Amélioration du dénombrement des spores de Bacillus subtilis et de l’analyse des marquages en cytométrie en flux

Le comptage cellulaire des spores de Bacillus subtilis à l’aide de méthodes traditionnelles peut être une tâche laborieuse, car ces méthodes peuvent être entièrement manuelles et leur précision dépend de l’expérience de l’opérateur. Ce protocole permet le dénombrement des spores dormantes et en germination. De plus, la technique permet également de déterminer le pourcentage d’adaptation des protéines fluorescentes à sa surface.

Compte tenu de l’étape de mise en place présente dans ce protocole, la vision démontre avec les installations, la compréhension technique et le détail des soins dans cette exécution. Commencez par vous connecter au logiciel du cytomètre. Dans l’espace de travail du logiciel, sélectionnez Cytomètre, puis Démarrage fluidique.

Choisissez ensuite Modes de nettoyage. Et enfin, lancez SIT Flush. Prenez 50 microlitres de spores d’autoclave et incubez-les avec du bromure d’éthidium à un facteur de dilution de 0,05% volume par volume pendant 30 minutes à l’abri de la lumière.

Lavez les spores trois fois avec du PBS en centrifugeant à 17 949 G pendant 10 minutes et en les remettant en suspension dans du PBS. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de billes en suivant les recommandations du fabricant pour la dilution et analysez l’échantillon à l’aide d’un cytomètre en flux. Définir la stratégie de déclenchement en fonction des caractéristiques morphométriques et de fluorescence des particules en utilisant le témoin négatif comme référence.

Mélangez ensuite le tube délicatement. Attachez-le à la sonde du cytomètre en flux et cliquez sur Acquérir. Pour régler la puissance du laser, allez dans l’onglet paramètres de la fenêtre du cytomètre, réglez la diffusion vers l’avant sur 375 et la diffusion latérale sur 275.

Sélectionnez ensuite l’onglet Seuil et définissez-le sur 500. Ensuite, analysez l’échantillon sans colorant contenant uniquement des spores pour éliminer l’autofluorescence. Dans l’onglet des paramètres, ajustez les tensions du détecteur de filtre trois sur 603 et les tensions du détecteur de filtre cinq sur 538 pour différencier les populations négatives des populations positives à l’aide de la fluorescence dans les témoins.

Cliquez ensuite sur Compensation et définissez le décalage de configuration du détecteur de filtre 5 par 3 sur un. Pour configurer l’appareil pour l’acquisition, sélectionnez Expérimenter, choisissez la disposition de l’expérience et définissez l’acquisition sur 30 000 événements. Après avoir ajusté les paramètres, acquérez des données pour les échantillons qui sont étiquetés et contiennent des billes dans le cytomètre en flux.

Centrifuger 50 microlitres de spores à 17, 949 G pendant 10 minutes. Ensuite, remettez les spores en suspension à l’aide de 25 microlitres de carbodiimide de 1-éthyl-3-3-diméthylaminopropyl et incubez pendant 15 minutes. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de N-hydroxysulfosuccinimide à une concentration de 50 millimolaires à la suspension de spores.

Incuber la suspension de spores à température ambiante pendant 30 minutes. Lavez les spores trois fois avec du PBS en centrifugeant comme indiqué précédemment. Ajoutez des protéines fluorescentes aux échantillons et incubez-les pendant la nuit à 15 degrés Celsius.

Ajoutez 10 milligrammes par millilitre de bromure d’éthidium dilué à 1 à 50, puis laissez les échantillons sur de la glace pendant une heure, à l’abri de la lumière. Après avoir lavé les spores et défini les portes comme indiqué précédemment, modifiez les paramètres du détecteur de filtre trois sur l’axe des x et du détecteur de filtre cinq sur l’axe des y du graphique à points. La méthode de comptage des billes a détecté deux fois 10 à trois spores par microlitre dans les échantillons de spores en autoclave.

Une coloration au bromure d’éthidium d’échantillons de spores d’autoclave a montré une intensité de fluorescence moyenne plus élevée que la coloration de spores non autoclavées, ce qui indique une coloration plus importante du matériel génétique. La surface des spores de l’autoclave, associée à l’anticorps anti-interleukine 10 humain marqué par APC, a montré une plus grande efficacité de couplage par rapport aux spores non autoclavées. La présence de spores perméables au bromure d’éthidium indique la présence possible de spores germées dans l’ensemble de la population.

Sur la base des analyses de cytométrie en flux, il a été observé que l’anticorps fluorescent présentait un pourcentage plus élevé de couplage avec les spores dormantes par rapport aux spores germées. De plus, à mesure que la concentration d’anticorps fluorescents augmentait, une augmentation du pourcentage de spores couplées et de l’intensité moyenne de fluorescence a été observée. Il est important d’effectuer une homogénéisation complète des billes de courant pour assurer des lectures précises grâce à la cytométrie en flux et au dénombrement précis des spores.

En normalisant la concentration d’antigènes attachés aux spores, des études canadiennes analysent l’utilisation des spores comme anticorps vaccinaux.