Kupffer cellule d'isolement pour les essais de toxicité des nanoparticules

L'objectif général de l'expérience suivante est d'isoler et de purifier un grand nombre de cellules cup pour étudier la toxicité des nanoparticules. Cette isolation est réalisée en perfusant les foies de souris avec une solution H-B-S-S-E-G-T-A et une solution de collagénase destinée à digérer délicatement le tissu hépatique. Ensuite, les cellules hépatiques sont purifiées par centrifugation par gradient de densité et par adhésion sélective afin d'obtenir une culture de cellules cup purifiées.

Ensuite, une analyse par cytométrie en flux est réalisée afin de confirmer la pureté et les propriétés acides F des cellules cup. Les résultats obtenus montrent que la toxicité des nanotubes de carbone fonctionnalisés peut être mesurée dans les cellules cup. Selon le modèle modifié de L-D-H-S-A, ce système peut être appliqué aux essais de toxicité des nanoparticules.

La méthode que nous souhaitons vous présenter aujourd’hui peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la nanotoxicologie, par exemple en évaluant la toxicité de nouveaux vecteurs médicamenteux récemment mis au point. Ceci revêt une grande importance, car la plupart des lignées cellulaires immortalisées utilisées présentent des propriétés significativement différentes de celles des tissus dont elles sont issues. Une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle. Si la méthode est correctement réalisée, elle permet d’obtenir un rendement élevé et une grande pureté de cellules ke, qui pourront ensuite servir de modèle pour cribler diverses nanoparticules en vue d’évaluer leur toxicité.

Après avoir préparé fraîchement tous les réactifs énumérés dans le tableau des matériaux et réactifs figurant dans le protocole accompagnant le texte, réchauffez la solution E-G-T-A-H-B-S-S et la solution de collagénase à 40 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis rincez le tube souple de la pompe avec de l’éthanol à 70 %. Versez ensuite 40 millilitres de solution E-G-T-A-H-B-S-S dans un tube de centrifugeuse immergé dans le bain-marie, et rincez le tube souple de la pompe avec la solution E-G-T-A-H-B-S-S préalablement réchauffée. Après avoir euthanasié une souris CD1 conformément au protocole décrit dans le texte, rasez les poils abdominaux et désinfectez la surface abdominale à l’aide d’éthanol à 70 %.

Confirmer l'anesthésie par une pincée du orteil. Inciser la cavité abdominale et exposer la veine porte et la veine cave inférieure en déplaçant l'intestin latéralement vers la gauche de l'abdomen. Démarrer la pompe à une vitesse de un à trois millilitres par minute avec la solution E-G-T-A-H-B-S-S et, à l’aide d’une aiguille papillon de calibre 23, canuler la veine porte, pincer la section canulée de la veine porte, puis retourner la pince hépato-duodénale à la surface de l’abdomen ouvert de la souris.

Le foie doit devenir pâle dans les 30 premières secondes de la perfusion ; incisez rapidement la partie inférieure de la veine cave inférieure pour éviter une accumulation excessive de pression dans le foie, puis augmentez progressivement le débit à sept millilitres par minute au cours de la première minute de perfusion. Lorsqu’il reste moins de cinq millilitres de solution E-G-T-A-H-B-S-S dans le tube à centrifuger, ajoutez 40 à 50 millilitres de solution de collagénase, puis augmentez progressivement le débit à 10 millilitres par minute en 30 secondes.

Faites gonfler le foie en utilisant une pince pour appliquer périodiquement une pression à la veine cave inférieure pendant des intervalles de 10 à 32 secondes. Cela améliorera la dissociation cellulaire et réduira le temps de perfusion avec la collagénase. Lorsqu'il reste moins de 10 millilitres de solution de collagénase dans le tube de centrifugation, ajoutez un volume supplémentaire de 40 à 50 millilitres de solution de collagénase préchauffée dans le tube.

Ensuite, une fois que 70 à 80 millilitres ont été perfusés, utilisez une pince pour appliquer une légère pression à la surface. Une marque de dépression indique que les cellules hépatiques sont dissociées. Retirez le foie de la cavité abdominale en un seul morceau et placez-le dans un tube à centrifuger contenant 20 à 30 millilitres de milieu pour l'isolement cellulaire.

Gardez les cellules hépatiques sur de la glace pendant trois heures au maximum et regroupez jusqu'à trois foies pour la purification afin d'obtenir le milieu destiné aux cellules. Placez un foie perfusé dans une boîte de Pétri contenant 15 millilitres de milieu pour l'isolement des cellules, à l’aide de ciseaux ou de pinces. Rompez la capsule brillante et libérez toutes les cellules hépatiques dans le milieu.

Filtrer la solution à travers un tamis cellulaire de 100 micromètres dans un tube de centrifugation. Ensuite, centrifuger la suspension cellulaire à 50 GS à quatre degrés Celsius pendant deux minutes. Les cellules parenchymateuses se trouveront dans le culot et les cellules non parenchymateuses seront dans le surnageant.

Recueillir le surnageant dans un tube de centrifugation propre et centrifuger à 50 gs pendant deux minutes. Répéter jusqu'à un total de quatre transferts et centrifugations. Centrifugation suivante.

