Kupffer cellule d'isolement pour les essais de toxicité des nanoparticules

L’objectif global de l’expérience suivante est d’isoler et de purifier la coupe de souris pour les cellules en grand nombre afin d’étudier la toxicité des nanoparticules. Ceci est réalisé en perfusant le foie de souris avec une solution H-B-S-S-E-G-T-A et un collagène, une solution pour digérer doucement le tissu hépatique. Ensuite, les cellules hépatiques sont purifiées par densité, centrifugation et adhésion sélective pour obtenir une culture de cupule purifiée pour les cellules.

Ensuite, une analyse par cytométrie en flux est effectuée afin de confirmer la pureté et les propriétés acides F de la cupule pour les cellules. On obtient des résultats qui montrent que la toxicité des nanotubes de carbone fonctionnalisés peut être mesurée en cupule pour les cellules. Basé sur le L-D-H-S-A modifié, ce modèle peut être appliqué aux tests de toxicité des nanoparticules.

La méthode que nous visons à vous montrer aujourd’hui peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la nanotoxicologie, telles que l’évaluation de la toxicité des vecteurs de médicaments récemment développés, ce qui est très important car la plupart des lignées cellulaires immortalisées utilisées présentent des propriétés significativement différentes des tissus dont elles sont issues. Une démonstration visuelle de cette méthode est cruciale. Si la méthode est mise en œuvre avec succès, elle permettra d’obtenir un rendement élevé et une pureté de cellules ke, qui pourront ensuite être utilisées comme modèle pour cribler une gamme de nanoparticules pour cette toxicité.

Après avoir fraîchement préparé tous les réactifs énumérés dans le tableau des matériaux et des réactifs trouvé avec le protocole de texte d’accompagnement, réchauffez la solution E-G-T-A-H-B-S-S et la solution de collagénase à 40 degrés Celsius pendant 30 minutes, utilisez de l’éthanol à 70 % pour rincer le tube flexible de la pompe. Versez ensuite 40 millilitres de solution E-G-T-A-H-B-S-S dans un tube à centrifuger immergé dans le bain-marie et utilisez le préchauffage E-G-T-A-H-B-S-S pour rincer le tube flexible de la pompe. Après avoir euthanasié une souris CD, selon le protocole textuel, rasez les poils abdominaux et utilisez de l’éthanol à 70 % pour désinfecter la surface abdominale.

Confirmez l’anesthésie par pincement des orteils. Coupez à travers la cavité abdominale et exposez la veine porte et la veine cave inférieure en déplaçant l’intestin latéralement vers la gauche de l’abdomen. Démarrez la pompe à une vitesse d’un à trois millilitres par minute avec la solution E-G-T-A-H-B-S-S et avec une canulation à aiguille papillon de calibre 23, clampez la veine porte, clampez la section canulée de la veine porte, puis retournez la pince sinusoïdale à la surface de l’abdomen ouvert de la souris.

Le foie doit devenir pâle dans les 30 premières secondes de la perfusion, inciser rapidement la partie inférieure de la veine cave inférieure pour éviter l’accumulation d’une pression excessive dans le foie et augmenter progressivement le débit à sept millilitres par minute au cours de la première minute de perfusion. Lorsqu’il reste moins de cinq millilitres de solution E-G-T-A-H-B-S-S dans le tube de centrifugation. Ajoutez 40 à 50 millilitres de collagène par solution, puis augmentez progressivement le débit jusqu’à 10 millilitres par minute pendant 30 secondes.

Faites gonfler le foie en utilisant une pince à épiler pour appliquer périodiquement une pression sur la veine cave inférieure pendant 10 à 32e intervalles. Cela améliorera la dissociation cellulaire et réduira le temps de perfusion avec la collagénase. Lorsqu’il reste moins de 10 millilitres de solution de collagénase dans le tube de centrifugation, ajoutez 40 à 50 millilitres supplémentaires de solution de collagénase préchauffée dans le tube.

Ensuite, une fois que 70 à 80 millilitres ont été perfusés, utilisez une pince pour appliquer une légère pression sur la surface. Une marque de dépression indique que les cellules hépatiques sont dissociées. Retirez le foie de la cavité abdominale en un seul morceau et placez-le dans un tube à centrifuger contenant 20 à 30 millilitres de tasse pour l’isolement cellulaire. Douleur moyenne.

Gardez les cellules hépatiques sur de la glace jusqu’à trois heures et mettez en pool jusqu’à trois foies pour la purification afin de purifier la coupe pour les cellules. Placez un foie perfusé dans une boîte de Pétri avec 15 millilitres de tasse pour l’isolement cellulaire, milieu avec des ciseaux ou une pince à épiler. Rompez la capsule de glistens et libérez toutes les cellules hépatiques dans le milieu.

Filtrez la solution à travers une crépine à cellules de 100 micromètres dans un tube à centrifuger. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire à 50 GS à quatre degrés Celsius pendant deux minutes. Les cellules parenchymateuses seront dans la pastille et les cellules non parenchymateuses seront dans le surnageant.

