Utilizando Genómica Funcional de triagem para identificar alvos de drogas potencialmente romance em Spheroid culturas de células de câncer

Identificar novos alvos de medicamentos que fazem a transição de testes pré-clínicos para testes em humanos é uma prioridade científica. Para esse fim, descrevemos aqui uma abordagem genômica funcional para examinar o impacto da depleção de genes em esferóides de linhas de células cancerígenas, que modelam mais apropriadamente cânceres humanos in vivo.

O objetivo deste protocolo de triagem de siRNA é investigar o impacto do silenciamento de genes no crescimento de esferóides de linhas de células cancerígenas. Em comparação com as técnicas tradicionais de cultura de células bidimensionais, os esferoides de câncer exibem condições mais semelhantes às encontradas em tumores in vivo. Este método é útil para a avaliação funcional de genes frequentemente alterados em cânceres humanos e, mais importante, pode ser usado para determinar quais genes são potenciais oncogenes ou supressores de tumor em condições de cultura mais complexas, como as observadas em cultura tridimensional e, em particular, sob hipóxia.

A principal vantagem dessa técnica é que ela é facilmente adaptável para que os pesquisadores possam usá-la para estudar seus genes específicos de interesse em suas linhagens celulares preferidas. Acreditamos que ele se baseia nas atuais abordagens de triagem de sRNA direcionadas. É geralmente apreciado que as telas direcionadas, em vez de cepas do genoma inteiro, permitem que os cientistas façam perguntas específicas e gerem resultados mais robustos.

Analisamos o efeito do silenciamento de genes na viabilidade e tamanho dos esferóides, mas você também pode usar corantes biométricos para uma leitura de tela diferente, como apoptose. Demonstrando o procedimento está Patty Wai do nosso laboratório. Comece descongelando placas de 96 poços contendo a biblioteca de siRNA à temperatura ambiente.

Em seguida, gire por cinco minutos a 1.000 vezes g, usando uma centrífuga de bancada. Use uma pipeta multicanal para adicionar 10 microlitros de meio de soro reduzido contendo o reagente de transfecção otimizado aos poços de cada placa. Incube por 15 minutos para permitir a formação de complexos de transfecção, contendo siRNA.

Como em qualquer pipeline de triagem, a capacidade de formação de esferoides de linhagens celulares em condições de transfecção deve ser otimizada de forma robusta antes de realizar a tela inteira. Em seguida, tripsinize as células a serem rastreadas até que se desprendam do frasco. Uma vez que as células tenham se desprendido, neutralize a tripsina com um volume apropriado de meio específico da linhagem celular, transfira para um tubo de centrífuga e gire por cinco minutos a 1.000 vezes g em uma centrífuga de bancada para coletar as células.

Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento para uma suspensão unicelular com um volume adequado de meio. Execute uma contagem de células usando um contador de células automatizado. Em seguida, dilua a suspensão para 5.000 células por 180 microlitros com meio frio.

Transfira a suspensão da célula para um reservatório. Usando uma pipeta multicanal, ajustada para 180 microlitros, pipeta para misturar e transferir a suspensão celular para a placa de 96 poços contendo o siRNA. Centrifugue a placa a 1.000 vezes g em uma centrífuga pré-resfriada a 4 graus Celsius por 10 minutos e, em seguida, incube a placa em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius.

Neste ponto, as células aparecerão como um mosaico no fundo dos poços. Após 24 horas, observe as células ao microscópio. Neste ponto, as células devem ser agregadas para formar um único esferóide no centro do poço.

Adicione 100 microlitros de meio completo a cada poço para estimular o crescimento antes de retornar à incubadora. Após três dias de crescimento, remova suavemente 100 microlitros de meio de cada poço e adicione 100 microlitros de meio fresco. No sétimo dia, examine os esferoides ao microscópio e, em seguida, quantifique o tamanho do esferóide em um leitor de placas que possa monitorar quantitativamente o crescimento do esferóide ao longo do tempo.

Para quantificar o tamanho do esferoide, primeiro abra o software no computador. Selecione a placa de 96 poços, selecione o tipo de placa apropriado e insira um nome de experimento. Em seguida, insira a placa de 96 poços contendo os esferoides em um citômetro de imagem de placa de micropoço de bancada.

Em seguida, selecione o aplicativo Tumorsphere. Selecione o foco baseado em imagem para alterar o foco para que o esferóide fique em foco e tenha o contraste ideal. Selecione os poços que requerem varredura e inicie a varredura.

Em seguida, certifique-se de que a máscara do objeto represente com precisão o tamanho do esferoide. Para esferoides BT474 cultivados por sete dias, ajuste a Precisão para Alta e defina o Diâmetro mínimo da Colônia para 200 mícrons. Use a função Exportar para exportar os dados na forma de um arquivo de dados anotado que será analisado para identificar siRNAs com um efeito estatisticamente significativo na área do esferóide.

Após a imagem, remova 100 microlitros de meio de cada poço e adicione 100 microlitros de corante de viabilidade luminescente para determinar a viabilidade celular. Depois de incubar as placas por 15 minutos, escaneie a placa usando um leitor de placas luminescentes. Este protocolo também pode ser adaptado para uso com outras linhagens de células cancerígenas.

O procedimento de transfecção reversa de controles não direcionados não afetou significativamente a viabilidade de nenhuma das linhagens testadas, enquanto a transfecção de ubiquitina B, um controle positivo de morte celular, diminuiu significativamente a viabilidade. As células BT474 foram transfectadas reversamente com a biblioteca de siRNA siGENOME humano de 200 genes em triplicata. Área esferóide e viabilidade foram observadas.

Foram identificados outliers significativos com escore z maior que 1,7. Os SiRNAs que aumentaram ou reduziram significativamente a área e a viabilidade do esferóide estão sombreados em azul e o vermelho representa os siRNAs de controle. Este conjunto de micrografias mostra imagens representativas de esferoides BT474 sete dias após a transfecção reversa com E-Cadherin, um controle não direcionado, PIK3CA, ERBB2 ou SF3B1 siRNA.

Este histograma mostra como o tratamento com cada siRNA afetou a viabilidade celular sete dias após a transfecção reversa. O knockdown de ERBB2 e PIK3CA reduziu significativamente a viabilidade celular em comparação com os controles. Esta imagem demonstra que os esferóides podem ser imunomarcados com sucesso para revelar o impacto do silenciamento de genes nas proteínas-alvo.

Uma vez dominados, várias centenas de genes podem ser rastreados em várias linhagens celulares em um dia, e isso permite a identificação robusta de genes potencialmente novos importantes para a sobrevivência em cultura tridimensional. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cultivar com sucesso esferóides de células cancerígenas que são passíveis de silenciamento de genes mediado por sRNA. Você também poderá investigar o impacto do silenciamento de genes realizando imuno-histoquímica nos esferóides.

Isso pode oferecer informações espaciais valiosas que podem informá-lo sobre a biologia subjacente.