Name: Formulation et caractérisation de nanoparticules lipidiques pour la livraison de gènes à l’aide d’une plate-forme de mélange microfluidique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Apprenez à formuler des nanoparticules lipidiques encapsulant des acides nucléiques par microfluidique pour la livraison de gènes. Cette méthode rapide et reproductible permet de produire des particules uniformes avec une efficacité d'encapsulation élevée.

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Merci à Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger et Philip Zakas pour leurs conseils et leurs contributions au développement de LNP.

Un schéma de l’ensemble du processus est fourni à la figure 1.
1. Préparation des tampons
REMARQUE: Le filtrage stérile des tampons est fortement suggéré ici pour éliminer toutes les particules qui peuvent avoir un impact sur la qualité de l’acide nucléique et du LNP.
<ol><li>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)<ol>
<li>Préparer 1x PBS en utilisant 8 mM Na2HPO4,2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl et 2,7 mM KCl dans de l’eau sans nucléase et ajuster le pH à 7,4.</li>
		<li>Stériliser par filtration sous vide à l’aide d’un filtre de 0,22 μm de la taille d’un pore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tampon de citrate<ol>
<li>Préparer un tampon de citrate en utilisant 5 mM de citrate de sodium, 5 mM d’acide citrique et 150 mM de chlorure de sodium dans de l’eau sans nucléase et ajuster à un pH de 4,5.</li>
		<li>Stériliser par filtration sous vide à l’aide d’un filtre de 0,22 μm de la taille d’un pore. REMARQUE: Le tampon de citrate ne doit être préparé que si l’ARNm est l’acide nucléique qui sera encapsulé dans le LNP. Si l’ADN doit être encapsulé, sautez 1.2 et passez à 1.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tampon d’acide malique<ol>
<li>Préparer un tampon d’acide malique en utilisant 20 mM d’acide malique et 30 mM de chlorure de sodium dans de l’eau sans nucléase et ajuster à un pH de 3,0.</li>
		<li>Stériliser par filtration sous vide à l’aide d’un filtre de 0,22 μm de la taille d’un pore. REMARQUE: Le tampon d’acide malique ne doit être préparé que si l’ADN est l’acide nucléique qui sera encapsulé dans le LNP. Sautez 1,3 si l’ARNm doit être encapsulé. Le tampon de citrate est utilisé pour l’encapsulation de l’ARNm, car le pH inférieur de 3,0 avec le tampon d’acide malique peut entraîner une probabilité accrue de dégradation de l’ARNm. Le protocole peut être mis en pause ici.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Préparation du mélange lipidique
<ol><li>Si les lipides de base sont sous forme de poudre, solubiliser dans de l’éthanol pur à l’épreuve de 200.</li>
	<li>Calculez le mélange requis de composants lipidiques en fonction du rapport molaire souhaité. Un rapport molaire de 50:10:39:1 (lipide ionisable:lipide d’aide:cholestérol:PEG) sera utilisé ici comme exemple pour une concentration lipidique totale de 10 mM. Le tableau 1 montre les concentrations et les volumes nécessaires pour chacun de ces composants. REMARQUE: Lors du calcul du volume nécessaire pour atteindre la concentration du mélange lipidique dans l’éthanol (EtOH) pour le mélangeur microfluidique, le volume total est pris en compte pour s’assurer que l’ajout d’EtOH n’influence pas les concentrations lipidiques. Par exemple, un volume lipidique ionisable de 68,5 μL est calculé en multipliant la concentration de 5 mM dans l’éthanol par un volume total de mélange lipidique de 533 μL, puis en divisant par la concentration lipidique mère de 38,9 mM.</li>
	<li>Ajouter la quantité appropriée de chaque solution lipidique dans un flacon en verre pour permettre aux composants de se mélanger avec un vortex intermittent. Ajouter 200 éthanol d’épreuve pour un mélange total de 533 μL. Pour l’exemple du tableau 1,il s’agit de 254 μL d’éthanol. REMARQUE: Pour une seule série pour produire 1 mL de LLP, 342,5 μL de solution lipidique sont nécessaires. Cela est dû à un mélange 3:1 d’acide nucléique aqueux à une solution lipidique organique avec un certain volume jeté avant et après le prélèvement de l’échantillon. Un mélange de 533 μL est fait pour compenser l’utilisation excessive.</li>
</ol>3. Préparation de la solution d’acide nucléique
REMARQUE: La préparation et la manipulation des solutions d’acides nucléiques doivent être effectuées dans un environnement stérile et exempt de RNase dans la mesure du possible. Travaillez dans une armoire de biosécurité chaque fois que possible avec l’acide nucléique.
<ol><li>Calculer le rapport N/P. Le rapport N/P est le nombre total de groupes lipides amines ionisables (N) par rapport au nombre total de groupes phosphates d’acides nucléiques (P) chargés négativement. Le rapport N/P est souvent un paramètre qui peut être optimisé lors de la formation de LNP. Suivez les étapes ci-dessous.<ol>
<li>Calculez le nombre de N unités à l’aide de la formule ci-dessous : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62226/62226eq01.jpg"> REMARQUE: La concentration de lipides ionisables (Tableau 1) est de 5 mM, ce qui équivaut à 5 x 10-6 mol / mL. Le volume d’injection lipidique requis est de 0,3425 mL. Par exemple, si le nombre de N unités par molécule est de 1, en utilisant l’équation ci-dessus, il y a 1,03 x 1018 unités N dans le mélange lipidique.</li>
		<li>Calculez les unités P pour le rapport N/P souhaité. Ici, un N/P = 36 est utilisé par exemple. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62226/62226eq02.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calculer la concentration d’acide nucléique nécessaire pour obtenir 2,86 x 1016 unités P en utilisant l’équation ci-dessous. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62226/62226eq03.jpg"> Où, le nombre d’unités P par paire de bases pour l’ARNm est de 1 et l’ADN est de 2. Pour un ARNm de 1 200 bases, la quantité d’ARNm requise pour un N/P = 36 est de 3,96 x 10à 11 moles.</li>