Prélever le surnageant dans un tube à centrifuger propre et centrifuger à 50 g pendant deux minutes. Répétez l’opération pour un total de quatre transferts et tours. Centrifugeuse suivante.

Le supernat à 1, 350 GS pendant 15 minutes. Pour granuler les cellules non parenchymateuses, jeter le supernat et remettre en suspension la pastille dans 10 millilitres de tasse pour milieu d’isolement cellulaire, ajouter la solution cellulaire non parenchymateuse au gradient isotonique discontinu de 25 à 50 % préalablement préparé selon le protocole de texte et centrifuger à 850 GS pendant 15 minutes sans accélération ni rupture. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres, aspirez environ 12 millilitres de la cupule enrichie pour la fraction cellulaire qui semble trouble à l’intérieur de la fraction SIP 25 % proche de l’interface 25 50 % SIP.

Transférez les cellules dans un tube de centrifugation contenant 35 à 40 millilitres de tasse pour l’isolement cellulaire, milieu et mélangez doucement, puis centrifugez à 1 350 GS et quatre degrés Celsius pour granuler les cellules, jetez le super nommé et utilisez cinq à 10 millilitres de milieu de préchauffage pour remettre les cellules en suspension avec un hémocytomètre. Comptez les cellules et utilisez la coloration au bleu trian pour mesurer la plaque de viabilité. Les cellules non parenchymateuses purifiées dans des plaques de 24 puits à une densité de cinq fois 10 à la cinquième cellules par puits.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Retirez ensuite délicatement le fluide. Utilisez du HBSS préchauffé pour laver les cellules et remplacez-le par 500 microlitres par puits de tasse de préchauffage frais pour le milieu de culture cellulaire.

Remettez les cellules à 37 degrés Celsius pendant au moins quatre heures pour leur permettre d’adhérer avant le traitement avec des particules de nanoparticules. Après avoir caractérisé la pureté et l’activité phagocytaire du C pour les cellules et l’incubation avec des nanotubes de carbone fonctionnalisés ou fcts comme indiqué dans le protocole de texte, jeter le surnageant et ajouter 200 microlitres par puits de tampon de lyse. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes, effectuer un pipetage vigoureux et prélever la coupelle de lyse pour cellules dans des tubes de micro-centrifugeuse.

Ensuite, centrifugez à 20 000 GS pendant 10 minutes pour extraire les fcn ts qui ont été absorbés par les cellules sur les débris cellulaires. Collectez le surnageant dans des micro-tubes à centrifuger et stockez-le à moins 20 degrés Celsius. Vous pouvez également transférer 50 microlitres dans une plaque à 96 puits et ajouter un volume égal de solution de mélange de substrat à partir du kit de lactate déshydrogénase.

Inclure des triplets de puits vierges contenant 50 microlitres de tampon de lyse et 50 microlitres de solution de mélange de substrat. Couvrez ensuite la plaque et incubez à température ambiante pendant 15 minutes avant d’ajouter 50 microlitres de solution d’arrêt. Enfin, lisez l’absorbance à 490 nanomètres dans un lecteur de microplaques et utilisez la formule suivante pour calculer le pourcentage de viabilité cellulaire.

Cette figure illustre que le nombre de cellules non parenchymateuses purifiées varie entre huit et 14 fois 10 à six cellules par souris et par trian. La coloration bleue a démontré une viabilité cellulaire d’environ 95 %. La tasse adhérente pour les cellules a adopté une forme ronde dans les 30 minutes suivant l’incubation, et après quatre heures, les cellules se sont propagées et des grappes ont commencé à se former, comme on le voit ici.

Les cellules ont été colorées avec l’anticorps F 4 80 pour démontrer la pureté cellulaire, qui a été mesurée au-dessus de 95 % par cytométrie en flux. De plus, après 12 heures de culture, l’analyse à faible cytométrie a montré que 85 % des cellules étaient capables d’une activité acide PHA par leur capacité à absorber des billes fluorescentes d’un micromètre. Cependant, ce nombre a chuté à 72 heures en culture alors que seulement 40 % des cellules étaient phagocytaires montrées ici.

Les gobelets pour cellules incubées avec des nanotubes de carbone fonctionnalisés pendant 24 et 72 heures avaient des morphologies similaires par rapport aux cellules naïves. En revanche, la tasse pour cellules incubées avec 10 % de DMSO utilisée comme témoin positif a montré une morphologie nécrotique après l’analyse de la dose modifiée de LDH pour les cellules traitées avec 10 % de DMSO pendant 24 et 72 heures a montré une toxicité élevée en comparaison, les fcts ont induit une réduction légère mais significative de la viabilité cellulaire uniquement lorsque les cellules ont été exposées à 50 microgrammes par millilitre pendant 72 heures. En suivant cette méthode, d’autres cellules souches embryonnaires et tous les types de nanoparticules peuvent être testés à l’aide de cellules ké isolées.

Cela permet de collecter des données fiables tout en minimisant l’utilisation d’animaux. Nous espérons que cette technique pourra aider les chercheurs dans le domaine de la psychologie des nanotechnologies à dépister la sécurité des nombreux nano-porteurs prometteurs de plus en plus développés.