Name: Kupffer cellule disolement pour les essais de toxicité des nanoparticules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Apprenez l'isolation de cellules de Kupffer murines par perfusion hépatique et centrifugation en gradient de densité pour évaluer la toxicité des nanoparticules. Cette méthode fournit des cultures de haute pureté pour la nanotoxicologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par le programme RADDEL du réseau Marie-Curie FP7-ITN de l’UE. MB et KAJ tiennent à remercier Joe Varguese et Rui Serra Maia pour leur aide et leurs suggestions tout au long de l’optimisation de l’isolement des cellules de Kupffer.

Toutes les expériences sur les animaux ont été exécutés en conformité avec toutes les directives, les règlements et les organismes de réglementation. Le protocole en démonstration a été réalisée sous la direction et l&#39;approbation de la réglementation de bureau au Royaume-Uni Accueil 1. Perfusion et Cell Collection (Figure 1) <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig1.jpg" /> Figure 1:. Foie Perfusion Après l&#39;anesthésie de la souris, le tube digestif est déplacé latéralement vers la gauche de l&#39;abdomen afin de rendre la veine porte (PV) accessible. Le PV est pourvue d&#39;une canule en utilisant une faible vitesse d&#39;écoulement (3.1 ml / min) de la solution d&#39;EGTA / HBSS et la Veina cave inférieure (VCI) est rompue immédiatement pour éviter toute surpression à l&#39;intérieur du foie. Au sein de la première minute de la perfusion, le débit est progressivement augmentée à 7 ml / min. La solution la collagénase est ensuite perfusé à 10 ml / min jusqu&#39;à ce que sa digestion complète est obtenue. <ol><li> Prepare fraîchement tous les réactifs décrits dans la table des matières. </li><li> Réchauffez la EGTA (Ethylene Glycol Tetra-acétique) / HBSS (solution saline équilibrée de Hank) Solution (50 ml par souris) et la solution la collagénase (100 ml par souris) pendant 30 min à 40 ° C. </li><li> Rincer le tube flexible de la pompe d&#39;abord avec 70% d&#39;éthanol. Verser 40 ml d&#39;EGTA / HBSS Solution dans un tube de centrifugeuse immergé dans le bain d&#39;eau et rincer le tube flexible de la pompe avec / HBSS Solution EGTA préchauffé. </li><li> Effectuer anesthésie terminale en utilisant un barbiturique à produire de manière fiable l&#39;inconscience avant la dépression respiratoire et la mort. Injecter phénobarbital à 1 mg / kg, ip dans une souris CD1 femelle ou mâle (35-45 g). Confirmez l&#39;anesthésie par pincement orteil. </li><li> Raser les poils abdominaux et stériliser la surface abdominale en utilisant une solution d&#39;éthanol à 70%. </li><li> Couper à travers la cavité abdominale et exposer la veine porte et la veine cave inférieure en déplaçant latéralement l&#39;intestin à la gauche de l&#39;abdomen. </li><li> Étoilet la pompe à une vitesse de 1-3 ml / min avec la solution EGTA / HBSS et cathétériser la veine porte en utilisant une aiguille 23 g de papillon (ailes coupées). Fixer la section de la veine porte canule avec l&#39;aiguille de 23 G et puis retournez les forceps serrefine à la surface de l&#39;abdomen de la souris ouvert. Le foie devrait rapidement pâle dans le 30 premières secondes de la perfusion EGTA / HBSS Solution. </li><li> Inciser rapidement la partie inférieure de la veine cave inférieure pour éviter la construction de surpression dans le foie, et ensuite augmenter le débit progressivement à 7 ml / min, au cours de la première minute de la perfusion. L&#39;animal meurt en raison de saignements secondaire à la veine cave ponction veineuse. </li><li> Lorsque moins de 5 ml de EGTA / HBSS Solution restante dans le tube de la centrifugeuse, le remplir avec Solution collagénase (40-50 ml). Augmenter le débit progressivement à 10 ml / min, 30 sec. </li><li> Faire la houle du foie en appliquant une pression à la veine cave inférieure, en utilisant des pinces, pour les 5-10 secondes d&#39;intervalle. This peut être fait périodiquement (5-10 fois au cours de la digestion). Cette étape permettra d&#39;améliorer la dissociation des cellules du foie et de réduire le temps de perfusion de collagénase. </li><li> Lorsque moins de 10 ml de solution de collagénase reste dans le tube de centrifugation, verser 40 à 50 ml de solution de collagénase préchauffé dans le tube de centrifugeuse. </li><li> Après 10-15 minutes de la perfusion et environ 70-80 ml de collagénase Solution perfusés, appliquer une petite pression sur la surface du foie avec une pince. Une copie de la pression indique que les cellules du foie sont dissociés. </li><li> Retirer le foie de la cavité abdominale d&#39;une seule pièce et le placer dans un tube de centrifugeuse contenant 20 à 30 ml de cellules de Kupffer Isolation moyenne. Gardez les cellules du foie sur la glace ou à 4 ° C pendant une période maximale de 3 heures pour éviter d&#39;affecter la viabilité des cellules du foie. </li><li> Répétez la procédure de perfusion sur plusieurs animaux en cas de besoin, tout en gardant le foie perfusé sur la glace. Piscine de une à trois foies pour la purification et de procéder à l&#39;étape 3. </li></ol> 2. Préparation du gradient de densité de centrifugation (figure 2) <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig2.jpg" /> Figure 2:. Préparation du gradient de densité Toutes les procédures sont effectuées dans des conditions stériles. Le protocole SIP est préparée en mélangeant 15,3 ml de solution de particules de silice revêtu avec 1,7 ml de 10 x PBS. A 5 ml de SIP sont mélangés avec 15 ml de PBS pour faire SIP solution 20 ml de 25%. 10 ml de SIP sont mélangés avec 10 ml de PBS pour faire une solution de 20 ml de SIP à 50%. Un tube de centrifugation contenant la solution à 50% de SIP (20 ml) est inclinée et la solution SIP à 25% (20 ml) est lentement ajouté en utilisant une pipette sérologique de 25 ml. <ol><li> Suivez les étapes suivantes (section 2., 3. et 5.) dans des conditions stériles et garder les cellules sur la glace ou à 4 ° C. Préparer le SIP (solution de particules de silice revêtues isotonique) en mélangeant 15,3 ml de solution de particules de silice enrobée avec 1,7 ml de 10 x PBS. </li&gt; <li> Pour faire 20 ml de solution SIP 25%, mélanger 5 ml de SIP avec 15 ml de PBS. Pour 20 ml de solution de SIP à 50%, mélanger 10 ml de SIP avec 10 ml de PBS. </li><li> Remplir un tube à centrifuger de 20 ml de la solution de SIP à 50%. Incliner le tube de centrifugeuse à un angle proche de 90 ° et ajouter lentement la solution de SIP à 25% (20 ml) sur la paroi latérale du tube en utilisant une 25 ml pipette sérologique, sans toucher la surface de la couche de protocole SIP à 50%. Lors de l&#39;ajout de la solution SIP de 25%, réduire progressivement l&#39;angle du tube. Gardez le gradient de densité sur la glace jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 3. cellules de Kupffer Purification (Figure 3) <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig3.jpg" /> Figure 3:. Purification des cellules de Kupffer par gradient de densité centrifugation et l&#39;adhésion cellulaire Toutes les procédures sont effectuées dans des conditions stériles. (A) Après rupture de la capsule de Glisson la, les cellules du foie sont filtrés à travers un 100 um crépine. La suspension est centrifugée à 50 x g à jeter hépatocytes (pellets) et recueillir la fraction de cellules non parenchymateuses (surnageant). Cette étape est répétée trois fois. Les cellules non-parenchymales sont ajoutés au-dessus d&#39;un gradient discontinu isotonique et centrifugées à 800 xg pendant 15 min. Les cellules de Kupffer recueillies à partir du SIP coussin de 25% sont purifiés en outre par la sélection de l&#39;adhésion cellulaire. (B) Les cellules sont étalées dans une plaque à 24 puits et incubées à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 30 minutes. Les cellules non adhérentes sont lavées une fois