	<li>Calculer la concentration massique d’ARNm requise pour N/P = 36 en utilisant l’équation ci-dessous. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62226/62226eq04.jpg"> Le poids moléculaire moyen d’une unité monophosphate de ribonucléotide est de 322 g/mol30. Avec un ARNm de 1 200 bases, le poids moléculaire de l’ARNm est de 386 400 g/mol. Le volume d’injection requis de solution d’acide nucléique est de 1,028 mL. Ainsi, la concentration d’ARNm nécessaire est de 1,488x10-5 g/mL, soit 14,88 μg/mL.</li>
	<li>Constituer 1,5 mL de 14,88 μg/mL d’ARNm dans un tampon de citrate. REMARQUE: Lorsque l’ADN sera l’acide nucléique encapsulé, utilisez un tampon d’acide malique pour constituer la solution d’acide nucléique.</li>
</ol>4. Amorçage des canaux microfluidiques
REMARQUE: Ce protocole est adapté des directives du fabricant de l’instrument.
<ol><li>Entrez les paramètres d’amorçage dans le logiciel de l’instrument en cliquant sur les champs appropriés (Tableau 2). REMARQUE: Un rapport de débit de 3: 1 et un débit de 4-12 mL / min est recommandé27,31 . Cela s’est avéré optimal dans les études présentées ici, ainsi que par le fabricant. Cela peut être varié s’il est intéressant pour l’application.</li>
	<li>Ouvrez le couvercle de l’instrument et placez une cartouche microfluidique dans le bloc rotatif.</li>
	<li>Aspirer au moins 0,5 mL d’éthanol dans une seringue de 1 mL, en s’assurant qu’il n’y a pas de bulles ou d’espaces d’air à l’extrémité de la seringue. Chargez cette seringue dans l’entrée droite de la cartouche.</li>
	<li>Remplissez une seringue de 3 mL avec 1,5 mL de tampon aqueux (citrate pour l’ARN et acide malique pour l’ADN), en vous assurant qu’il n’y a pas de bulles d’air ou de trous. Chargez cette seringue dans l’entrée gauche de la cartouche.</li>
	<li>Insérez deux tubes coniques de 15 mL dans les porte-clips pour servir de conteneurs à déchets.</li>
	<li>Cliquez sur Exécuter dans le logiciel de l’instrument pour commencer le mixage, en vous assurant que les paramètres sont entrés correctement.</li>
	<li>Lorsque l’instrument cesse de s’amorcer, comme l’indique la lumière bleue inférieure qui s’éteint, ouvrez le couvercle et jetez correctement les tubes coniques et les seringues.</li>
</ol>5. Formation de LNP
REMARQUE: Ce protocole est adapté des directives du fabricant de l’instrument.
<ol><li>Mettez à jour le logiciel avec les paramètres de formulation en cliquant sur les champs appropriés (Tableau 2).</li>
	<li>Remplissez une seringue de 1 mL avec le mélange lipidique (préparé à l’étape 2). Retirez les trous d’air ou les bulles à l’extrémité de la seringue et insérez la seringue dans le côté droit de la cartouche.</li>
	<li>Aspirer la solution d’acide nucléique (préparée à l’étape 3) dans une seringue de 3 mL, en s’assurant qu’il n’y a pas de bulles ou d’espaces d’air dans l’embout de la seringue. Insérez la seringue dans l’entrée gauche de la cartouche. REMARQUE: Des volumes sont fournis pour faire une solution de 1 mL de LLP. Cet instrument peut incorporer des tailles de seringues allant jusqu’à 10 mL, et les volumes peuvent être mis à l’échelle en conséquence sans influence sur le résultat. Le volume maximal de LLP pouvant être préparés en une seule préparation est de 12 mL.</li>
	<li>Étiquetez un tube conique sans RNase de 15 mL avec le nom de l’échantillon et insérez-le dans le clip du tube gauche. Placez un déchet conique de 15 mL dans le clip de tube droit.</li>
	<li>Fermez le couvercle de l’instrument et cliquez sur Exécuter, après avoir confirmé la saisie correcte des paramètres.</li>
	<li>Une fois l’instrument fini de fonctionner, jetez correctement le conteneur à déchets et la cartouche. Conservez le tube conique avec l’échantillon LNP.</li>
	<li>Diluer le LNP 5x avec du PBS pour minimiser l’éthanol à &lt;5% (v / v). REMARQUE: Il est important de diluer les LLP dans le PBS dès que possible après le mélange microfluidique pour éviter la dégradation. Effectuez toujours la dilution dans une armoire de biosécurité et continuez à travailler dans l’armoire de biosécurité tout au long des échanges de tampons.</li>
</ol>6. Échange de tampon
REMARQUE: Le protocole d’utilisation des filtres ultra-centrifuges est fourni. Bien que cette méthode se traduise par un échange plus rapide de tampons, la dialyse peut être substituée ici.
<ol><li>Prélavez un filtre ultra-centrifuge (taille de pore de 100 kDa) avec 2 mL de PBS par centrifugation à 1000 x g pendant 5 min. Videz le PBS du compartiment inférieur. REMARQUE: PBS est choisi pour augmenter le pH à 7,4 ± 0,2, ce qui est physiologiquement pertinent et entraînera une charge neutre du lipide ionisable.</li>
	<li>Ajouter les LLP dilués dans le compartiment supérieur du filtre ultra-centrifuge prélavé et centrifuger à 1000 x g pendant 12 min.</li>
	<li>Jetez le flux à travers le compartiment inférieur. Effectuez deux lavages supplémentaires en ajoutant 5 mL de PBS au filtre ultra-centrifuge à chaque fois. Centrifuger aux mêmes paramètres. Il n’y a pas de volume maximum à maintenir. REMARQUE : Si un volume de LLP à grande échelle a été préparé, augmentez le volume de PBS pour chaque lavage en conséquence. Par exemple, si 2 mL de LLP ont été préparés en une seule fois, alors 10 mL de PBS par lavage sont suggérés.</li>
	<li>Pipettez la solution LNP contre les parois du filtre ultra-centrifuge plusieurs fois pour minimiser la perte de LNP. Retirer la solution LNP du filtre ultracentrifique et la conserver dans un flacon sans nucléase. Ajouter PBS si nécessaire pour obtenir un volume final de la solution LNP de 1 mL.</li>
	<li>Filtrer à travers un filtre à seringue pré-humide de 0,2 μm, si nécessaire. REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.</li>
