Molecular Probe optimisation pour déterminer la mortalité cellulaire dans un organisme photosynthétique (

L'objectif général de cette procédure est de montrer comment créer un protocole capable d'analyser efficacement l'état physiologique des cyanobactéries à l'aide de la cytométrie en flux et de sondes moléculaires. Ce protocole peut aider à répondre à des questions clés concernant la physiologie cellulaire des communautés microbiennes. Le principal avantage de cette procédure réside dans le fait qu'un protocole optimisé utilisant des sondes fluorescentes permet de distinguer, en temps réel et au niveau de la cellule individuelle, les différents états physiologiques des cyanobactéries.

David Hartnell, étudiant au doctorat travaillant au laboratoire de cytométrie de l'Université de Bournemouth, démontrera cette procédure. Avant de commencer l'expérience, placez un tube d'hémolyse vide sur la sonde d'injection de l'échantillon. Cliquez sur déboucher.

Ensuite, effectuez un lavage rétrograde pour démarrer le processus de nettoyage de la cytométrie en flux. À la fin du lavage rétrograde, chargez un nouveau tube d’hémolyse contenant deux millilitres d’eau filtrée ultra pure sur la sonde d’injection d’échantillon (SIP) et réglez la durée limite à 10 à 15 minutes, ainsi que la vitesse fluidique sur rapide. Ensuite, sélectionnez une nouvelle cellule de données et réglez les seuils de fluorescence et de diffusion de la lumière appropriés afin de réduire le bruit de fond.

Ensuite, cliquez sur exécuter. Si le nombre total d'événements par seconde n'est pas inférieur à la recommandation du fabricant, faites circuler deux millilitres de solution de décontamination pendant deux minutes à vitesse rapide. Répétez ensuite les étapes de rétro-lavage et de rinçage à l'eau ultra-pure.

Pour préparer un microcétum primaire de M.aeruginosa, stériliser à l'autoclave 98 millilitres d'eau filtrée ultra pure, mélangés avec deux millilitres de milieu algal, dans un bécher de 250 millilitres pendant 20 minutes à 120 degrés Celsius. Lorsqu'une culture atteint une densité élevée en état stationnaire, désagréger deux millilitres de cellules par vortex. Puis transférer les cellules sous la sonde d'injection d'échantillon.

Confirmez que les cellules sont uniformément dispersées par microscopie optique. Sélectionnez ensuite un tracé d'histogramme dans le logiciel du cytomètre en flux pour enregistrer les données de diffusion avant de la lumière. Cliquez sur log pour afficher les données selon une échelle logarithmique sur l'axe des abscisses.

Dans une sortie distincte, configurez un autre histogramme à axe logarithmique pour enregistrer la fluorescence naturelle des cellules de M.aeruginosa. Ensuite, sélectionnez une source lumineuse capable d'exciter la phycocyanine, ainsi qu'un détecteur qui peut filtrer les émissions provenant de la fluorescence induite. Pour l'enregistrement à la résolution maximale, choisissez les paramètres les plus proches de la taille du noyau de l'organisme cible.

Et réglez un débit relativement lent. Avant d'acquérir les données, définissez un seuil pour exclure toute diffusion de la lumière et tout signal de fluorescence causé par le bruit électronique de fond ou les débris de l'échantillon cellulaire. Ensuite, sélectionnez une nouvelle cellule de données.

Créez un graphique de densité avec les paramètres de diffusion avant et latérale sur une échelle logarithmique, puis cliquez sur exécuter. Appliquez ensuite la porte de diffusion avant et de fluorescence naturelle aux données de diffusion avant par rapport à la diffusion latérale afin d'exclure tout signal de faible diffusion et de ne conserver que les signaux de phycocyanine à fluorescence relative plus élevée. Ensuite, collectez les événements jusqu'à ce que l'échantillon soit terminé, et utilisez les données pour déterminer le nombre initial de cellules.

Pour optimiser l'absorption cellulaire de la sonde moléculaire, exposez la moitié de la monoculture préparée précédemment aux conditions appropriées afin de générer un témoin mort. Vérifiez les variations du microenvironnement de l'échantillon pour confirmer la mort de la culture. Ensuite, dissociez la formation des colonies comme vient de l'être démontré.

Ensuite, sélectionnez un laser de 488 nanomètres associé à un détecteur capable d'enregistrer la fluorescence des sondes d'acides nucléiques vertes et oranges. Et le laser de 640 nanomètres pour enregistrer les signaux de la phycoérythrine via leurs détecteurs respectifs. Dans une nouvelle feuille de données, configurez un diagramme de densité avec les paramètres de diffusion avant et latérale.