avec 500 ul de HBSS. Les cellules de Kupffer afficher leur adhérente morphologie 4 heures après l&#39;étalement, lorsque -CNTs f peuvent être ajoutés aux cellules. La barre d&#39;échelle représente 25 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52989/52989fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <ol><li> Mettez un foie perfusé dans une boîte de Petri avec 15 ml de cellules de Kupffer Isolation moyenne. La rupture de la capsule de Glisson la (membrane du foie) en utilisant des ciseaux et libérer toutes les cellules du foie dans le milieu d&#39;isolement des cellules de Kupffer. Filtrer la solution à une cellule si tamis 100 um pour être recueilli dans un tube de centrifugation. Répétez la procédure de perfusion sur foies perfusés supplémentaires et mettre en commun les cellules dans le même tube de centrifugeuse (15 ml à partir d&#39;une souris, jusqu&#39;à 45 ml de trois souris). </li><li> Centrifuger la suspension cellulaire à 50 g pendant 2 min à 4 ° C. Les cellules parenchymateuses (hépatocytes) seront dans le culot et les cellules non-parenchymales (y compris les cellules de Kupffer) seront dans le surnageant. </li><li> Récupérer le surnageant dans un tube à centrifuger propre et centrifuger à 50 x g pendant 2 min chacun. Répétez cette étape trois fois de plus. </li><li> Centrifuger à 1350 xg pendant 15 min pour sédimenter les cellules non parenchymateuses. Jeter le surnageant et remettre le culot dans 10 ml de cellules de Kupffer Isolation moyenne. </li><li> Ajouter la solution de cellules non parenchymateuses du gradient isotonique discontinue 25/50% comme décrit dans 2.3. Centrifuge à 850 g pendant 15 min sans accélération ni pause. </li><li> Localiser la fraction des cellules de Kupffer enrichi trouble apparaissant à l&#39;intérieur de la fraction SIP à 25% près de l&#39;interface SIP 25/50% de (Figure 3). En utilisant une pipette 10 ml sérologique, aspirer environ 12 ml de la fraction enrichie en cellules de Kupffer. Transfert des cellules dans un tube de centrifugeuse contenant 35-40 ml de cellules de Kupffer Isolation moyenne. Mélanger doucement et centrifuger à 1350 g pendant 15 min à 4 ° C pour sédimenter les cellules. </li><li> Jeter les cellules surnageant et remettre en 5-10 ml de pré-chauffé cellules Kupffer milieu de culture. Compter les cellules (Hémocytomètre) et de mesurer la viabilité en utilisant une coloration au bleu trypan. </li><li> Plaque les cellules parenchymateuses non purifiés dans des plaques à 24 puits à une densité de 5 x 10 5 cellules / puits. Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2 (Figure 3). Après 30 min, retirez délicatement le milieu, laver avec préchauffé solution saline équilibrée de Hank (HBSS) une fois puis remplacezavec 500 pi de frais et préchauffé cellules Kupffer milieu de culture (par puits). </li><li> Donner des cellules de Kupffer pendant au moins 4 heures à 37 ° C et 5% de CO 2 avant le traitement avec des nanoparticules, à leur permettre d&#39;acquérir leur morphologie adhérente. </li></ol> 4. Caractérisation <ol><li> Kupffer cellules Pureté <ol><li> Préparer une solution fraîche PBS / BSA utilisé pour maintenir la viabilité des cellules de Kupffer. Laver les cellules une fois avec 500 ul de solution PBS / BSA. Retirer la solution de PBS / BSA et détacher les cellules de Kupffer dans 500 pi de solution fraîche PBS / BSA en utilisant grattant délicatement. Lorsque les cellules sont étalées dans des plaques à 24 puits, de raccourcir les extrémités des lames de raclage avec des ciseaux pour faire le détachement facile de procéder. Transfert cellules dans des tubes de cytométrie en flux. </li><li> Compter les cellules de Kupffer utilisant un hémocytomètre et centrifuger 1 x 10 5 cellules à 1350 x g. Remettre en suspension les cellules de Kupffer dans 30 ul de F4 / 80 anticorps (sans solvant). Bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 30 min. Gardez les cellules non colorées (non incubées avec l&#39;anticorps) sur de la glace. </li><li> Ajouter 2 ml de solution de PBS / BSA dans les cellules colorées, centrifuger à 1350 g pendant 5 minutes et jeter le surnageant résultant. Remettre en suspension les cellules colorées dans 200 ul de PBS / BSA. </li><li> Pour cytométrie de flux, portail 10.000 pas souillé cellules de Kupffer selon leur taille (de diffusion vers l&#39;avant) et la granularité (diffusion latérale). Analyser la fluorescence des cellules gated dans FL-1 canal. </li><li> Répétez la procédure pour les cellules de Kupffer colorées en gardant les mêmes paramètres utilisés pour la cytométrie de flux des cellules de Kupffer non colorées. Sélectionner et quantifier la fluorescence des cellules colorées pour évaluer la pureté des cellules de Kupffer. </li></ol></li><li> Kupffer cellules phagocytaires activité <ol><li> Remplacez le support avec 0,5% (v / v) des billes fluorescentes dans Kupffer milieu de culture cellulaire et incuber pendant 4 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Afin d&#39;éliminer les billes non intériorisées, les cellules de Kupffer de centrifugeuses à 1350 xg, diSCard les cellules surnageant et remettre en suspension dans 500 pi de PBS / BSA Solution. Répétez cette étape deux fois plus. </li><li> Grattez les cellules de Kupffer dans 500 pi de cellules de solutions et de transfert PBS / BSA dans un tube de cytométrie en flux. </li><li> Centrifugeuse cellules Kupffer à 1350 xg, jeter les cellules surnageant et remettre dans 200 pi de PBS / BSA Solution. </li><li> Pour cytométrie de flux, portail 10.000 pas souillé cellules de Kupffer selon leur taille (de diffusion vers l&#39;avant) et la granularité (diffusion latérale). Analyser la fluorescence des cellules gated dans FL-2 canaux. </li></ol></li></ol> 5. Incubation chimiquement fonctionnalisés nanotubes de carbone (f -CNTs) <ol><li> Préparer une dispersion de -CNTs f (1 mg / ml) dans de l&#39;eau par traitement aux ultrasons pendant 15 minutes avant utilisation. -CNTs F sont préparés en interne 22. </li><li> Préparer 2x NTC f- concentrés dispersion dans Kupffer milieu de culture cellulaire. NTC f- Soniquer dispersées dans le milieu pour2 min avant de passer à l&#39;étape 5.3). </li><li> Pour chaque puits, 250 pi de remplacer les anciens médias avec 250 ul de 2x -CNTs f dispersion. Puits non traités (250 pi de milieu conditionné + 250 pl de cellules fraîches Kupffer milieu de culture) et des puits traités avec 10% de DMSO sont utilisées comme contrôle négatif et positif, respectivement. </li><li> Incuber les cellules de Kupffer à 37 ° C et 5% de CO2 pendant 24 ou 72 heures. </li></ol> 6. Évaluation de la toxicité des -CNTs f dans les cellules de Kupffer par la lactate déshydrogénase (LDH) Dosage modification <ol><li> Jeter le surnageant. </li><li> Ajouter 200 pi (par puits de plaque de 24 puits) de tampon de lyse et incuber à 37 ° C pendant 30 min-1 heure. </li><li> Après avoir procédé à un pipetage vigoureux, collecter lysé les cellules de Kupffer dans des tubes de microcentrifugation et centrifuger à 40 000 xg pendant 10 min pour former un culot -CNTs f qui ont été prises par les cellules et les débris cellulaires. </li><li> Recueillir les surnageants (gratuit ƒ-CNT) dansmicrotubes et conserver à -20 ° C ou passez à l&#39;étape 6.5). </li><li> Transférer 50 ul dans une plaque de 96 puits et ajouter un volume égal de la solution substrat de mélange (kit LDH) à chaque puits. Couvrir la plaque et incuber à température ambiante pendant 15 min avant d&#39;ajouter 50 ul de la solution d&#39;arrêt (kit LDH). Ajouter triple de puits à blanc contenant 50 ul de tampon de lyse, 50 pi de solution substrat de mélange et 50 ul de solution d&#39;arrêt. </li><li> Lire l&#39;absorbance à 490 nm dans un lecteur de microplaques et utiliser la formule suivante pour calculer la (%) viabilité cellulaire. </li></ol><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/52989/52989eq1.JPG" />