</ol>7. Mesurer l’efficacité de l’encapsulation
<ol><li>Préparer une courbe standard en effectuant des dilutions en série 2 fois de la solution d’acide nucléique de travail dans le PBS, en commençant par une concentration maximale de 500 ng / mL et en effectuant au moins cinq dilutions. Utilisez PBS comme vide.</li>
	<li>Préparer les dilutions de l’échantillon LNP. Diluer les échantillons de LNP avec du PBS, pour obtenir une concentration théorique approximative qui se situe autour du point médian de la courbe standard (par exemple, ~ 250 ng / mL d’acide nucléique estimé à partir de la concentration initiale).</li>
	<li>Préparer une solution du réactif de quantification de l’ARN (pour les mesures d’ARNm) avec TritonX-100 pour perturber les LNP et mesurer la quantité totale d’acide nucléique à l’intérieur et à l’extérieur du LNP. Cette solution contient 0,5 % (v/v) de réactif d’ARN, 0,4 % (v/v) de TritonX-100 et 99,1 % (v/v) de PBS.</li>
	<li>Préparer une solution du réactif sans TritonX-100 pour mesurer la quantité d’acide nucléique non encapsulée dans les LLP. Cette solution contient 0,5 % (v/v) de réactif d’ARN et 99,5 % (v/v) de PBS. REMARQUE: Si les LNP encapsulent de l’ADN double brin (dsDNA), tel que l’ADN plasmidique, utilisez plutôt le réactif dsDNA dans 7.3 et 7.4, en suivant la même procédure.</li>
	<li>Dans une plaque de fluorescence noire de 96 puits, chargez au moins quatre répliques de chacune des solutions étalons LNP et acide nucléique préparées aux points 7.1 et 7.2.</li>
	<li>À la moitié des répétitions d’étalons et d’échantillons, ajoutez un volume égal du réactif contenant TritonX-100. Cela permettra de quantifier la quantité totale d’acide nucléique.</li>
	<li>Aux puits restants d’étalons et d’échantillons, ajoutez un volume égal de réactif sans TritonX-100. Cela permettra de quantifier la quantité d’acide nucléique non encapsulée à l’intérieur du LNP.</li>
	<li>Agiter la plaque pendant 5 min à température ambiante pour assurer un mélange minutieux des étalons et des échantillons avec le réactif ajouté, en prenant des précautions pour éviter l’exposition à la lumière.</li>
	<li>Mesurez la fluorescence à l’aide d’un lecteur de microplaques, avec une longueur d’onde d’excitation de 480 nm et une longueur d’onde d’émission de 520 nm.</li>
	<li>Calculer la concentration d’acide nucléique en dehors du LNP en utilisant la courbe standard réalisée avec l’ajout du réactif sans TritonX-100. Multiplier par le facteur de dilution utilisé au 7.2.</li>
	<li>Calculer la concentration d’acide nucléique à l’intérieur et à l’extérieur du LNP en utilisant la courbe standard réalisée avec l’ajout du réactif contenant TritonX-100. Multiplier par le facteur de dilution utilisé au 7.2.</li>
	<li>Calculer la concentration d’acide nucléique à l’intérieur en soustrayant la concentration d’acide nucléique à l’extérieur (calculée à partir de l’étape 7.10) de la concentration totale d’acide nucléique à l’intérieur et à l’extérieur (calculée à partir de l’étape 7.11)</li>
	<li>Quantifier l’efficacité d’encapsulation à partir du rapport entre la concentration d’acide nucléique à l’intérieur du PNL (calculée à partir de l’étape 7.12) et la concentration totale d’acide nucléique (calculée à partir de l’étape 7.11). REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.</li>
</ol>8. Ajustements de concentration
<ol><li>Si nécessaire, ajustez la concentration d’acide nucléique dans la solution LNP en utilisant les résultats de l’efficacité d’encapsulation.</li>
	<li>Si une solution moins concentrée est souhaitée, diluer la solution avec du PBS pour obtenir la concentration souhaitée.</li>
	<li>Si une solution plus concentrée est souhaitée, effectuez des essais de centrifugation supplémentaires à l’aide d’un filtre ultra-centrifuge. REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.</li>
</ol>9. Mesurer la taille hydrodynamique et la polydispersité du LNP
<ol><li>Diluer une aliquote de la solution LNP 40x avec du PBS pour obtenir un volume final de 1 mL. REMARQUE: Cette dilution peut être modifiée si nécessaire. Cette valeur de dilution est suggérée car elle utilise un petit volume de la solution de stock LNP tout en fournissant des résultats de qualité.</li>
	<li>À l’aide d’une cuvette semi-micro, mesurez le diamètre hydrodynamique et l’indice de polydispersité. Ajouter la solution LNP dans la cuvette et insérer dans l’instrument. Configurez une procédure d’exploitation dans le logiciel de l’instrument pour inclure le type de mesure, les détails de l’échantillon (matériau, dispersant, température et type de cellule) et les instructions de mesure (nombre de séries). Cliquez sur Démarrer lorsque vous êtes prêt à commencer l’acquisition de mesure.</li>
</ol>10. Mesurer le potentiel zêta LNP
<ol><li>Diluer une aliquote de la solution LNP 40x avec de l’eau sans nucléase pour obtenir un volume final de 1 mL. REMARQUE: L’eau sans nucléase est utilisée comme solvant pour les mesures du potentiel zêta afin de minimiser l’influence des tampons salins élevés sur la conductivité.</li>
	<li>À l’aide d’une cellule zêta capillaire repliée, mesurez le potentiel zêta.<ol>
<li>Ajouter la solution LNP dans la cuvette jusqu’à la ligne de remplissage. Insérez dans l’instrument en vous assurant que les électrodes entrent en contact avec l’instrument.</li>
		<li>Configurez une procédure d’exploitation dans le logiciel de l’instrument pour inclure le type de mesure, les détails de l’échantillon (matériau, dispersant, température et type de cellule) et les instructions de mesure (nombre de séries). Cliquez sur Démarrer lorsque vous êtes prêt à commencer l’acquisition de mesure.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Tous les auteurs sont des employés de Sanofi. Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflit d’intérêts ou d’intérêts financiers concurrents.

