Analyser la taille, la forme et la directionnalité des réseaux des Astrocytes induits

Nous présentons ici un protocole afin d’évaluer l’organisation de réseaux astrocytaires. La méthode décrite minimise la partialité de fournir des mesures descriptives de ces réseaux tels que le nombre d’éléments, taille, zone et la position dans un noyau. Anisotropie est évaluée par une analyse vectorielle.

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés concernant l’organisation des réseaux astrocytiques dans les structures cérébrales. Le principal avantage de cette technique est qu’elle propose une méthode impartiale pour compter les cellules d’étiquetage et documenter leur organisation anatomique au sein d’une structure définie. Ouvrez ImageJFIJI, sélectionnez le fichier désiré et cliquez sur OK dans la fenêtre d’options d’importation du bio-format.

Pour redéfinir une pile Z qui ne contiendra que les tranches optiques nécessaires à la pile Z finale, sélectionnez d’abord le projet STK et Z, puis cliquez sur le bouton pile dans la barre d’outils. Sélectionnez l’intensité maximale dans le réglage du type de projection. Enregistrez le fichier et nommez-le fichier pile.

Si le fichier d’imagerie contient plusieurs canaux, utilisez la couleur de l’image et divisez les canaux pour afficher uniquement le canal avec l’image du réseau astrocytique. Vérifiez les paramètres pixel de l’image en sélectionnant l’image, les propriétés, le pixel, avec un pour la dimension pixel. Utilisez ensuite l’outil de fond de soustract en ouvrant le processus et en soustrayant l’arrière-plan pour enlever l’étiquetage de biocytine de fond.

Utilisez la fonction d’aperçu pour définir le rayon de la boule roulante, qui est généralement réglé à 50 pixels. Si d’autres réductions de bruit sont nécessaires après l’étape de fond de soustract, sélectionnez le processus, le bruit et supprimez les valeurs aberrantes. Sélectionnez lumineux dans le paramètre valeurs aberrantes et utilisez la fonction d’aperçu pour définir le rayon et le seuil.

Soyez prudent en utilisant l’outil supprimer la surélevage, car il peut brouiller les données, comme indiqué ici. Ajustez le seuil à l’aide de l’image, ajustez, seuilz. Sélectionnez le mode par défaut et le mode B et W.

Cliquez sur appliquer. Convertissez l’image en une image binaire avec l’outil de processus binaire en sélectionnant le processus, binaire, et faire binaire. Enregistrez le fichier sous forme de fichier tiff et nommez-le fichier binaire.

Pour compter les cellules, définissez d’abord le type de mesure en cliquant sur analyser et définir la mesure. Sélectionnez ensuite l’option centroïde. Assurez-vous que le fichier binaire est ouvert à l’écran.

Encore une fois, ouvrez le menu d’analyse, et cette fois sélectionnez analyser les particules. Ensuite, sélectionnez le spectacle et les contours. Cela génère un nouveau fichier qui montre le résultat de la détection.

Optimisez les paramètres pour affiner la détection. Pour détecter uniquement les cellules, utilisez une valeur de taille comprise entre 30 et 6000, et la circularité entre zéro à un, où l’on définit un cercle parfait et zéro une forme aléatoire. Exécutez la détection en cliquant sur OK. Deux tableaux apparaîtront, un tableau intitulé résumé qui fournit le nombre de cellules détectées, et un tableau intitulé résultats qui fournit les coordonnées X et Y de chaque cellule.

Copiez les valeurs et coller dans une application de feuille de calcul. Enregistrez cette table sous la table de détection des noms. Un fichier avec une parcelle de cellules détectées apparaîtra également.

Enregistrez ce fichier sous forme de fichier tiff sous le fichier de détection de nom. Si un groupe de deux cellules étiquetées ou plus sont détectées comme une seule cellule avec l’outil analyser les particules, utilisez l’outil de bassin versant sur l’image binaire en sélectionnant le processus, binaire et bassin versant avant d’appliquer l’outil analyser les particules. Pour mesurer la surface des réseaux, utilisez le fichier de détection dans ImageJ.

Cliquez à gauche sur la souris pour sélectionner l’outil de sélection du polygone dans la barre d’outils. Cliquez à nouveau à gauche pour commencer à tracer une région d’intérêt, ou roi, qui relie toutes les cellules situées dans la périphérie externe du réseau. Cliquez à droite pour fermer le polygone.

Ouvrez la fenêtre de mesure définie et sélectionnez l’option zone. Ensuite, ouvrez le gestionnaire de roi et ajoutez le polygone tracé dans le gestionnaire de retour sur investissement en cliquant sur ajouter. Exécutez la mesure en cliquant sur la mesure dans le gestionnaire de retour sur investissement.