<ol><li>Hoffmann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+novel+kidney+biomarkers+in+preclinical+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Performance of novel kidney biomarkers in preclinical toxicity studies.</a> Toxicol Sci. 116 (1), 8-22 (2010).</li>
<li>Nel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomaterial+Toxicity+Testing+in+the+21st+Century%3A+Use+of+a+Predictive+Toxicological+Approach+and+High-Throughput+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Nanomaterial Toxicity Testing in the 21st Century: Use of a Predictive Toxicological Approach and High-Throughput Screening.</a> Accounts of Chemical Research. 46 (3), 607-621 (2013).</li>
<li>Bregoli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+antimony+trioxide+nanoparticles+on+human+hematopoietic+progenitor+cells+and+comparison+to+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Toxicity of antimony trioxide nanoparticles on human hematopoietic progenitor cells and comparison to cell lines.</a> Toxicology. 262 (2), 121-129 (2009).</li>
<li>Yamasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Aberrations+and+Cellular+Heterogeneity+in+SV40-Immortalized+Human+Corneal+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology%2C+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Genomic Aberrations and Cellular Heterogeneity in SV40-Immortalized Human Corneal Epithelial Cells.</a> Investigative Ophthalmology, & Visual Science. 50 (2), 604-613 (2009).</li>
<li>Motoyoshi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megalin+contributes+to+the+early+injury+of+proximal+tubule+cells+during+nonselective+proteinuria%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Megalin contributes to the early injury of proximal tubule cells during nonselective proteinuria.</a> Kidney International. 74 (10), 1262-1269 (1038).</li>
<li>Prozialeck, W. C., Edwards, J. R., Lamar, P. C., Smith, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+barrier+characteristics+and+expression+of+cell+adhesion+molecules+in+proximal+tubule-derived+cell+lines+commonly+used+for+in+vitro+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Epithelial barrier characteristics and expression of cell adhesion molecules in proximal tubule-derived cell lines commonly used for in vitro toxicity studies.</a> Toxicology in Vitro. 20 (6), 942-953 (2006).</li>
<li>Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+non-equivalence+of+murine+%28monocyte-%29+macrophage+cells+in+biomaterial+and+inflammatory+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models.</a> J Biomed Mater Res A. 88 (4), 858-871 (2009).</li>
<li>Kermanizadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Kupffer+cells+in+the+hepatic+response+to+silver+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">The role of Kupffer cells in the hepatic response to silver nanoparticles.</a> Nanotoxicology. , (2013).</li>
<li>Fischer, H. C., Hauck, T. S., Gomez-Aristizabal, A., Chan, W. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+Primary+Liver+Macrophages+for+Studying+Quantum+Dot+Interactions+with+Biological+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Exploring Primary Liver Macrophages for Studying Quantum Dot Interactions with Biological Systems.</a> Advanced Materials. 22 (23), 2520-2524 (2010).</li>
<li>Wan, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M2+Kupffer+Cells+Promote+M1+Kupffer+Cell+Apoptosis%3A+A+Protective+Mechanism+Against+Alcoholic+and+Nonalcoholic+Fatty+Liver+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">M2 Kupffer Cells Promote M1 Kupffer Cell Apoptosis: A Protective Mechanism Against Alcoholic and Nonalcoholic Fatty Liver Disease.</a> Hepatology. 59 (1), 130-142 (2014).</li>
<li>Matsuoka, M., Tsukamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+hepatic+lipocyte+collagen+production+by+Kupffer+cell-derived+transforming+growth+factor+%CE%B2%3A+Implication+for+a+pathogenetic+role+in+alcoholic+liver+fibrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Stimulation of hepatic lipocyte collagen production by Kupffer cell-derived transforming growth factor β: Implication for a pathogenetic role in alcoholic liver fibrogenesis.</a> Hepatology. 11 (4), 599-605 (1990).</li>
<li>Polakos, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kupffer+Cell-Dependent+Hepatitis+Occurs+during+Influenza+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Kupffer Cell-Dependent Hepatitis Occurs during Influenza Infection.</a> The American Journal of Pathology. 168 (4), 1169-1178 (2006).</li>
<li>Tanner, A., Keyhani, A., Reiner, R., Holdstock, G., Wright, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+enzymes+released+by+liver+macrophages+may+promote+hepatic+injury+in+a+rat+model+of+hepatic+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Proteolytic enzymes released by liver macrophages may promote hepatic injury in a rat model of hepatic damage.</a> Gastroenterology. 80 (4), 647-654 (1981).</li>
<li>Knittel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+patterns+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors+in+parenchymal+and+non-parenchymal+cells+of+rat+liver%3A+regulation+by+TNF-%CE%B1+and+TGF-%CE%B21%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Expression patterns of matrix metalloproteinases and their inhibitors in parenchymal and non-parenchymal cells of rat liver: regulation by TNF-α and TGF-β1.</a> Journal of Hepatology. 30 (1), 48-60 (1999).</li>
<li>Branster, M. V., Morton, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Intact+Liver+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Isolation of Intact Liver Cells.</a> Nature. 180 (4597), 1283-1284 (1038).</li>
<li>Smedsrød, B., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+pure+hepatocytes+and+reticuloendothelial+cells+in+high+yield+from+a+single+rat+liver+by+means+of+Percoll+centrifugation+and+selective+adherence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence.</a> Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).</li>
<li>Morin, O., Patry, P., Lafleur, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+endothelial+cells+of+adult+rat+liver+as+resolved+by+sedimentation+velocity+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of endothelial cells of adult rat liver as resolved by sedimentation velocity and flow cytometry.</a> J Cell Physiol. 119 (3), 327-334 (1984).</li>
<li>Miller, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+cells+from+livers+of+carcinogen-treated+rats+by+free-flow+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Purification of cells from livers of carcinogen-treated rats by free-flow electrophoresis.</a> Cancer Res. 43 (9), 4176-4179 (1983).</li>
<li>Firme, C. P., Bandaru, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+issues+in+the+application+of+carbon+nanotubes+to+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Toxicity issues in the application of carbon nanotubes to biological systems.</a> Nanomedicine. 6 (2), 245-256 (2010).</li>
<li>Ali-Boucetta, H., Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+assessment+of+carbon+nanotube+interaction+with+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic assessment of carbon nanotube interaction with cell cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 726, 299-312 (2011).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+and+correcting+for+carbon+nanotube+interferences+with+a+commercial+LDH+cytotoxicity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Understanding and correcting for carbon nanotube interferences with a commercial LDH cytotoxicity assay.</a> Toxicology. 299 (2-3), 99-111 (2012).</li>
<li>Wang, J. T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetically+Decorated+Multiwalled+Carbon+Nanotubes+as+Dual+MRI+and+SPECT+Contrast+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Magnetically Decorated Multiwalled Carbon Nanotubes as Dual MRI and SPECT Contrast Agents.</a> Advanced Functional Materials. 24 (13), 1880-1894 (2014).</li>
<li>Li, P. Z., Li, J. Z., Li, M., Gong, J. P., He, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+to+isolate+and+culture+mouse+Kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">An efficient method to isolate and culture mouse Kupffer cells.</a> Immunol Lett. 158 (1-2), 52-56 (2014).</li>
<li>Froh, M., Konno, A., Thurman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+liver+Kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Isolation of liver Kupffer cells.</a> Curr Protoc Toxicol. Chapter 14, Unit14 14(2003).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Les étapes suivantes sont essentielles pour atteindre un rendement élevé et une haute viabilité des cellules de Kupffer. Des conditions d&#39;asepsie doivent être utilisés pour limiter le risque de contamination bactérienne et fongique. Tous les instruments doivent être stérilisés avant utilisation. Les réactifs doivent être fraîchement préparées avant d&#39;effectuer la procédure d&#39;isolement. Le choix de la collagénase IV, avec une faible activité tryptique, est crucial. Différents lots...

