Solide Lipid nanoparticules (SLN) Applications pour le ciblage intracellulaire

L’objectif global de cette procédure est de synthétiser de très petites populations de nanoparticules biocompatibles, de caractériser leurs propriétés physiques et d’étudier les interactions entre les cellules particulaires. Pour ce faire, on utilise d’abord la méthode d’inversion de température de phase pour synthétiser les nanoparticules lipidiques. Au cours de ce processus, le lipide et le tensioactif sont d’abord cofondus.

Après avoir ajouté une quantité spécifique d’eau, le mélange est chauffé jusqu’à ce que la séparation de phase se produise. Le mélange est ensuite agité en continu jusqu’à ce qu’une nanoémulsion soit créée et que la synthèse de nanoparticules lipidiques solides ou sln soit terminée. Ensuite, la diffusion dynamique de la lumière ou DLS est utilisée pour mesurer la taille des particules et la polydispersité.

La calorimétrie différentielle à balayage ou DSC est une technique supplémentaire utilisée pour déterminer le point de fusion et la chaleur latente de la fusion afin de caractériser davantage les particules, en fin de compte, la microscopie à fluorescence et la cytométrie en flux peuvent être utilisées pour étudier les interactions entre les cellules de particules. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes à haute énergie existantes telles que le microfluide par ultrasonication et l’homogénéisation à haute pression, est qu’il s’agit d’une technique de synthèse relativement douce, à la fois simple et évolutive. Pour synthétiser le LNS, combinez 0,6 milligramme de colorant fluorescent ou d’un autre composé lipophile et 0,10 gramme d’alcan linéaire ou de lipide.

Dans un flacon de 15 millilitres, faites fondre les composants à 90 degrés Celsius et mélangez, ajoutez 0,11 gramme d’un tensioactif linéaire non ionique. Ensuite, mlt le mélange obtenu à 90 degrés Celsius et remuez. Ensuite, ajoutez 1,79 gramme d’eau stérile au mélange, chauffez à 90 degrés Celsius et surveillez visuellement la solution jusqu’à ce que deux phases soient observées.

Remuez maintenant le mélange jusqu’à ce qu’une nano-émulsion transparente se forme. Préparez une nano-émulsion séparée en parallèle sans ajouter de colorant fluorescent afin de servir d’échantillon de contrôle. Stérilisez davantage chaque nano-émulsion à l’aide d’un filtre stérile de 0,2 micron

Utiliser DLS pour mesurer la taille des particules et la polydispersité des S lns à l’aide d’un verre dans une conception d’instrument Pour mesurer la taille des particules Avant la mesure des échantillons, la taille des particules de deux étalons connus doit être mesurée conformément au protocole du fabricant pour la préparation et la mesure des étalons. Ensuite, mesurez les échantillons tels qu’ils ont été préparés pour chacun. Utilisez une durée de fonctionnement de 100 secondes, l’indice de réfraction de l’eau et la viscosité de l’eau à 20 degrés Celsius.

Rapportez le diamètre moyen des particules et la polydispersité de la distribution granulométrique pour étudier le comportement thermique des S LNS à l’aide de la DSC : la première pipette du S LNS dans une casserole en aluminium de 40 microlitres d’une masse d’environ 25 milligrammes. Fermez hermétiquement la casserole à l’aide d’une presse à sertir universelle pour minimiser la perte d’humidité pendant le balayage DSC. Avant de mesurer chaque nano-émulsion de cinq à 80 degrés Celsius, indiquez le point de fusion et la chaleur latente de fusion à partir du graphique DSC où la vallée représente le point de fusion et l’intégrale de l’aire sous la courbe.

Dans le graphique DSC, divisé par la quantité de matière représente la chaleur latente de la culture en fusion. Fibroblastes humains primaires selon les instructions du fabricant en milieu liquide pour la culture de fibroblastes dermiques humains. Complété par le kit de supplément à faible croissance sérum, maintenez les cellules dans une atmosphère humidifiée à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone et une sous-culture à 80 % de confluence pour les cellules souches de MTT et d’analyse d’imagerie.

Dans une plaque de 96 puits à une densité de 20 000 cellules par puits. Laisser les cellules s’équilibrer à 37 degrés Celsius pendant la nuit avant l’exposition au SLN à temps zéro diluer les SLM dans un milieu complet pour atteindre la concentration lipidique souhaitée et ajouter 10 microlitres par puits à chaque puits répliqué dans la plaque à 96 puits après 24 heures d’incubation avec des SLN dilués, déterminer la viabilité cellulaire à l’aide du test MTT conformément au protocole du fabricant. Lavez les cellules une fois et ajoutez 100 microlitres de milieu frais à chacune.

Bien tuer les puits témoins en les incubant dans une solution de méthanol à 70 % pendant 10 minutes avant de les remplacer par un milieu frais. Ajoutez le réactif MTT à raison de 10 microlitres par puits dans chaque puits de la microplaque et incubez pendant la nuit à 37 degrés Celsius après une nuit d’incubation, solubilisez la forme intracellulaire et les cristaux avec 100 microlitres de la solution détergente fournie. Selon le protocole du fabricant, incubez les cellules dans la solution détergente pendant trois heures à température ambiante avant d’obtenir des valeurs d’absorbance.

Utilisation d’un lecteur de microplaques pour se préparer à la microscopie. Lavez les fibroblastes deux fois avec une solution saline stérile soufflée de phosphate. Fixez les cellules pendant 10 minutes avec du méthanol froid, à 70 % à des points de temps spécifiques après le dosage des fibroblastes avec lns.

Après 10 minutes, remplacez le méthanol par une solution saline tamponnée au phosphate ou PBS avant de capturer des images à l’aide d’un microscope inversé. La synthèse du S SLN a donné un contrôle S LNS d’un diamètre moyen de particule de 18,59 et d’une polydispersité de 5,83 et des SLM chargés en rouge du Nil d’un diamètre moyen de 16,87 nanomètres et d’une polydispersité de 4,47 à l’aide d’un test MTT. L’effet dose-réponse sur le métabolisme cellulaire a été mesuré lorsque l’augmentation de la concentration de particules a entraîné une diminution de la viabilité cellulaire.

Aucune différence de toxicité n’a été observée entre les cellules exposées à la NMS seule et celles chargées en rouge du Nil. SLN. En parallèle, les cellules ont été examinées visuellement pour vérifier leur adhérence à la culture tissulaire. Du polystyrène et des images ont été pris pour démontrer à la fois la morphologie cellulaire représentative et l’absorption des particules fluorescentes au fil du temps, en utilisant une dose égale à cinq microgrammes par millilitre.

L’absorption de particules lipidiques a été observée deux heures après l’exposition. Le niveau d’incorporation des nanoparticules a été déterminé en mesurant l’intensité de la fluorescence rouge du Nil dans les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse murine, ou MDC B, par cytométrie en flux. Une corrélation directe entre la concentration de SNS utilisée et la quantité de fluorescence évaluée dans les MDC B a été observée.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de synthétiser de très petites populations de nanoparticules biocompatibles, de caractériser leurs propriétés physiques et d’étudier les interactions entre les cellules particulaires.