Protocole pour tridimensionnelle confocale Analyse morphométrique des astrocytes
11 décembre 2015
Les astrocytes du SNC modifient leurs propriétés fonctionnelles et structurelles en réponse à des stimuli nocifs. Ce rapport présente un protocole d’évaluation de la morphologie tridimensionnelle des astrocytes dans des états pathologiques ou après des interventions thérapeutiques.
L'objectif général de cette procédure est d'évaluer la morphologie des astrocytes en analysant des images tridimensionnelles d'astrocytes obtenues par microscopie confocale. Cette méthode peut être utilisée pour examiner les modifications morphologiques pouvant apparaître dans divers types cellulaires, soit dans des conditions pathologiques, soit en raison d'une stratégie d'intervention. Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité d'étudier simultanément de nombreux paramètres associés à l'architecture cellulaire.
Le Dr Mariam Bodel démontrera cette procédure après la préparation des lames pour la coloration immunohistochimique : déparaffiner les coupes en les immergeant deux fois dans du xylène pendant 10 minutes. Incuber les lames pendant 10 minutes dans chacun des milieux d'éthanol à 99,8 %, à 95 % et à 70 % pour réhydrater les coupes après lavage. Incuber les lames dans une solution d'anticorps primaire contre la protéine acide fibrillaire gliale, ou GFAP, diluée au 1/1500 dans du PBS, à quatre degrés Celsius, toute la nuit.
Après l'incubation, laver les sections dans le PBS trois fois pendant cinq minutes. Incuber ensuite les lames avec une solution d'anticorps secondaire conjugué à la phosphatase alcaline diluée au 1/100 pendant une heure à température ambiante. Laver à nouveau les sections dans le PBS trois fois pendant cinq minutes, moins de 30 minutes avant utilisation.
Ajouter une goutte de solution chromogène rouge à trois millilitres de tampon substrat. Incuber chaque lame dans 100 microlitres de cette solution pendant 15 à 20 minutes à l'abri de la lumière. Puis laver les lames dans du PBS 3 fois pendant cinq minutes.
Enfin, colorer les noyaux avec du DPI dilué au 1/500 dans du PBS. Appliquer une à deux gouttes de milieu Antifa sur la section et sceller immédiatement avec un couvre-objet. Incuber les lames à quatre degrés Celsius pendant 24 à 48 heures avant l'analyse microscopique afin de garantir un bon scellement.
Pour commencer la microscopie confocale, placez une lame sur la platine du microscope et sélectionnez l'objectif 63 x. Après avoir ouvert le logiciel d'acquisition, cliquez sur « smart setup » dans l'onglet d'acquisition et sélectionnez le bon fluorochrome parmi les options disponibles. Ici, DAPI et Alexa Fluor 555 sont utilisés.
Ensuite, cliquez sur meilleur signal, puis sur appliquer. Cliquez ensuite sur régler l'exposition pour permettre à l'ordinateur de déterminer les paramètres d'exposition optimaux. Pour optimiser l'image, ouvrez la fenêtre des canaux et passez l'image en direct. Ajustez la mise au point si nécessaire.
Ensuite, cliquez sur un point pour optimiser le diaphragme, puis réglez le gain pour obtenir l'intensité optimale. Enfin, réglez le gain numérique entre deux et trois. Après cette optimisation, arrêtez l'image en direct et ouvrez la fenêtre du mode d'acquisition.
Réglez la taille du cadre en cliquant sur X par Y et sélectionnez 10 24 par 10 24. Choisissez également une vitesse lente. Ensuite, ouvrez l'onglet de moyennage et sélectionnez un nombre supérieur ou égal à quatre.
Ensuite, cliquez sur le bouton de capture et enregistrez l'image 2D capturée. Pour configurer l'imagerie 3D, ouvrez l'onglet de configuration automatique et sélectionnez l'élément pile ZS, ce qui entraînera l'ouverture de la fenêtre de pile Zs. Pour définir les positions initiale et finale du Zack, cliquez à nouveau sur direct et ajustez la mise au point à la position la plus élevée de l'astrocyte.
Cliquez d'abord sur « définir premier ». Réglez ensuite le focus sur la position la plus basse de l'astrocyte, cliquez sur « définir dernier », puis arrêtez la visualisation en direct. Ensuite, choisissez l'intervalle en cliquant sur « optimal ».
Pour définir le nombre de coupes ici, l'intervalle est de 1,01 micromètre. Enfin, cliquez sur Démarrer, expérimentez et enregistrez les images une fois l'analyse terminée. En outre, acquérez une image 2D à l'aide d'un objectif 10 x ou 20 x.