Le domaine de la recherche de la nanotoxicologie vise à caractériser l&#39;effet biologique des nanoparticules. Les études toxicologiques basées sur des investigations in vivo restent les méthodes les plus précises. Toutefois, leur utilisation est limitée par leur coût, travail et temps exigences 1. Comme essais alternatives, in vitro ont été utilisées en raison de leur simplicité et de la possibilité de développer à haut débit dans les plateformes de test in vitro 2 - étendant ainsi le nombre de conditions testées. La plupart des études sont effectuées en utilisant nanotoxicological dans des essais in vitro sur des lignées de cellules immortalisées. Cependant, il ya des préoccupations concernant l&#39;extrapolation de ces résultats expérimentaux à des effets toxicologiques in vivo 3. En effet, les propriétés des lignées cellulaires immortalisées peuvent être significativement différents de tissus ils ont été dérivés à partir, par exemple, la transformation génétique 4, la détérioration des caractéristiques morphologiques clés5, la perte de la polarité cellulaire 6 et altérations fonctionnelles telles que la réglementation des médiateurs inflammatoires 7. Les cellules de Kupffer population des macrophages sont les plus abondants dans le corps et sont directement en contact avec le sang en alignant la paroi de sinusoïdes hépatiques. Dans le cadre du système réticulo-endothélial (RES), les macrophages sont responsables de la capture des nanoparticules de circulation et, par conséquent, constituent un modèle très approprié pour étudier la toxicité des nanoparticules. In vivo 8 et in vitro 9 études de réponses inflammatoires associées à des cellules de Kupffer exposés à des nanoparticules ont été publiés ailleurs. Les cellules de Kupffer ont également été impliqués dans la pathogenèse des maladies du foie telles que la maladie alcoolique du foie 10, la fibrose hépatique ou hépatite virale 11 12. Il a été rapporté que les cellules de Kupffer isolés donnent un aperçu utile de décrire les mécanismes cellulaires involved dans la perturbation du foie 13,14. Plusieurs procédés ont été rapportés pour isoler et purifier des cellules de Kupffer. l&#39;isolement cellulaire peut causer de la dissociation mécanique ou enzymatique 15. Digestion collagénase montre l&#39;intérêt de la conservation de l&#39;intégrité fonctionnelle des cellules de Kupffer, tout en conduisant à haute Kupffer rendement de la cellule 16. De nombreuses approches expérimentales différentes, la complexité et les coûts, ont été utilisées pour séparer les cellules de Kupffer les autres populations de cellules du foie. Par exemple, des cellules de Kupffer pureté peut être obtenue par immunoaffinite 17, le flux 18 électrophorèse, l&#39;adhérence sélective 16 ou par des techniques d&#39;épandage 16, qui sélectionnent les cellules selon leur taille et leur densité. Une combinaison de ces méthodes peut être choisie pour augmenter la pureté de la population 16. Il n&#39;y a pas de consensus sur la méthode idéale pour l&#39;isolation des cellules de Kupffer, car elle dépend principalement sur les applications disponibles et équipemt. Toutefois, dans le cas des essais de toxicité de nanoparticules, la simplicité et un rendement élevé de la technique associée à la conservation fonctionnelle des cellules de Kupffer ont semblé être plus approprié pour cette application. La méthode d&#39;isolement des cellules de Kupffer est question ici est basé sur une méthode de perfusion deux étapes suivi d&#39;une purification sur gradient de densité. Le procédé a été modifié par rapport au protocole initial développé par Smedsrød et al. 16 conçus pour l&#39;isolement des cellules de foie de rat. La plupart des études ont rapporté et décrit l&#39;isolement de cellules de Kupffer du foie de rat. Ici, nous décrivons une méthode pour isoler les cellules de Kupffer du foie de la souris, avec un rendement élevé et de pureté. L&#39;utilisation de souris réduit le coût de l&#39;expérimentation et permet le traitement de plusieurs foies d&#39;obtenir de grandes quantités de cellules de Kupffer pour les tests de toxicité des nanoparticules. Dans le protocole suivant, les cellules de Kupffer ont été incubées avec des nanotubes de carbone fonctionnalisés (f </em&gt; -CNTs). Les propriétés physico-chimiques uniques de NTC - c.-à-haute rapport de longueur à diamètre et grande surface, ont fait NTC candidats intéressants comme vecteurs pour des fins de thérapie et de diagnostic. Toutefois, des préoccupations ont été soulevées concernant la toxicité des nanotubes de carbone 19, et le développement de nouveaux tests in vitro vise à accroître la compréhension des effets biologiques CNT. Toxicité chez les cellules de Kupffer est associé à un manque d&#39;intégrité structurelle de la membrane cellulaire. Elle est mesurée par la perte de l&#39;enzyme LDH cytoplasmique de la cellule dans le surnageant. Le principe de cette méthode est donc de supprimer tout LDH libérée et de mesurer ce qui reste dans les cellules 20. Ceci est réalisé de préférence à la mesure de la LDH libérée dans le surnageant parce que la présence de nanotubes de carbone dans le surnageant interfère avec l&#39;essai 21. Nous vous proposons l&#39;utilisation de ce métho d&#39;isolement des cellules de Kupffer efficace simple et économiqued pour isoler nombre élevé de cellules fonctionnelles Kupffer. Ceci permet le criblage de la toxicité d&#39;une gamme de nanoparticules, dans un modèle de macrophage primaire pertinente.