La reproductibilité, la rapidité et le criblage à faible volume sont des avantages importants de l’utilisation du mélange microfluidique pour former des LLP par rapport à d’autres méthodes existantes (par exemple, l’hydratation du film lipidique et l’injection d’éthanol). Nous avons démontré la reproductibilité de cette méthode sans impact sur l’efficacité d’encapsulation ou la taille des particules observée avec différents lots LNP. Il s’agit d’un critère essentiel pour que tout traitement, y compris les LLP, devienne c...

Les transporteurs de médicaments sont utilisés pour protéger et délivrer un traitement aux propriétés favorables typiques, notamment une faible cytotoxicité, une biodisponibilité accrue et une stabilité améliorée1,2,3. Les nanoparticules polymères, les micelles et les particules à base de lipides ont déjà été explorées pour l’encapsulation et la livraison d’acides nucléiques4,5,6,7. Les lipides ont été utilisés dans différents types de systèmes de nanotransporteurs, y compris les liposomes, et les nanoparticules lipidiques, car ils sont biocompatibles avec une grande stabilité8. Les LNPs peuvent facilement encapsuler les acides nucléiques pour l’administration de gènes9,10. Ils protègent l’acide nucléique de la dégradation par les protéases sériques au cours de la circulation systémique11 et peuvent améliorer l’administration à des sites spécifiques, car la topographie de surface et les propriétés physiques des LNP influencent leur biodistribution12. Les LLP améliorent également la pénétration tissulaire et l’absorption cellulaire9. Des études antérieures ont démontré le succès de l’encapsulation du siRNA dans un LNP13, y compris le premier LNP disponible dans le commerce contenant du siRNA thérapeutique pour le traitement de la polyneuropathie du traitement héréditaire de l’amylose héréditaire médiée par la transthyrétine14 qui a été approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis et l’Agence européenne des médicaments en 2018. Plus récemment, les LNP sont à l’étude pour l’administration de fractions d’acides nucléiques plus importantes, à savoir l’ARNm et l’ADN9. En 2018, il y avait ~ 22 systèmes d’administration d’acides nucléiques à base de lipides en cours d’essais cliniques14. De plus, les ARNm contenant des LLP sont actuellement les principaux candidats et ont été utilisés pour un vaccin contre laCOVID-19 15,16. Le succès potentiel de ces thérapies géniques non virales nécessite la formation de petites particules (~ 100 nm), stables et uniformes avec une encapsulation élevée de l’acide nucléique.
L’utilisation d’un lipide ionisable comme composant principal dans la formulation LNP a montré des avantages pour la complexation, l’encapsulation et l’efficacité de l’administration14. Les lipides ionisables ont généralement une constante de dissociation acide (pKa) < 7; par exemple, le dilinoleylméthyl-4-diméthylaminobutyrate (D-Lin-MC3-DMA), le lipide ionisable utilisé dans la formulation LNP approuvée par la FDA, a un pKa de 6,4417. À faible pH, les groupes amines sur le lipide ionisable deviennent protonés et chargés positivement, ce qui permet l’assemblage avec des groupes phosphate chargés négativement sur l’ARNm et l’ADN. Le rapport des groupes amine, « N », aux groupes phosphate, « P », est utilisé pour optimiser l’assemblage. Le rapport N/P dépend des lipides et des acides nucléiques utilisés, qui varie en fonction de la formulation18. Après la formation, le pH peut être ajusté à un pH neutre ou physiologique pour permettre l’administration thérapeutique. À ces valeurs de pH, le lipide ionisable est également déprotoné, ce qui confère une charge de surface neutre au LNP.
Le lipide ionisable aide également à l’évasion endosomale19,20. Les LNP subissent une endocytose pendant l’absorption cellulaire et doivent être libérés de l’endosome afin de délivrer la cargaison d’ARNm dans le cytoplasme cellulaire ou la cargaison d’ADN au noyau21. À l’intérieur de l’endosome se trouve généralement un environnement plus acide que le milieu extracellulaire, ce qui rend le lipide ionisable chargé positivement22,23. Le lipide ionisable chargé positivement peut interagir avec des charges négatives sur la membrane lipidique endosomale, ce qui peut provoquer une déstabilisation de l’endosome permettant la libération du LNP et de l’acide nucléique. Différents lipides ionisables sont actuellement à l’étude pour améliorer l’efficacité de la distribution de la LNP, ainsi que de l’échappement endosomale14.
D’autres composants typiques d’un LNP comprennent les lipides d’aide, tels qu’un lipide de phosphatidylcholine (PC) ou de phosphoéthanolamine (PE). La 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine (DOPE), la 1,2-distéaroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) et la 1,2-dioléoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) sont des lipides d’aide couramment utilisés24,25. Il a été démontré que le DOPE forme une phase HEXAGONALE II inversée (HII) et améliore la transfection par fusion membranaire26,tandis que le DSPC a été pensé pour stabiliser les LNP avec sa géométrie cylindrique27. Le cholestérol est également incorporé dans la formulation afin d’augmenter la rigidité de la membrane, aidant ainsi à la stabilité du LNP. Enfin, le polyéthylène glycol conjugué aux lipides (PEG) est inclus dans la formulation pour fournir la barrière stérique nécessaire pour aider à l’auto-assemblage des particules27. Peg améliore également la stabilité de stockage des LNPs en empêchant l’agrégation. De plus, le PEG est souvent utilisé comme composant furtif et peut augmenter le temps de circulation des LLP. Cependant, cet attribut peut également poser des défis pour le recrutement des LNP en hépatocytes par le biais d’un mécanisme de ciblage endogène piloté par l’apolipoprotéine E (ApoE)28. Ainsi, des études ont étudié la longueur de la chaîne acyle pour la diffusion du PEG à partir du LNP, constatant que les longueurs courtes (C8-14) se dissocient du LNP et se prêtent mieux au recrutement d’ApoE par rapport aux longueurs d’acyle plus longues28. De plus, il a été démontré que le degré de saturation de la queue lipidique à laquelle le PEG est conjugué influence la distribution tissulaire des LLP29. Récemment, Tween 20, qui est un tensioactif couramment utilisé dans les formulations de produits pharmaceutiques biologiques et a une longue queue lipidique insaturée, s’est avéré avoir une transfection élevée dans les ganglions lymphatiques drainants par rapport au PEG-DSPE, qui transfectait en grande partie le muscle au site d’injection29. Ce paramètre peut être optimisé pour obtenir la biodistribution LNP souhaitée.
Les méthodes conventionnelles de formation de LNPs comprennent la méthode d’hydratation en couche mince et la méthode d’injectiond’éthanol 27. Bien qu’il s’agit de techniques facilement disponibles, elles exigent également beaucoup de main-d’œuvre, peuvent entraîner une faible efficacité d’encapsulation et sont difficiles à mettre à l’échelle27. Les progrès dans les techniques de mélange ont abouti à des méthodes plus faciles à mettre à l’échelle, tout en développant des particules plus uniformes27. Ces méthodes comprennent le mélange de jonction en T, le mélange à chevrons décalé et la focalisation hydrodynamique microfluidique27. Chaque méthode a une structure unique, mais toutes permettent de mélanger rapidement une phase aqueuse contenant l’acide nucléique avec une phase organique contenant les composants lipidiques, ce qui entraîne une encapsulation élevée de l’acide nucléique27. Dans ce protocole, un mélange rapide et contrôlé à travers une cartouche microfluidique est utilisé, qui utilise la conception de mélange à chevrons décalé. Ce protocole décrit la préparation, l’assemblage et la caractérisation des acides nucléiques contenant des LLP.