Pour les mesures d'intensité de fluorescence, sélectionnez l'outil rectangle ou cercle dans la fenêtre d'image et surlignez une zone à mesurer afin de quantifier le volume et la surface du corps cellulaire du soma nucléaire de l'astrocyte ainsi que de son territoire. Transférez les images 3D vers un logiciel d'analyse approprié, tel que Velocity 6.1 dans le logiciel d'analyse. Créez une nouvelle bibliothèque et faites glisser toutes les images vers la colonne grise de gauche.
Sélectionnez une image 3D et activez l'un des canaux acquis d'intérêt, comme dapi. Pour les mesures nucléaires, ajustez manuellement la luminosité afin d'optimiser le contraste. Sélectionnez maintenant le menu outils.
Choisissez « make volume » et produisez une seule image 3D à partir des images Zack. Ouvrez le menu édition et cliquez sur propriétés. Assurez-vous que les propriétés X, Y et Z sont affichées.
Ensuite, sélectionnez l'outil de région d'intérêt (ROI) à main levée dans la barre d'outils. À l'aide de l'outil sélectionné, tracez une ligne autour du noyau marqué DPI afin de mesurer le volume et la surface du noyau de l'astrocyte. Utilisez à nouveau l'outil de ROI à main levée pour mesurer le volume et la surface de l'astrocyte entier en traçant une ligne autour du soma en suivant la surface de toutes les branches.
Cliquez sur le menu des mesures en haut de la fenêtre d'image, faites glisser l'outil de détection d'objets vers le haut de la fenêtre et attribuez un nom descriptif à la population un, sélectionnez la couleur associée, puis cliquez sur Mesurer, ce qui ouvrira une nouvelle fenêtre. Dans cette nouvelle fenêtre, choisissez soit le volume soit la surface comme paramètre, puis cliquez sur OK.
Pour enregistrer les données, cliquez sur le menu de mesure et sélectionnez créer un élément de mesure. Sélectionnez un nouvel élément de mesure dans la fenêtre. Saisissez un nom de fichier pour les données et cliquez sur OK.
Enfin, exportez les données de mesure vers un logiciel approprié afin d'effectuer une analyse statistique et de générer des graphiques. Ici, les chercheurs ont comparé les astrocytes dans des tissus cérébraux fixés provenant de rats traités avec l'amyloïde bêta un 40 ou avec l'amyloïde bêta un 40 et Ian. L'injection de traitement avec la protéine amyloïde a entraîné des astrocytes présentant des prolongements plus épais et plus longs.
Ces astrocytes provenant d'animaux traités par Ian présentaient une forme étoilée avec des prolongements courts et fins. Les rats traités par Ian montraient également une fluorescence positive pour la GFAP des astrocytes réduite dans les tranches cérébrales. L'analyse morphométrique de volumes spécifiques d'astrocytes a révélé que le volume du noyau de la cellule astrocytaire, du corps cellulaire de l'astrocyte entier et du territoire astrocytaire était diminué après traitement par Ian par rapport au traitement par amyloïde seul.
Une fois maîtrisée, cette technique d'analyse d'image peut être réalisée en quelques minutes par cellule, à condition d'être effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de marquer la structure avec une grande précision. Il est préférable de s'exercer à marquer manuellement la structure d'intérêt avant de commencer l'expérience, une fois son développement terminé.
Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans les domaines de la biologie cellulaire, de l'histologie et de la pathologie pour explorer la structure d'une cellule dans un contexte sain ou pathologique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la mesure de 12 paramètres différents pour une cellule unique à l'aide d'images 3D.
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Aperçu
Ce rapport présente un protocole permettant d'évaluer la morphologie des astrocytes en trois dimensions à l'aide de la microscopie confocale. La méthode permet d'analyser les modifications morphologiques des astrocytes dans des conditions pathologiques ou après des interventions thérapeutiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Pathologie
Contexte
- Les astrocytes dans le SNC présentent des modifications en réponse à des stimuli nocifs.
- La compréhension de la morphologie des astrocytes est essentielle pour l'étude de diverses affections neurologiques.
- Ce protocole permet l'analyse simultanée de plusieurs paramètres de l'architecture cellulaire.
- La microscopie confocale fournit des images tridimensionnelles à haute résolution.
Objectif de l'étude
- Évaluer la morphologie des astrocytes dans des conditions pathologiques.
- Analyser les effets d'interventions thérapeutiques sur la structure des astrocytes.
- Développer un protocole fiable pour l'analyse morphologique.
Méthodes utilisées
- Préparation des lames pour la coloration immunohistochimique.
- Déparaffinisation des coupes à l'aide de xylène.
- Rehydratation des coupes par des solutions d'éthanol à concentration décroissante.
