Molecular Probe optimisation pour déterminer la mortalité cellulaire dans un organisme photosynthétique ( Microcystis aeruginosa) Par cytométrie en flux

L’objectif général de cette procédure est de démontrer comment créer un protocole capable d’analyser efficacement l’état physiologique des cyanobactéries, à l’aide de la cytométrie en flux et de sondes moléculaires. Ce protocole peut aider à répondre à des questions clés sur la physiologie cellulaire des communautés microbiennes. Le principal avantage de cette procédure est qu’un protocole de sonde fluorescente optimisé permet de distinguer en temps réel les états physiologiques des cyanobactéries au niveau cellulaire individuel.

David Hartnell, un doctorant travaillant au laboratoire de cytométrie de l’Université de Bournemouth, fera la démonstration de cette procédure. Avant de commencer l’expérience, placez un tube d’hémolyse vide sur la sonde d’injection d’échantillon. Cliquez sur déloger.

Ensuite, rincez à contre-courant pour démarrer le processus de nettoyage par cytométrie en flux. À la fin du rinçage à contre-courant, chargez un nouveau tube d’hémolyse contenant deux millilitres d’eau filtrée ultra pure sur la sonde d’injection d’échantillon, ou SIP, et réglez la limite de temps sur 10 à 15 minutes et la vitesse fluidique sur rapide. Ensuite, sélectionnez une nouvelle cellule de données et définissez les seuils de fluorescence et de diffusion de la lumière appropriés pour réduire le bruit de fond.

Cliquez ensuite sur Exécuter. Si le nombre total d’événements par seconde n’est pas inférieur à la recommandation du fabricant, faites fonctionner deux millilitres de solution de décontamination pendant deux minutes à un rythme rapide. Et répétez les étapes de rinçage à contre-courant et de rinçage à l’eau ultra pure.

Pour préparer une monoculture primaire de M. aeruginosa, autoclavez 98 millilitres d’eau filtrée ultra pure, mélangés à deux millilitres de milieu algal, dans un bécher de 250 millilitres pendant 20 minutes à 120 degrés Celsius. Lorsqu’une culture est dans une densité élevée à l’état d’équilibre, désagrégez deux millilitres de cellules par vortex. Ensuite, transférez les cellules sous la sonde d’injection d’échantillon.

Confirmez que les cellules sont uniformément dispersées par la microscopie optique. Sélectionnez ensuite un tracé d’histogramme sur le logiciel de cytomètre en flux pour enregistrer les données de diffusion de la lumière vers l’avant. Cliquez ensuite sur log pour afficher les données dans une échelle logarithmique sur l’axe x.

Dans une sortie séparée, définissez un autre histogramme d’axe logarithmique pour enregistrer la fluorescence naturelle des cellules de M. aeruginosa. Ensuite, sélectionnez une source lumineuse capable d’exciter la phycocyanine et un détecteur capable de filtrer les émissions de la fluorescence résultante. Pour l’enregistrement à la résolution la plus élevée, sélectionnez les paramètres les plus proches de la taille de la carotte de l’organisme cible.

Et réglez un débit relativement lent. Avant d’acquérir les données, définissez un seuil pour éliminer toute diffusion de la lumière et tout signal de fluorescence causés par le bruit de fond électronique ou les débris d’échantillons de cellules. Sélectionnez ensuite une nouvelle cellule de données.

Créez un graphique de densité avec des paramètres de diffusion vers l’avant et sur les côtés sur une échelle logarithmique, puis cliquez sur Exécuter. Appliquez maintenant la diffusion de la lumière vers l’avant et la porte de fluorescence naturelle aux données de diffusion vers l’avant pour exclure tout signal de diffusion de bas niveau et pour n’inclure que les signaux de phycocyanine de fluorescence relative plus élevée. Collectez ensuite les événements jusqu’à ce que l’échantillon soit terminé et utilisez les données pour déterminer le nombre initial de cellules.

Pour optimiser l’absorption des cellules de la sonde moléculaire, exposez la moitié de la monoculture préalablement préparée aux conditions appropriées pour générer un témoin mort. Vérifiez les variations dans le micro-environnement de l’échantillon pour confirmer la mort de la culture. Et puis désagréger la formation de la colonie comme nous venons de le démontrer.

Ensuite, sélectionnez un laser de 488 nanomètres à côté d’un détecteur capable d’enregistrer la fluorescence des sondes d’acide nucléique vertes et orange. Et le laser de 640 nanomètres pour enregistrer les signaux de phycocyanine à travers leurs détecteurs respectifs. Dans une nouvelle fiche technique, configurez un graphique de densité avec les paramètres de diffusion directe et latérale.