<table><tbody><tr><td>Euthatal (pentobarbital sodique)</td><td>Merial</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD1 souris</td><td>Charles River&nbsp ; &nbsp ;</td><td>-</td><td>Le poids de la souris doit varier de 35 à 45 g. Nous conseillons l’utilisation de souris CD1 mâles car leur poids augmente rapidement ( par exemple une souris CD1 mâle de 7 semaines dépasse 35 g de poids). Il est également conseillé de contacter le fournisseur d’animaux à l’avance pour organiser la livraison des animaux plus âgés. Alternativement, les animaux peuvent être à l’intérieur de la maison pour atteindre le poids souhaité.</td></tr><tr><td>HBSS (sans <>2 /supet Mg2+ sup, avec bicarbonate)&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Technologies de la vie&nbsp ; &nbsp ;</td><td>14175-053</td><td>HBSS doit être&nbsp ; Ca2+ gratuit.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sel tétrasodique de l’acide tétraacétique d’éthylène glycol (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ; &nbsp ;</td><td>E8145&nbsp ; &nbsp ;</td><td>L’EDTA peut également être utilisé, mais l’EGTA a l’avantage de chélater le Ca2+ supsélective.</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)&nbsp ;</td><td>Technologies de la vie&nbsp ; &nbsp ;</td><td>15630-056&nbsp ;</td><td>100 ml&nbsp ;</td></tr><tr><td>Collagénase de type IV&nbsp ;</td><td>Worthington&nbsp ;</td><td>CSL-4&nbsp ;</td><td>Il est conseillé de tester différents lots de collagénase ou au moins de mentionner au fournisseur que le produit doit être adapté à l’isolement des cellules hépatiques.</td></tr><tr><td>&nbsp ; Faible teneur en glucose DMEM&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ; &nbsp ;</td><td>D5523&nbsp ;</td><td>500 ml&nbsp ;</td></tr><tr><td>RPMI (avec pyruvate de sodium et Glutamax)&nbsp ;</td><td>Technologies de la vie&nbsp ; &nbsp ;</td><td>12633-012&nbsp ;</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Pénicilline/Steptomycine&nbsp ;</td><td>Technologies de la vie&nbsp ; &nbsp ;</td><td>15140-122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Sérum fœtal de bovin&nbsp ;</td><td>Premier-Lien&nbsp ; &nbsp ;</td><td>60-00-850&nbsp ;</td><td>500 ml&nbsp ;</td></tr><tr><td>Trypan blue solution</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>T8154&nbsp ;</td><td>100 ml&nbsp ;</td></tr><tr><td>Solution de particules de silice enrobée (Percoll)</td><td>GE Healtcare&nbsp ; &nbsp ;</td><td>17-0891-02&nbsp ;</td><td>Percoll&reg ; est très stable et peut être conservé plusieurs années.</td></tr><tr><td>1x solution saline tamponnée au phosphate&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Technologies de la vie&nbsp ; &nbsp ;</td><td>10010-023</td><td>500 ml&nbsp ;</td></tr><tr><td>10x solution saline tamponnée au phosphate&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Technologies de la vie&nbsp ; &nbsp ;</td><td>70011-036</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>de sulfoxyde de diméthyle&nbsp ;</td><td>Fisher&nbsp ;</td><td>D/4120/PB08&nbsp ;</td><td>500 ml&nbsp ;</td></tr><tr><td>Kit LDH (CytoTox 96)&nbsp ;</td><td>Promega&nbsp ;</td><td>G1781&nbsp ;</td><td>Conserver à l’abri de la lumière&nbsp ;</td></tr><tr><td>DMEM phénol rouge sans Life</td><td>Technologies&nbsp ; &nbsp ;</td><td>31053-028&nbsp ;</td><td>500 ml&nbsp ;</td></tr><tr><td>Anticorps F4/80 (Alexa 488)</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA497A488</td><td>Ne pas diluer, utilisé pur pour la cytométrie en flux</td></tr><tr><td>Perles fluorescentes</td><td>Sigma</td><td>L2778</td><td>Perles de latex, polystyrène modifié aux amines, rouge fluorescent. 1 ml</td></tr><tr><td>Nom du matériau</td><td>Entreprise&nbsp ;</td><td>Numéro de catalogue&nbsp ;</td><td>Commentaires/Description&nbsp ;</td></tr><tr><td>Kit de prélèvement de sang de papillon (tube de 23 G/305 mm de long) &nbsp ;</td><td>BD&nbsp ;</td><td></td><td></td>367288</tr><tr><td>filtres à seringue (0,22 &mu ; m Blue Rim)&nbsp ;</td><td>Minisart&nbsp ;</td><td>16534-K&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger (50 ml Blue Cap)&nbsp ;</td><td>BD Biosciences, Falcon</td><td>35 2070&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri (90 x 15 mm)&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ; &nbsp ;</td><td>BSN 101VR20&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu ; crépine à cellules M&nbsp ; &nbsp ;</td><td>BD&nbsp ; &nbsp ;</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristaltique&nbsp ;</td><td>Watson Marlow&nbsp ;</td><td>SciQ 300° &nbsp ;</td><td>Rincez la tubulure avant et après chaque utilisation avec du PBS stérile et de l’éthanol à 70 %.</td></tr><tr><td>Plaques à 24 puits</td><td>Corning&nbsp ; &nbsp ;</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 96 puits&nbsp ;</td><td>Corning&nbsp ; &nbsp ;</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de plaques</td><td>BMG Labtech</td><td>FLUOstar Omega</td><td></td></tr><tr><td>Serrefine forceps</td><td>Hammacher GmbH&nbsp ;</td><td>Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051</td><td>La pince serrefine permet de clamper le vaisseau canulé avec l’aiguille 23 G sans qu’il soit nécessaire de tenir la pince pendant la procédure de perfusion. Lien : (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tubes de cytométrie en flux</td><td>BD Biosciences, Falcon&nbsp ;</td><td></td><td></td>352052</tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation (1,5 ml)</td><td>Elkay</td><td>&nbsp ; 000-MICR-150</td><td></td></tr><tr><td>Racleur de cellules</td><td>BD Biosciences, Falcon</td><td>353086</td><td>Coupez les extrémités des lames avec une paire de ciseaux pour gratter les cellules dans des plaques de 24 puits.</td></tr><tr><td>Nom de la société de réactifs</td><td>&nbsp ;</td><td>Numéro de catalogue&nbsp ;</td><td>Commentaires/Description&nbsp ;</td></tr><tr><td>&nbsp ; Solution EGTA (acide tétraacétique d’éthylène glycol)/HBSS (solution saline équilibrée de Hank)&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>HBSS contenant 0,5 mM d’EGTA et 25 mM d’HEPES. Ajustez le pH à 7,4. Préparez 50 ml pour chaque foie à perfuser. &nbsp ;</td></tr><tr><td>Solution de collagénase&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>DMEM à faible teneur en glucose contenant de la collagénase de type IV à 100 UI/ml, 15 mM HEPES et 1 % de péniclline/streptamycine (v/v). Ajustez le pH à 7,4. Préparez 100 ml pour chaque foie à perfuser. Après avoir ajouté la collagénase, il est conseillé de réchauffer la solution pendant 30 min avant utilisation. Cela permet à l’activité de la collagénase d’être optimale.</td></tr><tr><td>Milieu d’isolement cellulaire de Kupffer&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>RPMI contenant, 1 % d’acides aminés non essentiels (v/v), 1 % de glutamax&reg ; (v/v) et 1 % de péniclline/streptomycine (v/v). Préparez au moins 100 ml pour 1 à 3 foies. &nbsp ;</td></tr><tr><td>Milieu de culture cellulaire Kupffer&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>RPMI contenant 10 % de sérum de veau fœtal, 1 % d’acides aminés non essentiels (v/v), 1 % de glutamax&reg ; (v/v) et 1 % de péniclline/streptamycine (v/v). Préparez au moins 100 ml pour 1 à 3 foies. &nbsp ;</td></tr><tr><td>SIP (solution de particules de silice enrobées isotoniques)</td><td></td><td></td><td>Mélanger 1,7 ml de solution saline tamponnée 10x phosphate avec 15,3 ml de Percoll&reg ; pour obtenir 17 ml de SIP.</td></tr><tr><td>Solution SIP à 25 %s&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Mélanger 5 ml de SIP avec 15 ml de solution saline tamponnée au phosphate. &nbsp ;</td></tr><tr><td>Solution 50 % SIP&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Mélanger 10 ml de SIP avec 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate</td></tr>.<tr><td>Tampon de lyse Média</td><td></td><td></td><td>DMEM avec 0,9 %</td>de</tr><tr><td></td><td></td> solution Triton X-100<td>PBS/BSA</td><td>Préparez une solution saline fraîche tamponnée au phosphate pH 7,4 avec 1 % d’albumine sérique bovine.</td></tr></tbody></table>