<table><tbody><tr><td>1,2-dimyristoyl-rac-glycéro-3-méthoxypolyéthylène glycol-2000 (C-14 PEG)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880151P</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro ; l Embouts de filtre gradués&nbsp ; (sans RNase, sans DNase, sans ADN)</td><td>États-Unis scientifiques</td><td>1121-3810</td><td></td></tr><tr><td>1000 et micro ; l Embouts filtrants gradués (sans RNase, DNase, ADN)</td><td>USA Scientific</td><td>1111-2831</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro ; l Embouts filtrants biseautés (sans RNase-, DNase-, ADN)</td><td>USA Scientific</td><td>1120-1810</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro ; l Embouts filtrants granulés (sans RNase-,DNase-, sans ADN)</td><td>USA Scientific</td><td>1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>3&beta ;-Hydroxy-5-cholestre, 5-cholesten-3&beta ;-ol (cholestérol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>BD Seringues stériles à embout coulissant (seringue de 1 ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>Seringues stériles à embout coulissant BD (seringue de 3 ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-823-436</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Aiguilles pour seringue à usage général (BD Blunt Fill Needle 18G)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23-021-020</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de paillasse</td><td>Beckman Soc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Noir 96 plaques</td><td>de puits Thermo Fisher Scientific</td><td>14-245-177</td><td></td></tr><tr><td>BrandTech MARQUE BIO-CERT Tubes à microcentrifuger sans RNase, DNase, ADN (1,5 ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-380-813</td><td></td></tr><tr><td>Acide citrique</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-002-611</td><td></td></tr><tr><td>Corning Système de filtre/bouteille de stockage sous vide de 500 ml, pores de 0,22 μm</td><td>Corning</td><td>430769</td><td></td></tr><tr><td>Cellules capillaires pliées jetables</td><td>Malvern</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td>Alcool éthylique, Pur 200 proof</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Marque Semi-Micro Cuvette</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14955127</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques Invitrogen (15 ml) (sans DNase-RNase)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12500</td><td></td></tr><tr><td>MilliporeUnités de filtration ultracentrifuges Sigma Amicon</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>NanoAssemblr</td><td>Nanyosystems</td><td></td><td></td>de précision de paillasse</tr><tr><td>Eau sans nucléases</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9930</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen kit de dosage de l’ADNdb</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp ; P7589</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT RiboGreen Kit de dosage de l’ARN</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R11490</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-004-036</td><td></td></tr><tr><td>Citrate de sodium, dihydraté, granulaire</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-004-056</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax i3x</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

formulation et caractérisation de nanoparticules lipidiques pour la livraison de gènes à l’aide d’une plate-forme de mélange microfluidique