Créez ensuite un histogramme à l’aide du canal de détection optique de la sonde moléculaire correspondant. Un histogramme pour détecter les émissions de phycocyanine et un histogramme pour les événements de diffusion directe, le tout sur une échelle logarithmique. Analysez les échantillons de cyanobactéries en utilisant différentes concentrations et durées d’incubation.

Créez une porte dans l’histogramme de diffusion directe pour inclure uniquement les événements avec la taille de cellule de l’organisme cible. Et appliquez-le sur le canal de sonde de fluorescence correspondant. Ensuite, dans le canal de la sonde de fluorescence, créez une autre porte logicielle inclusive contre le pic le plus élevé de l’histogramme.

Et par la suite, fixez la fluorescence positive de la sonde correspondante sur le graphique de densité. Comparez le nombre de signaux de fluorescence au nombre de cellules de contrôle mortes, où le pourcentage le plus élevé d’absorption de sonde nucléique cellulaire ne produit pas de coloration non spécifique. Pour tester le chevauchement de l’interférence de fluorescence avec la coloration cellulaire intrinsèque ou non spécifique, sélectionnez les données de culture mixte 50 % vivantes et 50 % mortes.

Et retirez les portes fluorescentes. Appliquez des portes pour inclure uniquement l’histogramme de diffusion directe de la taille des cellules de l’organisme cible sur l’histogramme du canal phycocyaninique. Fixer les pics de phycocyanine les plus hauts et les plus bas, et les étiqueter vivants et morts, respectivement.

Ensuite, appliquez séparément les portes aux signaux de phycocyanine sous tension et morts. Et enregistrez les deux longueurs d’onde moyennes. Pour déterminer la sensibilité du protocole, rapportez les longueurs d’onde moyennes de la fluorescence positive de la sonde moléculaire morte et le signal en direct non spécifique intrinsèque.

Enfin, sélectionnez le protocole optimisé où la plus grande quantité de cellules mortes a été colorée sans apparition de coloration non spécifique. Dans ces graphiques, les sorties représentatives de diffusion de la lumière vers l’avant et sur les côtés, pour la taille cellulaire et la complexité interne d’une culture par lots de M. aeruginosa dans la phase exponentielle, sont montrées. Le déclenchement peut être effectué en affinant les données entre certains points de la sortie de diffusion de la lumière vers l’avant.

La phycocyanine produit un signal fort lorsqu’elle est interrogée par une source de lumière rouge, qui peut être utilisée pour cibler davantage les populations d’intérêt. À partir de la diffusion directe de la lumière et des signaux fluorescents, les données peuvent ensuite être contrôlées à partir de la sortie d’origine jusqu’à des données spécifiques sur l’échantillon de M. aeruginosa pour le comptage final des cellules. Lorsque des témoins vivants plus pigmentés et des témoins morts faiblement pigmentés sont mélangés, le décalage décroissant de l’autofluorescence devient clair.

Dans les cellules à membrane compromise, les sondes d’acide nucléique produisent un signal supplémentaire qui peut être observé par cytométrie en flux et confirmé par microscopie à épifluorescence. La discrimination de fluorescence entre les cellules vivantes et mortes augmente avec le temps entre les concentrations de 0,05 et 0,5 micromolaire, mais diminue entre les concentrations d’un et de 100 micromolaires pour les deux sondes. En effet, la concentration optimale pour la sonde d’acide nucléique vert semble être de 0,5 micromolaire avec un temps d’incubation de 30 minutes.

Pour la sonde d’acide nucléique orange, la concentration optimale est d’une micromolaire pour une incubation de 10 minutes. Une fois maîtrisée, pour chaque sonde moléculaire, l’optimisation peut être réalisée en une journée, si elle est réalisée correctement. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de conserver les sondes dans un environnement stable, dans des conditions de température, de pH et de lumière appropriées.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la microbiologie pour explorer l’hétérogénéité des communautés de phytoplancton. Après avoir regardé la vidéo, vous devriez maintenant avoir une bonne compréhension de la façon de développer un protocole optimal pour évaluer la physiologie cellulaire à l’aide de la cytométrie en flux et des sondes moléculaires. N’oubliez pas que travailler avec des sondes moléculaires et des organismes toxiques peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port du P.P.E. approprié et la compréhension complète des matériaux COSHH doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.