Le surnageant est éliminé après centrifugation à 1 350 ×g pendant 15 minutes. Pour former un culot des cellules non parenchymateuses, jetez le surnageant et resuspendez le culot dans 10 millilitres de milieu d'isolement des cellules cup, puis ajoutez la solution des cellules non parenchymateuses au gradient isotonique discontinu 25-50 % préparé précédemment selon le protocole décrit dans le texte et centrifugez à 850 ×g pendant 15 minutes sans accélération ni freinage. À l’aide d’une pipette serologique de 10 millilitres, aspirez environ 12 millilitres de la fraction enrichie en cellules cup, qui apparaît trouble, située dans la fraction 25 % SIP près de l’interface 25-50 % SIP.

Transférez les cellules dans un tube de centrifugeuse contenant 35 à 40 millilitres de milieu pour l'isolement des cellules, mélangez délicatement, puis centrifugez à 1 350 ×g et 4 °C pour former un culot cellulaire. Jetez le surnageant et utilisez 5 à 10 millilitres de milieu préchauffé pour resuspendre les cellules. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et mesurez la viabilité à l’aide de la coloration au bleu de trypan. Ensemencez les cellules non parenchymateuses purifiées dans des plaques de 24 puits à une densité de 5 × 10⁵ cellules par puits.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Ensuite, retirer délicatement le milieu. Utiliser du HBSS préchauffé pour laver les cellules et le remplacer par 500 microlitres par puits de milieu de culture cellulaire frais préchauffé.

Replacer les cellules à 37 degrés Celsius pendant au moins quatre heures pour permettre leur adhérence avant le traitement avec des nanoparticules. Après avoir caractérisé la pureté et l'activité phagocytaire des cellules C et après incubation avec des nanotubes de carbone fonctionnalisés ou fcts comme décrit dans le protocole du texte, éliminer le surnageant et ajouter 200 microlitres par puits de tampon de lyse. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes, effectuer un pipetage vigoureux et recueillir les cellules lysées dans des tubes de microcentrifugeuse.

Ensuite, centrifuger à 20 000 ×g pendant 10 minutes pour précipiter les fcn ts qui ont été internalisées par les cellules sur les débris cellulaires. Recueillir le surnageant dans des tubes de microcentrifugeuse et le conserver à moins 20 degrés Celsius. En alternative, transférer 50 microlitres dans une plaque de 96 puits et ajouter un volume équivalent de solution de mélange de substrat provenant du kit de lactate déhydrogénase.

Inclure des puits témoins en triple contenant chacun 50 microlitres de tampon de lyse et 50 microlitres de solution de mélange de substrat. Ensuite, couvrir la plaque et incuber à température ambiante pendant 15 minutes avant d'ajouter 50 microlitres de solution d'arrêt. Enfin, mesurer l'absorbance à 490 nanomètres à l'aide d'un lecteur de microplaques et utiliser la formule suivante pour calculer le pourcentage de viabilité cellulaire.

Cette figure illustre que le nombre de cellules non parenchymateuses purifiées varie entre huit et quatorze fois dix puissance six cellules par souris et par foie. La coloration bleue a révélé une viabilité cellulaire d'environ 95 %. Les cellules adhérentes prenaient une forme arrondie dans les 30 minutes suivant l'incubation, puis s'étalaient au bout de quatre heures, et des agrégats commençaient à se former, comme on le voit ici.

Les cellules ont été marquées avec l'anticorps F four 80 afin de démontrer la pureté des cupules, qui a été mesurée à plus de 95 % par cytométrie en flux. De plus, après 12 heures en culture, l'analyse par cytométrie en flux a montré que 85 % des cellules présentaient une activité acide PHA, évaluée par leur capacité à internaliser des billes fluorescentes d'un micromètre. Toutefois, ce pourcentage a chuté après 72 heures de culture, lorsque seules 40 % des cellules restaient phagocytaires, comme indiqué ici.

Les cupules des cellules incubées avec des nanotubes de carbone fonctionnalisés pendant 24 et 72 heures présentaient des morphologies similaires à celles des cellules naïves. En revanche, les cupules des cellules incubées avec 10 % de DMSO utilisées comme témoin positif affichaient une morphologie nécrotique ; l’analyse de l’essai modifié de LDH a révélé que les cupules des cellules traitées avec 10 % de DMSO pendant 24 et 72 heures présentaient une forte toxicité en comparaison. Les fcts ont induit une réduction légère mais significative de la viabilité cellulaire uniquement lorsque les cellules ont été exposées à 50 microgrammes par millilitre pendant 72 heures. Selon cette méthode, d'autres cellules SC basées sur des cultures et tous les types de nanoparticules peuvent être testés à l'aide de cellules ke isolées.

Cela permet de recueillir des données fiables tout en minimisant l'utilisation d'animaux. Nous espérons que cette technique pourra aider à ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine de la psychologie des nanotechnologies, afin qu'ils puissent évaluer la sécurité des nombreux nanotransporteurs prometteurs dont le développement s'intensifie de plus en plus.