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Les transporteurs de médicaments à base de lipides ont été utilisés pour les systèmes d’administration cliniquement et commercialement disponibles en raison de leur petite taille, de leur biocompatibilité et de leur grande efficacité d’encapsulation. L’utilisation de nanoparticules lipidiques (LNPs) pour encapsuler les acides nucléiques est avantageuse pour protéger l’ARN ou l’ADN de la dégradation, tout en favorisant l’absorption cellulaire. Les LLP contiennent souvent plusieurs composants lipidiques, y compris un lipide ionisable, un lipide d’aide, du cholestérol et un lipide conjugué en polyéthylène glycol (PEG). Les LNPs peuvent facilement encapsuler les acides nucléiques en raison de la présence de lipides ionisables, qui, à faible pH, est cationique et permet une complexation avec de l’ARN ou de l’ADN chargé négativement. Ici, les LNPs sont formés en encapsulant l’ARN messager (ARNm) ou l’ADN plasmidique (ADNp) en mélangeant rapidement les composants lipidiques dans une phase organique et le composant acide nucléique dans une phase aqueuse. Ce mélange est effectué à l’aide d’une plate-forme de mélange microfluidique précise, permettant l’auto-assemblage des nanoparticules tout en maintenant le flux laminaire. La taille hydrodynamique et la polydispersité sont mesurées à l’aide de la diffusion dynamique de la lumière (DLS). La charge de surface effective sur le LNP est déterminée en mesurant le potentiel zêta. L’efficacité d’encapsulation est caractérisée à l’aide d’un colorant fluorescent pour quantifier l’acide nucléique piégé. Des résultats représentatifs démontrent la reproductibilité de cette méthode et l’influence des différents paramètres de formulation et de procédé sur les LNP développés.

Plusieurs lots de LNP avec la même formulation lipidique et le même rapport N/P de 6 ont été développés sur des jours distincts pour démontrer la reproductibilité de la technique. Les lots 1 et 2 ont entraîné des distributions de taille qui se chevauchent avec une polydispersité similaire (Figure 2A) Aucune différence significative n’a été observée dans la taille ou l’efficacité d’encapsulation entre les deux lots différents (Figure 2B</s...

Les nanoparticules lipidiques sont développées à l’aide d’une approche de plate-forme de mélange microfluidique pour l’encapsulation de l’ARNm et de l’ADN.

Formulation et caractérisation de nanoparticules lipidiques pour la livraison de gènes à l’aide d’une plate-forme de mélange microfluidique

