, em vez de cepas do genoma inteiro, permitem que os cientistas façam perguntas específicas e gerem resultados mais robustos.
Analisamos o efeito do silenciamento de genes na viabilidade e tamanho dos esferóides, mas você também pode usar corantes biométricos para uma leitura de tela diferente, como apoptose. Demonstrando o procedimento está Patty Wai do nosso laboratório. Comece descongelando placas de 96 poços contendo a biblioteca de siRNA à temperatura ambiente.
Em seguida, gire por cinco minutos a 1.000 vezes g, usando uma centrífuga de bancada. Use uma pipeta multicanal para adicionar 10 microlitros de meio de soro reduzido contendo o reagente de transfecção otimizado aos poços de cada placa. Incube por 15 minutos para permitir a formação de complexos de transfecção, contendo siRNA.
Como em qualquer pipeline de triagem, a capacidade de formação de esferoides de linhagens celulares em condições de transfecção deve ser otimizada de forma robusta antes de realizar a tela inteira. Em seguida, tripsinize as células a serem rastreadas até que se desprendam do frasco. Uma vez que as células tenham se desprendido, neutralize a tripsina com um volume apropriado de meio específico da linhagem celular, transfira para um tubo de centrífuga e gire por cinco minutos a 1.000 vezes g em uma centrífuga de bancada para coletar as células.
Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento para uma suspensão unicelular com um volume adequado de meio. Execute uma contagem de células usando um contador de células automatizado. Em seguida, dilua a suspensão para 5.000 células por 180 microlitros com meio frio.
Transfira a suspensão da célula para um reservatório. Usando uma pipeta multicanal, ajustada para 180 microlitros, pipeta para misturar e transferir a suspensão celular para a placa de 96 poços contendo o siRNA. Centrifugue a placa a 1.000 vezes g em uma centrífuga pré-resfriada a 4 graus Celsius por 10 minutos e, em seguida, incube a placa em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius.
Neste ponto, as células aparecerão como um mosaico no fundo dos poços. Após 24 horas, observe as células ao microscópio. Neste ponto, as células devem ser agregadas para formar um único esferóide no centro do poço.
Adicione 100 microlitros de meio completo a cada poço para estimular o crescimento antes de retornar à incubadora. Após três dias de crescimento, remova suavemente 100 microlitros de meio de cada poço e adicione 100 microlitros de meio fresco. No sétimo dia, examine os esferoides ao microscópio e, em seguida, quantifique o tamanho do esferóide em um leitor de placas que possa monitorar quantitativamente o crescimento do esferóide ao longo do tempo.
Para quantificar o tamanho do esferoide, primeiro abra o software no computador. Selecione a placa de 96 poços, selecione o tipo de placa apropriado e insira um nome de experimento. Em seguida, insira a placa de 96 poços contendo os esferoides em um citômetro de imagem de placa de micropoço de bancada.
Em seguida, selecione o aplicativo Tumorsphere. Selecione o foco baseado em imagem para alterar o foco para que o esferóide fique em foco e tenha o contraste ideal. Selecione os poços que requerem varredura e inicie a varredura.
Em seguida, certifique-se de que a máscara do objeto represente com precisão o tamanho do esferoide. Para esferoides BT474 cultivados por sete dias, ajuste a Precisão para Alta e defina o Diâmetro mínimo da Colônia para 200 mícrons. Use a função Exportar para exportar os dados na forma de um arquivo de dados anotado que será analisado para identificar siRNAs com um efeito estatisticamente significativo na área do esferóide.
Após a imagem, remova 100 microlitros de meio de cada poço e adicione 100 microlitros de corante de viabilidade luminescente para determinar a viabilidade celular. Depois de incubar as placas por 15 minutos, escaneie a placa usando um leitor de placas luminescentes. Este protocolo também pode ser adaptado para uso com outras linhagens de células cancerígenas.
O procedimento de transfecção reversa de controles não direcionados não afetou significativamente a viabilidade de nenhuma das linhagens testadas, enquanto a transfecção de ubiquitina B, um controle positivo de morte celular, diminuiu significativamente a viabilidade. As células BT474 foram transfectadas reversamente com a biblioteca de siRNA siGENOME humano de 200 genes em triplicata. Área esferóide e viabilidade foram observadas.
Foram identificados outliers significativos com escore z maior que 1,7. Os SiRNAs que aumentaram ou reduziram significativamente a área e a viabilidade do esferóide estão sombreados em azul e o vermelho representa os siRNAs de controle. Este conjunto de micrografias mostra imagens representativas de esferoides BT474 sete dias após a transfecção reversa com E-Cadherin, um controle não direcionado, PIK3CA, ERBB2 ou SF3B1 siRNA.
Este histograma mostra como o tratamento com cada siRNA afetou a viabilidade celular sete dias após a transfecção reversa. O knockdown de ERBB2 e PIK3CA reduziu significativamente a viabilidade celular em comparação com os controles. Esta imagem demonstra que os esferóides podem ser imunomarcados com sucesso para revelar o impacto do silenciamento de genes nas proteínas-alvo.
