Formulation et caractérisation de nanoparticules lipidiques pour la livraison de gènes à l’aide d’une plate-forme de mélange microfluidique

Ce protocole peut être utilisé pour produire des nanoparticules lipidiques encapsulées d’acide nucléique avec une reproductibilité et une vitesse élevées et de faibles volumes. Les paramètres de formulation peuvent être réglés pour obtenir une distribution biologique souhaitée en fonction de l’application clinique. La conception standard à chevrons de la cartouche microfluidique permet un écoulement laminaire rapide, précis et contrôlé pendant le mélange.

La méthode se prête à la mise à l’échelle et génère des particules uniformes et hautement encapsulées. La plupart des produits de thérapie génique approuvés commercialement s’appuyant sur des méthodes virales, cette procédure peut fournir un aperçu de l’administration de gènes, car son approche non virale permet des applications pour lesquelles une administration répétée est nécessaire. Commencez par ajouter la quantité appropriée de chaque solution liquide sous forme de liquide dans un flacon en verre avec vortex intermittent.

comme indiqué dans le tableau, suivi de l’ajout de 200 éthanol d’épreuve à un volume final de 533 microlitres. Ajoutez ensuite la quantité appropriée de stock d’ARNm et diluez avec un tampon de citrate pour obtenir un volume final de 1,5 millilitre à la concentration souhaitée. Pour amorcer les canaux microfluidiques, entrez d’abord le paramètre d’amorçage dans le logiciel de l’instrument comme indiqué dans le tableau.

Ensuite, ouvrez le couvercle de l’instrument et placez une cartouche microfluidique dans le bloc rotatif. Chargez au moins 500 microlitres d’éthanol dans une seringue de 1 millilitre, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles ou d’espaces d’air à l’extrémité de la seringue et insérez la seringue dans l’entrée droite de la cartouche. Chargez une seringue de cinq millilitres avec 1,5 millilitre de tampon de citrate, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles d’air ou d’espaces, et insérez la seringue dans l’entrée gauche de la cartouche.

Placez deux tubes coniques de 15 millilitres dans les porte-clips pour servir de conteneurs à déchets et cliquez sur Go » pour mélanger les solutions. Lorsque l’instrument cesse de s’amorcer comme l’indique la lumière bleue inférieure qui s’éteint, ouvrez le tard et jetez correctement les tubes coniques et les seringues. Pour la formation de nanoparticules lipidiques, définissez les paramètres de formulation appropriés comme indiqué dans le tableau et chargez une seringue de 1 millilitre avec un mélange lipidique préalablement préparé.

Retirez les trous d’air ou les bulles dans l’embout de la seringue et insérez la seringue dans le côté droit de la cartouche. Chargez la solution d’acide nucléique préalablement préparée dans une seringue de 3 millilitres, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles ou d’espaces d’air dans l’embout de la seringue, et insérez la seringue dans l’entrée gauche de la cartouche. Placez un tube conique sans ARN de 15 millilitres étiqueté avec le nom de l’échantillon dans le clip du tube gauche et placez un conique de déchets de 15 millilitres dans le clip du tube droit.

Fermez le couvercle de l’instrument et cliquez sur Go.Les solutions de lipides et d’ARNm circuleront à travers la cartouche microfluidique et la solution de nanoparticules lipidiques sera collectée dans les tubes coniques. Conservez le tube conique à la fin du processus de formulation, puis diluez les nanoparticules lipidiques avec 5 millilitres de PBS et une armoire de sécurité biologique. Pour effectuer un échange tampon, prélavez d’abord un filtre ultracentrifuge de 100 kilodaltons de la taille d’un pore avec 2 millilitres de PBS, centrifugez, puis videz le PBS du compartiment inférieur.

Ajouter les nanoparticules lipidiques diluées dans le compartiment supérieur du filtre ultracentrifuge prélavé pour trois lavages à la centrifugeuse, en éliminant le flux et en ajoutant 5 millilitres de PBS au filtre ultracentrifugeur après les deux premiers lavages. Après le dernier lavage, pipettez la solution de nanoparticules lipidiques contre les parois du filtre ultracentrifuge plusieurs fois pour minimiser la perte de nanoparticules avant de transférer la solution de nanoparticules dans un flacon sans nucléase. Ajoutez ensuite du PBS pour amener la suspension de nanoparticules à la concentration expérimentale et au volume appropriés si nécessaire.