kupffer cellule d&#39;isolement pour les essais de toxicité des nanoparticules

Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

La grande majorité des études in vitro de nanotoxicological ont utilisé des lignées cellulaires immortalisées pour leur praticité. Cependant, les résultats des tests de toxicité des nanoparticules dans des lignées cellulaires immortalisées ou des cellules primaires ont montré des anomalies, en soulignant la nécessité d&#39;étendre l&#39;utilisation de cellules primaires pour les essais in vitro. Ce protocole décrit l&#39;isolement de macrophages hépatiques de souris, les cellules de Kupffer Nom de famille, ainsi que leur utilisation pour étudier la toxicité des nanoparticules. Les cellules de Kupffer population des macrophages sont les plus abondants dans le corps et constituent une partie du système réticulo-endothélial (RES), responsable de la capture des nanoparticules de circulation. La méthode d&#39;isolement des cellules de Kupffer est question ici est basé sur une méthode de perfusion deux étapes suivi d&#39;une purification sur gradient de densité. La méthode, basée sur la digestion de collagénase et une centrifugation de densité, est une adaptation du protocole d&#39;origine développé par Smedsrød et al. conçu pour les cellules du foie de rat isolation et fournit un rendement élevé (jusqu&#39;à 14 x 10 6 cellules par souris) et de haute pureté (&gt; 95%) des cellules de Kupffer. Cette méthode d&#39;isolement ne nécessite pas d&#39;équipements sophistiqués et coûteux ou représente donc un compromis idéal entre la complexité et le rendement de la cellule. L&#39;utilisation de souris plus lourds (35 à 45 g) permet d&#39;améliorer le rendement du procédé d&#39;isolation, mais aussi facilite remarquablement le mode opératoire de canulation de la veine porte. La toxicité des nanotubes de carbone fonctionnalisés f -CNTs a été mesuré dans ce modèle par le dosage de la LDH modifié. Cette méthode évalue la viabilité des cellules en mesurant le manque d&#39;intégrité structurelle de la membrane des cellules de Kupffer après incubation avec -CNTs f. Toxicité induite par -CNTs f peut être mesurée en utilisant systématiquement ce test, soulignant que les cellules de Kupffer isolées sont utiles pour les tests de toxicité des nanoparticules. La compréhension globale de la nanotoxicologie pourrait bénéficier de ces modèles, ce qui rend la sélection de nanoparticules pour la traduction clinique plus efficace.

Le nombre de cellules parenchymateuses non purifiées était conforme et a varié entre 8 et 14 x 10 6 cellules par souris (17 isolements ont été réalisées). Chaque isolement de la souris était suffisante à la plaque 16 à 28 puits. La viabilité des cellules par coloration au bleu trypan a montré la viabilité des cellules ~ 95%. Les cellules de Kupffer ont montré une forme ronde dans les 30 minutes d&#39;incubation à 37 ° C, liée à leur morphologie adhérente incomplètes (figure 4A). À 4 h d&#39;i...

Les macrophages hépatiques, appelés cellules de Kupffer, sont responsables de la capture des nanoparticules circulantes. Nous décrivons ici une méthode, d’une pureté cellulaire et d’un rendement élevés, pour l’isolement des cellules de Kupffer. Le test LDH modifié est utilisé ici pour mesurer la toxicité induite par les nanotubes de carbone dans les cellules de Kupffer.

