Protocole pour tridimensionnelle confocale Analyse morphométrique des astrocytes

L’objectif général de cette procédure est d’évaluer la morphologie des astrocytes en analysant des images tridimensionnelles d’astrocytes acquises par microscopie confocale. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer les changements morphologiques qui peuvent apparaître dans différents types de cellules, soit dans des conditions pathologiques, soit à l’effet d’une stratégie d’intervention. Le principal avantage de cette technique est que de nombreux paramètres associés à l’architecture cellulaire peuvent être étudiés simultanément.

Le Dr Mariam Bodel fera la démonstration de cette procédure Suite à la préparation de lames pour la coloration immunohistochimique de coupes de parize en les immergeant deux fois dans du xylène pendant 10 minutes. Incuber les lames pendant 10 minutes dans chacune des bouteilles d’éthanol à 99,8 %, 95 % et 70 % pour réhydrater les sections après le lavage. PBS incube les lames dans une dilution de une à 1500 de protéine acide fibrillaire gliale ou de solution d’anticorps primaires GFAP à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Après l’incubation, laver les sections en PB S3 plusieurs fois pendant cinq minutes. Ensuite, incubez les lames avec une solution d’anticorps secondaires conjugués à la phosphatase alcaline pendant une heure à température ambiante. Encore une fois, lavez la section en PB S3 plusieurs fois pendant cinq minutes, moins de 30 minutes avant l’utilisation.

Ajoutez une goutte de solution de chromogène rouge à trois millilitres de tampon de substrat. Incuber chaque lame dans 100 microlitres de cette solution pendant 15 à 20 minutes dans l’obscurité. Lavez ensuite les lames en PB S3 fois pendant cinq minutes.

Enfin, colorez les noyaux avec du DPI dilué de un à 500 dans du PBS. Appliquez une à deux gouttes de milieu Antifa sur la section et scellez-la immédiatement avec un lamelle. Incuber les lames à quatre degrés Celsius pendant 24 à 48 heures avant la microscopie pour assurer l’étanchéité.

Pour commencer la microscopie confocale, placez une lame sur la platine du microscope et sélectionnez l’objectif 63x. Après avoir ouvert le logiciel d’acquisition, cliquez sur configuration intelligente dans l’onglet acquisition et sélectionnez l’étage de quatre appropriés. Ici, dappy et Alexa, étage 5 55 sont utilisés.

Ensuite, cliquez sur le meilleur signal, puis sur Appliquer. Cliquez ensuite sur régler l’exposition pour permettre à l’ordinateur de déterminer les paramètres d’exposition optimaux Pour optimiser l’image, ouvrez la fenêtre des canaux et basculez l’image en direct. Ajustez la mise au point si nécessaire.

Cliquez ensuite sur un au pour optimiser le sténopé, ajustez le gain pour une meilleure intensité. Enfin, réglez le gain numérique entre deux et trois. Après cette optimisation, arrêtez l’image en direct et ouvrez la fenêtre du mode d’acquisition.

Ajustez la taille du cadre en cliquant sur X par Y et sélectionnez 10 24 par 10 24. Choisissez également une vitesse lente. Ensuite, ouvrez l’onglet Calcul de la moyenne et sélectionnez un nombre supérieur ou égal à quatre.

Cliquez ensuite sur le bouton d’accrochage et enregistrez l’image 2D capturée. Pour configurer l’imagerie 3D, ouvrez l’onglet de configuration intelligente et marquez l’élément de pile ZS, ce qui entraînera l’ouverture de la fenêtre de pile Zs. Pour définir la première et la dernière position du Zack, cliquez à nouveau sur en direct et ajustez la mise au point sur la position la plus haute de l’astrocyte.

Cliquez d’abord sur set. Ajustez maintenant la mise au point sur la position la plus basse de l’astrocyte, et cliquez sur régler en dernier, puis arrêtez la vue en direct. Ensuite, choisissez l’intervalle en cliquant sur optimal.

Pour définir le nombre de tranches ici, l’intervalle est de 1,01 micromètre. Enfin, cliquez sur démarrer, expérimentez et enregistrez les images une fois le scan terminé. Acquérez également une image 2D à l’aide d’un objectif 10 x ou 20 x.

Pour les mesures d’intensité de fluorescence, sélectionnez l’outil rectangle ou cercle dans la fenêtre d’image et mettez en surbrillance une zone de mesure pour quantifier le volume et la surface du noyau astrocytaire, du corps cellulaire et du territoire. Transférez les images 3D vers un logiciel d’analyse approprié, tel que Velocity 6.1 dans le logiciel d’analyse. Créez une nouvelle bibliothèque et faites glisser toutes les images vers la colonne grise de gauche.

Sélectionnez une image 3D et activez l’un des canaux d’intérêt acquis, tels que dapi. Pour les mesures nucléaires, ajustez manuellement la luminosité pour optimiser le contraste. Sélectionnez maintenant le menu des outils.

Choisissez Générer du volume et produisez une seule image 3D à partir des images Zack. Ouvrez le menu d’édition et cliquez sur propriétés. Assurez-vous que les propriétés X, Y et Z sont affichées.

Ensuite, choisissez l’outil ROI à main levée dans la barre d’outils. À l’aide de l’outil sélectionné, tracez une ligne autour du noyau marqué DPI pour mesurer le volume et la surface du noyau astrocytaire. Encore une fois, à l’aide de l’outil ROI à main levée, mesurez le volume et la surface de l’astrocyte entier en traçant une ligne autour du soma en suivant la surface de toutes les branches.

Cliquez sur le menu des mesures en haut de la fenêtre de l’image, faites glisser la recherche d’objets vers le haut de la fenêtre et donnez un nom descriptif à la première population, sélectionnez la couleur associée et cliquez sur mesure, ce qui ouvrira une nouvelle fenêtre. Dans cette nouvelle fenêtre. Choisissez le paramètre volume ou surface, puis cliquez sur OK.

Pour enregistrer les données, cliquez sur le menu de mesure et sélectionnez Créer un élément de mesure. Sélectionnez un nouvel élément de mesure appelé dans la fenêtre. Entrez un nom de fichier pour les données et cliquez sur OK.

Enfin, exportez les données de mesure vers un progiciel approprié pour effectuer une analyse statistique et générer des tracés de données. Ici, les chercheurs ont comparé les astrocytes dans le tissu cérébral fixe de rats traités avec de l’amyloïde bêta-1 40 ou avec de l’amyloïde bêta-1 40 et Ian. L’injection de traitement avec la protéine amyloïde a permis d’obtenir des astrocytes aux branches plus épaisses et plus longues.

Ces astrocytes d’animaux traités par Ian présentaient une forme étoilée avec des branches courtes et fines. Les rats traités par Ian ont également démontré une réduction de la fluorescence positive de l’astrocyte GFAP dans les tranches de cerveau. L’analyse morphométrique de volumes astrocytaires spécifiques a révélé que le volume du noyau astrocytaire, du corps cellulaire, de l’ensemble des astrocytes et du territoire astrocytaire était diminué avec le traitement Ian par rapport au traitement amyloïde seul.

Une fois cette image maîtrisée, la technique d’analyse peut être complétée en quelques minutes par cellule si elle est réalisée correctement. Lors de cette procédure, il est important de marquer la structure avec une grande précision. Il est préférable de s’entraîner à marquer manuellement la structure d’intérêt avant de commencer l’expérience après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire, de l’histologie et de la pathologie pour explorer la structure d’une cellule dans un contexte sain ou pathologique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la mesure de 12 paramètres différents pour une seule cellule à l’aide d’images 3D.