La mesure de zone apparaîtra dans un tableau et s’exprimera en pixels. N’oubliez pas de convertir cette valeur avec un facteur de conversion pour le microscope utilisé pour obtenir la valeur en micromètres carrés. Ouvrez le fichier pile dans ImageJFIJI et identifiez la cellule patchée avec son intensité d’étiquetage plus forte.

Ouvrez ensuite le fichier nommé table de détection dans une application de feuille de calcul, et trouvez le nombre associé à la cellule patchée et ses coordonnées correspondantes. S’il n’est pas en mesure de déterminer avec précision la cellule patchée, utilisez l’outil polygone pour entourer la zone où le dépôt de biocytine est plus dense, et se référer à cette position comme celle de la cellule patchée. Utilisez le gestionnaire roi comme avant pour tirer un retour sur investissement à l’emplacement patché de la cellule et l’ajouter au gestionnaire de retour sur investissement.

Ensuite, définissez la mesure et sélectionnez l’option centroïde. Dans le gestionnaire de la RIO, cliquez sur la mesure pour obtenir les coordonnées du centroïde de la zone tracée. Utilisez ces coordonnées comme point de référence pour ce réseau spécifique.

Utilisez cette formule pour calculer les coordonnées de chaque cellule en référence à l’astrocyte patché. L’expression des coordonnées de chaque cellule en référence à l’astrocyte patché est une étape importante pour calculer le vecteur à partir des astrocytes patchés. Utilisez cette formule pour calculer les coordonnées du principal vecteur d’orientation préférentielle.

Le principal vecteur d’orientation préférentielle du réseau est la somme de tous les vecteurs précédemment calculés pour chaque cellule constituée dans le réseau. Diviser la longueur du vecteur principal par le nombre de cellules du réseau, moins une pour exclure la cellule patchée, normaliser les valeurs et permettre des comparaisons entre les réseaux. Pour déterminer la position de chaque réseau dans le noyau d’intérêt, ouvrez d’abord l’image quatre x avec un éditeur d’image vectorielle.

Multipliez les dimensions de la fenêtre de dimension par cinq pour augmenter la taille de l’image quatre x. Ici, l’image a été échantillonnée à 800 par 800 pixels, et donc la résolution d’échantillonnage est changée à 4000 par 4000 pixels. Exportez le fichier en format tiff et nommez-le resized quatre x.

Alignez le coin supérieur gauche de l’image resized quatre x avec le coin inférieur gauche du document Adobe Illustrator. Le logiciel fournit des coordonnées à partir d’un point référentiel de coin inférieur gauche. Ouvrez l’image 20 x du réseau.

Utilisez le fichier binaire ou le fichier de détection parce qu’ils sont plus faciles à aligner. Ensuite, jouez avec l’outil d’opacité sur le fichier binaire de l’image 20 x pour l’aligner avec l’image resized quatre x. Lorsque l’alignement est terminé, sélectionnez et maintenez l’outil pipette de sorte que l’outil de mesure apparaît, et sélectionnez-le dans la barre d’outils gauche.

Utilisez l’outil de mesure pour cliquer sur le coin supérieur gauche de l’image 20 x pour obtenir les coordonnées du point référentiel de 20 x sur l’image resized quatre x. Ces coordonnées référentielles de 20 x sont utiles pour exprimer la position de chaque réseau sur un dessin schématique du noyau. Pour résumer les données, la normalisation du noyau en rectangle est utilisée.

Pour ce faire, utilisez l’outil polygone pour entourer le noyau de l’image resized quatre x. Ensuite, ouvrez le gestionnaire de roi et ajoutez le roi tiré. Utilisez l’image avec des lumières transparentes si les bordures du noyau ne peuvent pas être vues, auquel cas n’oubliez pas de la resize en premier.

Dans la mesure définie, sélectionnez l’option rectangle bondissant pour calculer le plus petit rectangle dans le noyau dessiné. Enfin, cliquez sur mesurer, puis suivez les étapes du protocole écrit pour exprimer les coordonnées des cellules étiquetées dans un noyau normalisé représenté par le rectangle bondissant. Un astrocyte unique dans la partie dorsale du noyau sensoriel principal trigeminal, étiqueté par SR101, a été visé pour l’enregistrement de cellules entières et rempli de 0,2% de biocytine.

La stimulation électrique du cinquième tract a augmenté l’étiquetage de biocytine dans la partie dorsale du noyau sensoriel principal trigeminal, représentant une augmentation du nombre de cellules couplées. Les réseaux astrocytiques restent confinés dans la partie dorsale du noyau sensoriel principal trigeminal et leur orientation principale. Cette technique a été développée pour positionner les réseaux astrocytiques dans une structure définie, mais peut être utilisée pour exprimer la position de la population de cellules étiquetées dans n’importe quelle structure.