Kupffer cellule d&#39;isolement pour les essais de toxicité des nanoparticules

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'isoler et de purifier un grand nombre de cellules cup pour étudier la toxicité des nanoparticules. Cette isolation est réalisée en perfusant les foies de souris avec une solution H-B-S-S-E-G-T-A et une solution de collagénase destinée à digérer délicatement le tissu hépatique. Ensuite, les cellules hépatiques sont purifiées par centrifugation par gradient de densité et par adhésion sélective afin d'obtenir une culture de cellules cup purifiées.Ensuite, une analyse par cytométrie en flux est réalisée afin de confirmer la pureté et les propriétés acides F des cellules cup. Les résultats obtenus montrent que la toxicité des nanotubes de carbone fonctionnalisés peut être mesurée dans les cellules cup. Selon le modèle modifié de L-D-H-S-A, ce système peut être appliqué aux essais de toxicité des nanoparticules.La méthode que nous souhaitons vous présenter aujourd’hui peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la nanotoxicologie, par exemple en évaluant la toxicité de nouveaux vecteurs médicamenteux récemment mis au point. Ceci revêt une grande importance, car la plupart des lignées cellulaires immortalisées utilisées présentent des propriétés significativement différentes de celles des tissus dont elles sont issues. Une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle. Si la méthode est correctement réalisée, elle permet d’obtenir un rendement élevé et une grande pureté de cellules ke, qui pourront ensuite servir de modèle pour cribler diverses nanoparticules en vue d’évaluer leur toxicité.Après avoir préparé fraîchement tous les réactifs énumérés dans le tableau des matériaux et réactifs figurant dans le protocole accompagnant le texte, réchauffez la solution E-G-T-A-H-B-S-S et la solution de collagénase à 40 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis rincez le tube souple de la pompe avec de l’éthanol à 70 %. Versez ensuite 40 millilitres de solution E-G-T-A-H-B-S-S dans un tube de centrifugeuse immergé dans le bain-marie, et rincez le tube souple de la pompe avec la solution E-G-T-A-H-B-S-S préalablement réchauffée. Après avoir euthanasié une souris CD1 conformément au protocole décrit dans le texte, rasez les poils abdominaux et désinfectez la surface abdominale à l’aide d’éthanol à 70 %.Confirmer l'anesthésie par une pincée du orteil. Inciser la cavité abdominale et exposer la veine porte et la veine cave inférieure en déplaçant l'intestin latéralement vers la gauche de l'abdomen. Démarrer la pompe à une vitesse de un à trois millilitres par minute avec la solution E-G-T-A-H-B-S-S et, à l’aide d’une aiguille papillon de calibre 23, canuler la veine porte, pincer la section canulée de la veine porte, puis retourner la pince hépato-duodénale à la surface de l’abdomen ouvert de la souris.Le foie doit devenir pâle dans les 30 premières secondes de la perfusion ; incisez rapidement la partie inférieure de la veine cave inférieure pour éviter une accumulation excessive de pression dans le foie, puis augmentez progressivement le débit à sept millilitres par minute au cours de la première minute de perfusion. Lorsqu’il reste moins de cinq millilitres de solution E-G-T-A-H-B-S-S dans le tube à centrifuger, ajoutez 40 à 50 millilitres de solution de collagénase, puis augmentez progressivement le débit à 10 millilitres par minute en 30 secondes.Faites gonfler le foie en utilisant une pince pour appliquer périodiquement une pression à la veine cave inférieure pendant des intervalles de 10 à 32 secondes. Cela améliorera la dissociation cellulaire et réduira le temps de perfusion avec la collagénase. Lorsqu'il reste moins de 10 millilitres de solution de collagénase dans le tube de centrifugation, ajoutez un volume supplémentaire de 40 à 50 millilitres de solution de collagénase préchauffée dans le tube.Ensuite, une fois que 70 à 80 millilitres ont été perfusés, utilisez une pince pour appliquer une légère pression à la surface. Une marque de dépression indique que les cellules hépatiques sont dissociées. Retirez le foie de la cavité abdominale en un seul morceau et placez-le dans un tube à centrifuger contenant 20 à 30 millilitres de milieu pour l'isolement cellulaire.Gardez les cellules hépatiques sur de la glace pendant trois heures au maximum et regroupez jusqu'à trois foies pour la purification afin d'obtenir le milieu destiné aux cellules. Placez un foie perfusé dans une boîte de Pétri contenant 15 millilitres de milieu pour l'isolement des cellules, à l’aide de ciseaux ou de pinces. Rompez la capsule brillante et libérez toutes les cellules hépatiques dans le milieu.Filtrer la solution à travers un tamis cellulaire de 100 micromètres dans un tube de centrifugation. Ensuite, centrifuger la suspension cellulaire à 50 GS à quatre degrés Celsius pendant deux minutes. Les cellules parenchymateuses se trouveront dans le culot et les cellules non parenchymateuses seront dans le surnageant.Recueillir le surnageant dans un tube de centrifugation propre et centrifuger à 50 gs pendant deux minutes. Répéter jusqu'à un total de quatre transferts et centrifugations. Centrifugation suivante.Le surnageant est éliminé après centrifugation à 1 350 ×g pendant 15 minutes. Pour former un culot des cellules non parenchymateuses, jetez le surnageant et resuspendez le culot dans 10 millilitres de milieu d'isolement des cellules cup, puis ajoutez la solution des cellules non parenchymateuses au gradient isotonique discontinu 25-50 % préparé précédemment selon le protocole décrit dans le texte et centrifugez à 850 ×g pendant 15 minutes sans accélération ni freinage. À l’aide d’une pipette serologique de 10 millilitres, aspirez environ 12 millilitres de la fraction enrichie en cellules cup, qui apparaît trouble, située dans la fraction 25 % SIP près de l’interface 25-50 % SIP.Transférez les cellules dans un tube de centrifugeuse contenant 35 à 40 millilitres de milieu pour l'isolement des cellules, mélangez délicatement, puis centrifugez à 1 350 ×g et 4 °C pour former un culot cellulaire. Jetez le surnageant et utilisez 5 à 10 millilitres de milieu préchauffé pour resuspendre les cellules. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et mesurez la viabilité à l’aide de la coloration au bleu de trypan. Ensemencez les cellules non parenchymateuses purifiées dans des plaques de 24 puits à une densité de 5 × 10⁵ cellules par puits.Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Ensuite, retirer délicatement le milieu. Utiliser du HBSS préchauffé pour laver les cellules et le remplacer par 500 microlitres par puits de milieu de culture cellulaire frais préchauffé.Replacer les cellules à 37 degrés Celsius pendant au moins quatre heures pour permettre leur adhérence avant le traitement avec des nanoparticules. Après avoir caractérisé la pureté et l'activité phagocytaire des cellules C et après incubation avec des nanotubes de carbone fonctionnalisés ou fcts comme décrit dans le protocole du texte, éliminer le surnageant et ajouter 200 microlitres par puits de tampon de lyse. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes, effectuer un pipetage vigoureux et recueillir les cellules lysées dans des tubes de microcentrifugeuse.Ensuite, centrifuger à 20 000 ×g pendant 10 minutes pour précipiter les fcn ts qui ont été internalisées par les cellules sur les débris cellulaires. Recueillir le surnageant dans des tubes de microcentrifugeuse et le conserver à moins 20 degrés Celsius. En alternative, transférer 50 microlitres dans une plaque de 96 puits et ajouter un volume équivalent de solution de mélange de substrat provenant du kit de lactate déhydrogénase.Inclure des puits témoins en triple contenant chacun 50 microlitres de tampon de lyse et 50 microlitres de solution de mélange de substrat. Ensuite, couvrir la plaque et incuber à température ambiante pendant 15 minutes avant d'ajouter 50 microlitres de solution d'arrêt. Enfin, mesurer l'absorbance à 490 nanomètres à l'aide d'un lecteur de microplaques et utiliser la formule suivante pour calculer le pourcentage de viabilité cellulaire.Cette figure illustre que le nombre de cellules non parenchymateuses purifiées varie entre huit et quatorze fois dix puissance six cellules par souris et par foie. La coloration bleue a révélé une viabilité cellulaire d'environ 95 %. Les cellules adhérentes prenaient une forme arrondie dans les 30 minutes suivant l'incubation, puis s'étalaient au bout de quatre heures, et des agrégats commençaient à se former, comme on le voit ici.Les cellules ont été marquées avec l'anticorps F four 80 afin de démontrer la pureté des cupules, qui a été mesurée à plus de 95 % par cytométrie en flux. De plus, après 12 heures en culture, l'analyse par cytométrie en flux a montré que 85 % des cellules présentaient une activité acide PHA, évaluée par leur capacité à internaliser des billes fluorescentes d'un micromètre. Toutefois, ce pourcentage a chuté après 72 heures de culture, lorsque seules 40 % des cellules restaient phagocytaires, comme indiqué ici.Les cupules des cellules incubées avec des nanotubes de carbone fonctionnalisés pendant 24 et 72 heures présentaient des morphologies similaires à celles des cellules naïves. En revanche, les cupules des cellules incubées avec 10 % de DMSO utilisées comme témoin positif affichaient une morphologie nécrotique ; l’analyse de l’essai modifié de LDH a révélé que les cupules des cellules traitées avec 10 % de DMSO pendant 24 et 72 heures présentaient une forte toxicité en comparaison. Les fcts ont induit une réduction légère mais significative de la viabilité cellulaire uniquement lorsque les cellules ont été exposées à 50 microgrammes par millilitre pendant 72 heures. Selon cette méthode, d'autres cellules SC basées sur des cultures et tous les types de nanoparticules peuvent être testés à l'aide de cellules ke isolées.Cela permet de recueillir des données fiables tout en minimisant l'utilisation d'animaux. Nous espérons que cette technique pourra aider à ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine de la psychologie des nanotechnologies, afin qu'ils puissent évaluer la sécurité des nombreux nanotransporteurs prometteurs dont le développement s'intensifie de plus en plus.