Pour évaluer l’efficacité d’encapsulation des nanoparticules lipidiques, préparez d’abord deux dilutions en série de solution d’acide nucléique de travail dans PBS pour générer une courbe standard, à partir de 500 nanogrammes par millilitre et en effectuant au moins cinq dilutions. Ensuite, préparez les dilutions de l’échantillon de nanoparticules dans le PBS pour obtenir une concentration théorique appropriée qui se situe autour du point médian de la courbe standard. Ensuite, préparez le réactif d’ARN vert ribo pour détecter la présence d’ARN à l’intérieur et à l’extérieur de la nanoparticule lipidique en mélangeant les quantités appropriées de réactif d’ARN, Triton X100 et PBS.

Ensuite, pour détecter la présence d’ARN à l’extérieur de la nanoparticule liquide, mélangez les quantités appropriées de réactifs d’ARN et de PBS uniquement. Les réplications de charge de l’étalon d’acide nucléique et des solutions de nanoparticules lipidiques dans une plaque noire de 96 puits capable de fluorescence, puis ajoutent un volume égal de réactif de quantification de l’ARN avec et sans Triton X100 à l’étalon et l’échantillon se réplique. Agiter la plaque dans le lecteur de plaques pendant cinq minutes à température ambiante à l’abri de la lumière pour obtenir un mélange complet des échantillons, puis mesurer la fluorescence sur un lecteur de microplaques à une longueur d’onde d’excitation de 480 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 520 nanomètres.

Pour mesurer la taille hydrodynamique et la polydispersité des nanoparticules lipidiques, diluez d’abord la solution de nanoparticules 40 fois dans du PBS et ajoutez la solution à une semi micro cuvette. Chargez la cuvette sur le Zetasizer et choisissez une procédure d’utilisation standard pour régler l’instrument afin de mesurer les nanoparticules en fonction de leur matériau, de leur dispersant, de leur température et de leur type de cellule. Cliquez ensuite sur Démarrer pour mesurer la taille hydrodynamique et la polydispersité des nanoparticules lipidiques.

Pour mesurer le potentiel zêta des nanoparticules lipidiques, diluer la solution de nanoparticules 40 fois dans de l’eau sans nucléase et charger la solution dans une cuvette jusqu’à la ligne de remplissage. Chargez la cuvette dans un analyseur de potentiel Zeta, en faisant attention à ce que les électrodes entrent en contact avec l’instrument, et réglez l’instrument pour mesurer le potentiel Zeta en fonction de la composition spécifique des nanoparticules lipidiques. Cliquez ensuite sur Démarrer pour mesurer le potentiel de nanoparticules lipidiques Zeta.

Dans cette analyse, plusieurs lots de nanoparticules lipidiques avec la même formulation lipidique et le même rapport amine/phosphate ont été développés sur des jours distincts pour démontrer la reproductibilité de la technique. Comme on l’a observé, les lots un et deux présentaient des distributions de taille qui se chevauchaient avec une poly dispersion similaire, sans différence significative observée dans la taille ou l’efficacité d’encapsulation entre les lots. En règle générale, les changements dans les paramètres de formulation induisent des différences petites mais statistiquement significatives.

Par exemple, la diminution du rapport amine/phosphate entraîne une diminution de 4% de l’efficacité d’encapsulation, avec une augmentation concomitante du diamètre hydrodynamique des nanoparticules. Les nanoparticules lipidiques formulées avec différents lipides ionisables mais le même rapport amine/phosphate, présentent un changement significatif dans l’efficacité d’encapsulation ainsi que de légères différences dans le diamètre des particules. L’encapsulation de l’ADN plasmidique donne des particules plus grosses par rapport aux mRA encapsulant des nanoparticules lipidiques, bien que les deux types de nanoparticules démontrent une efficacité d’encapsulation similaire.

Cependant, les modifications apportées au paramètre du processus de débit n’ont pas d’impact sur le développement des nanoparticules lipidiques. Les nanoparticules lipidiques ont d’excellentes applications, l’exemple parfait étant les vaccins COVID-19 récemment approuvés. Cette technique constitue un excellent ensemble d’outils et ouvre la voie à de futures applications en permettant le dépistage de la formulation des membres inférieurs.