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

Ce protocole peut être utilisé pour produire des nanoparticules lipidiques encapsulées d’acide nucléique avec une reproductibilité et une vitesse élevées et de faibles volumes. Les paramètres de formulation peuvent être réglés pour obtenir une distribution biologique souhaitée en fonction de l’application clinique. La conception standard à chevrons de la cartouche microfluidique permet un écoulement laminaire rapide, précis et contrôlé pendant le mélange.La méthode se prête à la mise à l’échelle et génère des particules uniformes et hautement encapsulées. La plupart des produits de thérapie génique approuvés commercialement s’appuyant sur des méthodes virales, cette procédure peut fournir un aperçu de l’administration de gènes, car son approche non virale permet des applications pour lesquelles une administration répétée est nécessaire. Commencez par ajouter la quantité appropriée de chaque solution liquide sous forme de liquide dans un flacon en verre avec vortex intermittent.comme indiqué dans le tableau, suivi de l’ajout de 200 éthanol d’épreuve à un volume final de 533 microlitres. Ajoutez ensuite la quantité appropriée de stock d’ARNm et diluez avec un tampon de citrate pour obtenir un volume final de 1,5 millilitre à la concentration souhaitée. Pour amorcer les canaux microfluidiques, entrez d’abord le paramètre d’amorçage dans le logiciel de l’instrument comme indiqué dans le tableau.Ensuite, ouvrez le couvercle de l’instrument et placez une cartouche microfluidique dans le bloc rotatif. Chargez au moins 500 microlitres d’éthanol dans une seringue de 1 millilitre, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles ou d’espaces d’air à l’extrémité de la seringue et insérez la seringue dans l’entrée droite de la cartouche. Chargez une seringue de cinq millilitres avec 1,5 millilitre de tampon de citrate, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles d’air ou d’espaces, et insérez la seringue dans l’entrée gauche de la cartouche.Placez deux tubes coniques de 15 millilitres dans les porte-clips pour servir de conteneurs à déchets et cliquez sur Go » pour mélanger les solutions. Lorsque l’instrument cesse de s’amorcer comme l’indique la lumière bleue inférieure qui s’éteint, ouvrez le tard et jetez correctement les tubes coniques et les seringues. Pour la formation de nanoparticules lipidiques, définissez les paramètres de formulation appropriés comme indiqué dans le tableau et chargez une seringue de 1 millilitre avec un mélange lipidique préalablement préparé.Retirez les trous d’air ou les bulles dans l’embout de la seringue et insérez la seringue dans le côté droit de la cartouche. Chargez la solution d’acide nucléique préalablement préparée dans une seringue de 3 millilitres, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles ou d’espaces d’air dans l’embout de la seringue, et insérez la seringue dans l’entrée gauche de la cartouche. Placez un tube conique sans ARN de 15 millilitres étiqueté avec le nom de l’échantillon dans le clip du tube gauche et placez un conique de déchets de 15 millilitres dans le clip du tube droit.Fermez le couvercle de l’instrument et cliquez sur Go.Les solutions de lipides et d’ARNm circuleront à travers la cartouche microfluidique et la solution de nanoparticules lipidiques sera collectée dans les tubes coniques. Conservez le tube conique à la fin du processus de formulation, puis diluez les nanoparticules lipidiques avec 5 millilitres de PBS et une armoire de sécurité biologique. Pour effectuer un échange tampon, prélavez d’abord un filtre ultracentrifuge de 100 kilodaltons de la taille d’un pore avec 2 millilitres de PBS, centrifugez, puis videz le PBS du compartiment inférieur.Ajouter les nanoparticules lipidiques diluées dans le compartiment supérieur du filtre ultracentrifuge prélavé pour trois lavages à la centrifugeuse, en éliminant le flux et en ajoutant 5 millilitres de PBS au filtre ultracentrifugeur après les deux premiers lavages. Après le dernier lavage, pipettez la solution de nanoparticules lipidiques contre les parois du filtre ultracentrifuge plusieurs fois pour minimiser la perte de nanoparticules avant de transférer la solution de nanoparticules dans un flacon sans nucléase. Ajoutez ensuite du PBS pour amener la suspension de nanoparticules à la concentration expérimentale et au volume appropriés si nécessaire.Pour évaluer l’efficacité d’encapsulation des nanoparticules lipidiques, préparez d’abord deux dilutions en série de solution d’acide nucléique de travail dans PBS pour générer une courbe standard, à partir de 500 nanogrammes par millilitre et en effectuant au moins cinq dilutions. Ensuite, préparez les dilutions de l’échantillon de nanoparticules dans le PBS pour obtenir une concentration théorique appropriée qui se situe autour du point médian de la courbe standard. Ensuite, préparez le réactif d’ARN vert ribo pour détecter la présence d’ARN à l’intérieur et à l’extérieur de la nanoparticule lipidique en mélangeant les quantités appropriées de réactif d’ARN, Triton X100 et PBS.Ensuite, pour détecter la présence d’ARN à l’extérieur de la nanoparticule liquide, mélangez les quantités appropriées de réactifs d’ARN et de PBS uniquement. Les réplications de charge de l’étalon d’acide nucléique et des solutions de nanoparticules lipidiques dans une plaque noire de 96 puits capable de fluorescence, puis ajoutent un volume égal de réactif de quantification de l’ARN avec et sans Triton X100 à l’étalon et l’échantillon se réplique. Agiter la plaque dans le lecteur de plaques pendant cinq minutes à température ambiante à l’abri de la lumière pour obtenir un mélange complet des échantillons, puis mesurer la fluorescence sur un lecteur de microplaques à une longueur d’onde d’excitation de 480 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 520 nanomètres.Pour mesurer la taille hydrodynamique et la polydispersité des nanoparticules lipidiques, diluez d’abord la solution de nanoparticules 40 fois dans du PBS et ajoutez la solution à une semi micro cuvette. Chargez la cuvette sur le Zetasizer et choisissez une procédure d’utilisation standard pour régler l’instrument afin de mesurer les nanoparticules en fonction de leur matériau, de leur dispersant, de leur température et de leur type de cellule. Cliquez ensuite sur Démarrer pour mesurer la taille hydrodynamique et la polydispersité des nanoparticules lipidiques.Pour mesurer le potentiel zêta des nanoparticules lipidiques, diluer la solution de nanoparticules 40 fois dans de l’eau sans nucléase et charger la solution dans une cuvette jusqu’à la ligne de remplissage. Chargez la cuvette dans un analyseur de potentiel Zeta, en faisant attention à ce que les électrodes entrent en contact avec l’instrument, et réglez l’instrument pour mesurer le potentiel Zeta en fonction de la composition spécifique des nanoparticules lipidiques. Cliquez ensuite sur Démarrer pour mesurer le potentiel de nanoparticules lipidiques Zeta.Dans cette analyse, plusieurs lots de nanoparticules lipidiques avec la même formulation lipidique et le même rapport amine/phosphate ont été développés sur des jours distincts pour démontrer la reproductibilité de la technique. Comme on l’a observé, les lots un et deux présentaient des distributions de taille qui se chevauchaient avec une poly dispersion similaire, sans différence significative observée dans la taille ou l’efficacité d’encapsulation entre les lots. En règle générale, les changements dans les paramètres de formulation induisent des différences petites mais statistiquement significatives.Par exemple, la diminution du rapport amine/phosphate entraîne une diminution de 4% de l’efficacité d’encapsulation, avec une augmentation concomitante du diamètre hydrodynamique des nanoparticules. Les nanoparticules lipidiques formulées avec différents lipides ionisables mais le même rapport amine/phosphate, présentent un changement significatif dans l’efficacité d’encapsulation ainsi que de légères différences dans le diamètre des particules. L’encapsulation de l’ADN plasmidique donne des particules plus grosses par rapport aux mRA encapsulant des nanoparticules lipidiques, bien que les deux types de nanoparticules démontrent une efficacité d’encapsulation similaire.Cependant, les modifications apportées au paramètre du processus de débit n’ont pas d’impact sur le développement des nanoparticules lipidiques. Les nanoparticules lipidiques ont d’excellentes applications, l’exemple parfait étant les vaccins COVID-19 récemment approuvés. Cette technique constitue un excellent ensemble d’outils et ouvre la voie à de futures applications en permettant le dépistage de la formulation des membres inférieurs.