kupffer-cell-isolation-for-nanoparticle-toxicity-testing

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Une nouvelle méthode pour obtenir des macrophages de culture primaire de cellules de foie de rat est décrit. Cette méthode utilise la prolifération des macrophages dans la culture, suivie par la secousse de flacons de culture et de la purification par l'attachement sélectif plats en plastique. Cette technique fournit efficacement des macrophages du foie, sans équipement complexe et des compétences.

Une méthode simple et efficace pour isoler les macrophages de mixte cultures primaires de cellules hépatiques adultes

Ici, nous décrivons les protocoles pour la récolte des macrophages alvéolaires murins, qui sont des résidents cellules immunitaires innées dans le poumon, et en examinant leur activation en réponse à la co-culture avec des nanoparticules polyanhydride.

La récolte macrophages alvéolaires murins et l&#39;évaluation d&#39;activation cellulaire induite par des nanoparticules polyanhydride

Dans cette vidéo, nous démontrons l’isolement des cellules de Kupffer ou des macrophages hépatiques du foie de souris. Le foie est perfusé avec une solution de digestion suivie d’une séparation par gradient de densité. Les cellules de Kupffer adhérentes isolées peuvent être utilisées pour une analyse plus approfondie.

Isolement et culture de cellules de Kupffer de souris

Cette vidéo démontre l’isolement des lymphocytes, y compris les cellules tueuses naturelles ou cellules NK, à partir du tissu hépatique humain pour une expansion sélective. La digestion enzymatique et mécanique, suivie d’une séparation par gradient de densité, favorise l’isolement des lymphocytes, y compris les cellules NK. Les lymphocytes collectés peuvent être utilisés pour l’expansion sélective des cellules NK.

Isolement de cellules tueuses naturelles à partir du tissu hépatique pour une expansion sélective

L'analyse de l'interaction des nanoparticules avec des sous-populations de cellules immunitaires définies par cytométrie de flux.

Détection de nanoparticules fluorescentes Interactions avec immunitaire primaire sous-populations de cellules par cytométrie en flux

l’eau de saignement de production (PBW) a été traitée avec des nanoparticules d’oxyde cuivrique (CuO-NPs) et la toxicité cellulaire a été évaluée dans des cellules humaines en culture. L’objectif de ce protocole était d’intégrer l’échantillon environnemental natif dans un format de culture cellulaire évaluant les changements de toxicité dus au traitement CuO-NP.

Suppression des éléments traces par Cupric nanoparticules d&#39;oxyde de Uranium<em&gt; In Situ</em&gt; Récupération de l&#39;eau de ressuage et son effet sur la viabilité cellulaire

Une technique permettant d’isoler des hépatocytes humains et des cellules hépatiques non parenchymateuses du même donneur est décrite. Les différents types de cellules hépatiques constituent la base des modèles hépatiques fonctionnels et de l’ingénierie tissulaire. Cette nouvelle méthode vise à isoler les cellules hépatiques avec un rendement et une viabilité élevés.

Protocole pour l&#39;isolement des hépatocytes humains primaires et correspondant Principales populations de cellules hépatiques non parenchymateuses

Les microglies (cellules immunitaires du cerveau), sont utilisées comme biocapteur de substitution pour déterminer comment les nanoparticules influencent la neurotoxicité. Nous décrivons une série d’expériences conçues pour tester la réponse microgliale aux nanoparticules et l’exposition des neurones hypothalamiques au surnageant de la microglie activée afin de déterminer la neurotoxicité.

Microglies comme un biocapteur Surrogate pour déterminer Nanoparticules neurotoxicité

Cette procédure a été établie pour être utilisée pour développer des cultures hépatiques 3D avancées in vitro, ce qui peut fournir une évaluation plus physiologiquement pertinente des dangers génotoxiques associés aux expositions aux nanomatériaux sur un régime de dose répété aigu ou à long terme.

Modèles hépatiques 3D avancés pour les tests de génotoxicité in vitro après une exposition à long terme aux nanomatériaux

Cet article vise à fournir un protocole pour l’isolement et la culture de fibroblastes primaires associés au cancer à partir d’un modèle murin syngénique du cancer du sein triple négatif et leur application pour l’étude préclinique de nouvelles nanoparticules conçues pour cibler le microenvironnement tumoral.

Isolement de fibroblastes primaires associés au cancer à partir d’un modèle murin syngénique du cancer du sein pour l’étude de nanoparticules ciblées

Nous présentons ici une méthode non génétique pour générer des sphéroïdes hépatiques autologues humains en utilisant des cellules mononucléaires isolées du sang périphérique à l’état d’équilibre.

Sphéroïdes hépatiques humains provenant du sang périphérique pour les études sur les maladies du foie

Apprenez l'isolation de cellules de Kupffer murines par perfusion hépatique et centrifugation en gradient de densité pour évaluer la toxicité des nanoparticules. Cette méthode fournit des cultures de haute pureté pour la nanotoxicologie.

Kupffer cellule d'isolement pour les essais de toxicité des nanoparticules

Explorer plus de vidéos