Uma vez dominados, várias centenas de genes podem ser rastreados em várias linhagens celulares em um dia, e isso permite a identificação robusta de genes potencialmente novos importantes para a sobrevivência em cultura tridimensional. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cultivar com sucesso esferóides de células cancerígenas que são passíveis de silenciamento de genes mediado por sRNA. Você também poderá investigar o impacto do silenciamento de genes realizando imuno-histoquímica nos esferóides.
Isso pode oferecer informações espaciais valiosas que podem informá-lo sobre a biologia subjacente.
Visão Geral
Este artigo apresenta uma abordagem de genômica funcional para identificar potenciais alvos terapêuticos examinando os efeitos da depleção gênica em esferoides de linhagens celulares de câncer. Esses esferoides fornecem um modelo mais preciso de tumores humanos in vivo em comparação com as culturas 2D tradicionais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Genômica Funcional
- Biologia do Câncer
- Técnicas de Cultura Celular
Fundo
- O silenciamento gênico pode revelar oncogenes e supressores tumorais.
- Esferoides de câncer imitam o microambiente tumoral mais de perto do que culturas 2D.
- A triagem direcionada de siRNA permite a investigação específica de genes.
- Condições hipóxicas podem ser estudadas usando este método.
Objetivo do Estudo
- Investigar o impacto do silenciamento gênico no crescimento de esferoides de câncer.
- Identificar genes que possam servir como novos alvos terapêuticos.
- Melhorar a compreensão da função gênica em um ambiente de cultura 3D.
Métodos Utilizados
- Triagem de siRNA em esferoides de linhagens celulares de câncer.
- Otimização das condições de transfecção para formação robusta de esferoides.
- Quantificação do tamanho e viabilidade dos esferoides usando citometria de imagem.
- Análise dos efeitos do silenciamento gênico na viabilidade e crescimento celular.
Principais Resultados
- Efeitos significativos de siRNAs específicos na viabilidade e tamanho dos esferoides foram observados.
- A redução de ERBB2 e PIK3CA diminuiu a viabilidade celular em comparação com os controles.
- Identificação robusta de genes importantes para a sobrevivência na cultura 3D foi alcançada.
- Adaptabilidade do método para várias linhagens celulares de câncer foi demonstrada.
Conclusões
- Esta abordagem permite a triagem de centenas de genes em um único dia.
- Fornece uma ferramenta valiosa para identificar potenciais alvos terapêuticos no câncer.
- O método melhora a compreensão da função gênica em um contexto mais fisiologicamente relevante.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Functional genomics screening in 3D cancer spheroid models enhances target validation by revealing gene dependencies under physiologically relevant conditions. This approach improves predictive confidence in identifying novel drug targets by capturing tumor microenvironment influences often missed in 2D cultures. The method supports early discovery decisions by linking gene silencing effects to spheroid growth and viability, enabling mechanistic de-risking of candidate targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by assessing the impact of gene silencing on cancer spheroid growth and viability.
- Operational Value: Enables functional assessment of frequently altered genes in human cancers under complex culture conditions.
- Predictive Value: Identifies potential oncogenes or tumor suppressors that are critical for survival in 3D culture, supporting target prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Utilizes siRNA screening to generate quantitative readouts of spheroid area and viability for gene effect analysis.
- Operational Value: Requires optimization of transfection conditions and spheroid formation capacity to ensure robust and reproducible screening outcomes.
- Assay Readiness: Employs imaging cytometry and luminescent viability dyes to enable high-content, quantitative monitoring of spheroid growth over time.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Confirms spatial impact of gene dependencies via immunohistochemistry, linking molecular findings to protein-level changes in spheroids.
- Preclinical Continuity: Demonstrates dependency on HER2 amplification and PIK3CA mutation in BT474 spheroids, validating known cancer drivers in a 3D model.
- Mechanistic De-risking: Provides spatial and functional validation of gene effects, reducing ambiguity in target mechanism before downstream investment.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through lead optimization, particularly for targets requiring validation in complex, hypoxia-prone tumor models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking gene knockdown to spheroid viability and size changes.
- Screening: Enables assay standardization through reverse transfection protocols and standardized spheroid formation in 96-well formats.
- Analytics: Generates quantitative spheroid area and viability data via imaging cytometry and luminescent readouts, enabling statistical identification of significant hits (e.g., z-score >1.7).
- Translational Research: Connects gene silencing effects to spatial protein expression via immunohistochemistry, enhancing biomarker alignment and mechanistic insight.
- Enterprise Reuse: Adaptable across cancer cell lines and siRNA libraries, positioning it as a reusable platform for target validation campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by revealing gene dependencies in a tumor-relevant 3D context.
- Operational Value: Promotes reproducibility through standardized spheroid formation, transfection optimization, and quantitative imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing false positives from 2D models and increasing confidence in target essentiality.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional evidence from physiologically relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, transfection techniques, and 3D model handling to ensure robust spheroid formation.
- Dependent on access to imaging cytometry and luminescent plate readers for quantitative spheroid size and viability assessment.
- Necessitates optimization of transfection conditions and cell density (5,000 cells/180 µL) for consistent spheroid formation across wells.
- Requires adaptation considerations when extending to other cancer cell lines or hypoxia-modulated conditions.
- Practical limitation: Screening throughput depends on siRNA library size and imaging capacity, though hundreds of genes can be screened per day once optimized.