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Ici nous décrivons un protocole pour la génération de nanoliposomes cationiques, qui repose sur la méthode sèche-film et peut être utilisé pour la sécurité et la prestation efficace de in vitro transcrit l’ARN messager.

Génération de Nanoliposomes cationiques pour la prestation efficace de In Vitro transcrit l’ARN messager

Le protocole présente les paramètres optimisés pour la préparation des liposomes thermosensibles à l’aide du dispositif microfluidique micromélangeur d’os de hareng décalé. Cela permet également la co-encapsulation de la doxorubicine et de l’indocyanine vert dans les liposomes et la libération photothermique déclenchée de doxorubicine pour la libération contrôlée / déclenchée de médicaments.

Production microfluidique de liposomes sensibles à la température contenant des lysolipides

Les méthodes de production de nanoparticules lipidiques (LNP) à base de microfluidique ont attiré l’attention dans les systèmes d’administration de médicaments (DDS), y compris l’administration d’ARN. Ce protocole décrit les processus de fabrication, de production de LNP (LNP chargé de siRNA) et d’évaluation LNP à l’aide de notre dispositif microfluidique original nommé iLiNP.

Production de nanoparticules lipidiques chargées de siRNA à l’aide d’un dispositif microfluidique

Ici, un protocole de formulation de nanoparticules lipidiques (LNP) qui encapsulent l’ARNm codant pour la luciférase lucifly est présenté. Ces LNP ont été testés pour leur puissance in vitro dans des cellules HepG2 et in vivo chez des souris C57BL/6.

Tester l’efficacité in vitro et in vivo de nanoparticules d’ARNm-lipides formulées par mélange microfluidique

Un protocole détaillé pour la synthèse de nanoparticules lipidiques (LNP) à l’aide de technologies de mélangeur à jet d’impact confiné (CIJ), y compris un CIJ à deux jets et un mélangeur vortex multi-entrées à quatre jets (μMIVM), est présenté. Les mélangeurs CIJ génèrent des environnements de micro-mélange reproductibles et turbulents, ce qui permet de produire des LNP monodispersés.

Synthèse de nanoparticules lipidiques par écoulement turbulent dans des mélangeurs à jet d’impact confinés

Type B à base de gélatine système machiné nanovecteurs (SREG) a été développé pour la livraison de gènes systémiques et la transfection dans le traitement du cancer du pancréas. Par modification des récepteurs du facteur de croissance épidermique (EGFR) peptide spécifique sur la surface de nanparticles, ils pourraient cibler le récepteur EGFR et la libération plasmide sous réduisant l'environnement, tels que de fortes concentrations de glutathion intracellulaire.

Livraison de gènes et transfection de cellules humaines de cancer du pancréas en utilisant facteur de croissance épidermique ciblant les récepteurs des base de gélatine nanovecteurs Conçu

Nous présentons une approche microfluidique pour l'expression de puces à protéines. Le dispositif se compose de milliers de chambres de réaction contrôlées par des micro-mécaniques vannes. Le dispositif microfluidique est couplé à une bibliothèque de gènes microréseau imprimé. Ces gènes sont ensuite transcrits et traduits sur puce, résultant en un réseau de protéines prêt à l'emploi expérimental.

À haut débit Générateur expression des protéines utilisant une plate-forme microfluidique

Un protocole d'analyse de suivi de nanoparticules (NTA) et cytométrie de flux à haut débit afin d'évaluer polymères nanoparticules de transfert de gènes est décrite. NTA est utilisé pour caractériser la distribution des tailles de particules des nanoparticules et la distribution de particules de plasmide par. Cytométrie en flux à haut débit permet l'évaluation quantitative efficacité de transfection pour une bibliothèque de biomatériaux de transfert de gènes.

Évaluation de livraison Gene polymère nanoparticules d&#39;analyse de suivi par des nanoparticules et de cytométrie en flux à haut débit

Déformation mécanique rapide des cellules a émergé comme une méthode prometteuse, indemne de vecteurs pour la délivrance intracellulaire de macromolécules et des nanomatériaux. Ce protocole fournit des instructions détaillées sur la façon d'utiliser le système pour une large gamme d'applications.

Presser cellule comme, microfluidique Delivery Platform intracellulaire robuste

Jet microfluidique contre une bicouche lipidique de l'interface des gouttelettes fournit un moyen fiable pour générer des vésicules avec le contrôle de l'asymétrie de la membrane, l'incorporation de protéines transmembranaires, et l'encapsulation des matériaux. Cette technique peut être appliquée pour étudier une variété de systèmes biologiques où les biomolécules compartimentés sont souhaitées.

Bicouche lipidique des vésicules génération utilisant microfluidique jets

Apprenez à formuler des nanoparticules lipidiques encapsulant des acides nucléiques par microfluidique pour la livraison de gènes. Cette méthode rapide et reproductible permet de produire des particules uniformes avec une efficacité d'encapsulation élevée.

Formulation et caractérisation de nanoparticules lipidiques pour la livraison de gènes à l’aide d’une plate-forme de mélange microfluidique (Vidéo) | JoVE Journal

Formulation et caractérisation de nanoparticules lipidiques pour la livraison de gènes à l’aide d’une plate-forme de mélange microfluidique

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