Ensuite, créez un histogramme en utilisant le canal du détecteur optique du sondage moléculaire correspondant. Un histogramme pour détecter les émissions de phycocyanine, et un histogramme pour les événements de diffusion avant, le tout sur une échelle logarithmique. Analysez les échantillons de cyanobactéries en utilisant différentes concentrations et durées d'incubation.

Créez une fenêtre dans l'histogramme de la diffusion avant afin d'inclure uniquement les événements correspondant à la taille cellulaire de l'organisme cible. Appliquez-la ensuite au canal correspondant de la sonde fluorescente. Ensuite, dans le canal de la sonde fluorescente, créez une autre fenêtre logicielle inclusive autour du pic le plus élevé de l'histogramme.

Ensuite, sélectionnez la fluorescence correspondante de la sonde positive sur le tracé de densité. Comparez le nombre de signaux de fluorescence au nombre de cellules mortes du contrôle, où le pourcentage le plus élevé d'absorption de la sonde nucléique cellulaire n'entraîne pas de coloration non spécifique. Pour tester le recouvrement d'interférence de fluorescence dû à une coloration cellulaire intrinsèque ou non spécifique, sélectionnez les données issues du mélange de culture composé à 50 pour cent de cellules vivantes et à 50 pour cent de cellules mortes.

Et retirez les fenêtres fluorescentes. Appliquez des fenêtres pour inclure uniquement l'histogramme de la diffusion avant correspondant à la taille cellulaire de l'organisme cible sur l'histogramme du canal phycocyanine. Délimitez les pics de phycocyanine les plus élevés et les plus bas, et étiquetez-les respectivement « vivants » et « morts ».

Appliquez ensuite séparément les seuils aux signaux de phycoérythrine des cellules vivantes et mortes. Et enregistrez les deux longueurs d'onde moyennes. Pour déterminer la sensibilité du protocole, calculez le rapport entre les longueurs d'onde moyennes de la fluorescence du marqueur moléculaire positif pour les cellules mortes et du signal intrinsèque non spécifique des cellules vivantes.

Enfin, sélectionnez le protocole optimisé dans lequel la plus grande quantité de cellules mortes a été marquée, sans apparition de marquage non spécifique. Sur ces graphiques, les résultats représentatifs de la diffusion avant et latérale de la lumière, correspondant à la taille cellulaire et à la complexité interne d'une culture en lot de M.aeruginosa en phase exponentielle, sont présentés. Le réglage de la fenêtre d'analyse peut être effectué en affinant les données entre certains points du signal de diffusion avant de la lumière.

La phycoérythrine produit un signal intense lorsqu'elle est excitée par une source de lumière rouge, ce qui peut être utilisé pour affiner le tri des populations d'intérêt. À partir de la diffusion de la lumière directe et des signaux fluorescents, les données peuvent ensuite être triées à partir du résultat initial, afin d'obtenir des données spécifiques sur l'échantillon de M.aeruginosa pour le décompte final des cellules. Lorsque des contrôles vivants fortement pigmentés et des contrôles morts faiblement pigmentés sont mélangés, la diminution du décalage de la fluorescence naturelle devient évidente.

Dans les cellules dont la membrane est altérée, les sondes d'acides nucléiques produisent un signal supplémentaire observable par cytométrie en flux et pouvant être confirmé ultérieurement par microscopie à épifluorescence. La discrimination par fluorescence entre les cellules vivantes et mortes augmente avec le temps aux concentrations comprises entre 0,05 et 0,5 micromolaire, mais diminue aux concentrations comprises entre 1 et 100 micromolaires pour les deux sondes. En effet, la concentration optimale pour la sonde d'acide nucléique verte semble être de 0,5 micromolaire avec un temps d'incubation de 30 minutes.

Pour la sonde d'acide nucléique orange, la concentration optimale est d'un micromolaire pour une incubation de 10 minutes. Une fois maîtrisée, l'optimisation peut être réalisée en une journée pour chaque sonde moléculaire, à condition qu'elle soit effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de veiller à maintenir les sondes dans un environnement stable, aux température, pH et conditions de lumière appropriés.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la microbiologie pour explorer l'hétérogénéité des communautés de phytoplancton. Après avoir visionné la vidéo, vous devriez maintenant bien comprendre comment élaborer un protocole optimal pour évaluer la physiologie cellulaire à l’aide de la cytométrie en flux et de sondes moléculaires. N’oubliez pas que le travail avec des sondes moléculaires et des organismes toxiques peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port des équipements de protection individuelle appropriés (E.P.I.) et la connaissance complète des fiches d’information sur les risques liés aux substances chimiques (COSHH) doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.