- Incertion avec l'anticorps primaire anti-GFAP pour l'identification des astrocytes.
Résultats principaux
- Démonstration des changements morphologiques chez les astrocytes.
- Identification des altérations structurelles en réponse à des interventions.
- Validation du protocole pour des études futures.
Conclusions
- Le protocole évalue efficacement la morphologie des astrocytes.
- Les résultats contribuent à la compréhension des rôles des astrocytes dans la pathologie du SNC.
- Des applications futures pourraient améliorer les stratégies thérapeutiques contre les maladies neurologiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
L'évaluation quantitative de la morphologie des astrocytes permet une détection mécanistique des risques dans la validation des cibles neurodégénératives en reliant les changements structuraux aux interventions thérapeutiques. Cette approche morphométrique en confocal 3D renforce la fiabilité prédictive en phase de découverte précoce en fournissant des lectures multiparamétriques reflétant les réponses gliales spécifiques aux voies. La méthode améliore la continuité translationnelle des modèles in vitro ou in vivo vers la prise de décision préclinique grâce à des protocoles d'imagerie standardisés et reproductibles.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Interroge une hypothèse thérapeutique en quantifiant la remodélisation structurelle des astrocytes en réponse au bêta-amyloïde et aux stratégies d'intervention.
- Valeur opérationnelle : Permet une validation fonctionnelle de la cible grâce à une analyse multiparamétrique de la réactivité gliale, réduisant ainsi l'ambiguïté mécanistique dans l'engagement de la cible au niveau du SNC.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés pour des flux opérationnels en aval en établissant des phénotypes morphologiques de base et induits par une intervention.
- Valeur opérationnelle : Répond à la standardisation des tests et à la reproductibilité grâce à des sorties morphométriques quantitatives à 12 paramètres, adaptées à une utilisation en criblage à haut contenu.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Aborde la pertinence pathologique en modélisant la réactivité astrogliotique dans des tissus cérébraux de rat exposés à l'amyloïde, en lien avec les voies translationnelles de biomarqueurs dans la neurodégénérescence.
- Valeur opérationnelle : Décrit une démarche continue allant de la découverte à la validation préclinique, en permettant le suivi longitudinal des modifications structurales des astrocytes sous différentes conditions de traitement.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre à la continuité du processus de découverte, allant du test d'hypothèses à l'identification de composés candidats, en fournissant des données quantitatives sur la morphologie gliale qui orientent la sélection des cibles et la réduction des risques associés aux voies biologiques.
- Biologie de la découverte : Explique comment la méthode permet de tester des hypothèses, de clarifier des voies biologiques ou de réduire les risques biologiques grâce à un phénotypage structural des astrocytes dans des contextes pathologiques et d'intervention.
- Écrantage : Décrit la prêts-à-l'emploi du test, sa reproductibilité ou ses sorties quantitatives, lorsque ces aspects sont appuyés par l'article via une imagerie 3D standardisée et une analyse multiparamétrique.
- Analytique : Met en évidence les mesures, les lectures ou les sorties statistiques permettant aux équipes de comparer différentes conditions, notamment le volume, la surface, la longueur et le nombre de branches, l'intensité de fluorescence et la densité.
- Recherche translationnelle : Relie la méthode à une continuité préclinique ou à un alignement sur des biomarqueurs uniquement lorsque la source le justifie par une modélisation de la réactivité des astrocytes pertinente pour la maladie.
- Réutilisation en milieu professionnel : Présente la méthode comme une capacité réutilisable plutôt que comme une technique à usage unique, grâce à des protocoles d'imagerie et d'analyse standardisés applicables à différents types cellulaires et conditions.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive, validation des cibles, réduction de l'ambiguïté mécanistique.
- Valeur opérationnelle : Normalisation, reproductibilité et évolutivité.
- Valeur stratégique : Décisions d'orientation plus pertinentes, efficacité du capital et réduction des risques biologiques en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation et décisions d'avancement ajustées au risque.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Compétences scientifiques requises en microscopie confocale, en coloration immunohistochimique et en analyse d'images 3D.
- Besoins en instrumentation et en infrastructure analytique, notamment un microscope confocal doté d'une fonction de prise de vues en coupes Z et un logiciel d'analyse 3D tel que Volocity.
- Exigences de standardisation entre équipes en matière de protocoles de coloration, de paramètres d'imagerie et de cohérence des mesures morphométriques.
- Considérations relatives à l'adaptation à divers systèmes modèles, incluant des préparations d'astrocytes in vivo et in vitro provenant de différentes espèces.
- Limites pratiques appuyées par les données de la littérature, notamment la nécessité d'un marquage manuel précis des structures et l'optimisation des paramètres d'imagerie pour le rapport signal sur bruit.
