Un outil analytique qui quantifie les changements de morphologie cellulaire en trois dimensions des images de fluorescence

L'objectif général de cette procédure est de fournir une méthode automatisée permettant d'analyser et de quantifier les modifications de la morphologie d'une cellule de forme non définie, issues d'images de fluorescence confocale tridimensionnelles. Cette méthode consiste tout d'abord à réaliser une expérience de stimulation chimique incluant des cellules traitées avec un agoniste, des cellules traitées avec un antagoniste puis un agoniste, ainsi que des cellules sans traitement. Les cellules sont ensuite préparées pour une analyse par immunofluorescence.

La deuxième étape consiste à acquérir des images de fluorescence tridimensionnelles multispectrales. Ensuite, une analyse morphométrique tridimensionnelle est réalisée à l'aide des logiciels informatiques Ameris Neuroscience, Ameris XT et MATLAB. Les changements phénotypiques au niveau de la cellule unique, visualisés par l'analyse morphométrique tridimensionnelle, sont ensuite analysés et quantifiés lors de la dernière étape.

En fin de compte, cette plateforme logicielle sert à quantifier les modifications de la forme cellulaire suite à l'activation d'un récepteur, offrant ainsi un outil supplémentaire pour la découverte de médicaments. En général, les chercheurs possèdent une expertise standard en systèmes biologiques, mais peuvent ne pas être familiers avec les applications informatiques. Dans ce protocole du module I 60, un pont est établi entre la visualisation et le langage informatique avant le début de cette procédure.

Transfecter des cellules de rein embryonnaire humain avec le récepteur deux de la corticolibérine marqué par l'hémagglutinine ou CRF R deux, comme indiqué dans le protocole écrit. Le CFR deux est un récepteur couplé à une protéine G ou RCPG. Le jour suivant la transfection, passer les lamelles à la flamme et les placer dans une plaque de six puits.

Ajoutez 10 millilitres de PBS à un flacon contenant 5 milligrammes de polylysine lyophilisée et mélangez. Ensuite, diluez 5 millilitres de polylysine dissoute dans 500 millilitres de PBS, puis ajoutez 2 millilitres du mélange sur chacun des lamelles. Laissez la plaque avec les lamelles à température ambiante pendant 20 minutes. Après 20 minutes, lavez les lamelles en ajoutant 2 millilitres de PBS puis en les retirant ; répétez ce processus deux fois.

Après ajout de deux millilitres de milieu DMEM contenant 10 % de FBS, déposer deux à cinq gouttes de cellules sur les lamelles. Les cellules doivent être à la concentration nécessaire pour atteindre une confluence de 60 %. Le lendemain.

Incuber les cellules pendant toute la nuit à 37 degrés Celsius le jour suivant. Vérifier que les cellules présentent une confluence de 60 % avant le traitement par l'agoniste. Stimuler les cellules désignées en remplaçant le milieu par deux millilitres de milieu supplémenté avec le ligand endogène du récepteur CRF R deux, le facteur de libération de la corticotropine, à une concentration de un micromolaire.

Incuber les cellules dans une étuve à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes afin de les prétraiter avec l'antagoniste. Remplacer le milieu par deux millilitres de milieu supplémenté en l'antagoniste sélectif de CFR2, l'anti-salvaging 30, à une concentration d'un micromolaire. Incuber les cellules dans une étuve à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Après le traitement par l'antagoniste. Stimuler les cellules avec l'agoniste CRF et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour les cellules non traitées. Remplacer le milieu par deux millilitres de milieu frais après le traitement.

Remplacer le milieu dans chaque puits par deux millilitres de milieu frais et ajouter l’anticorps anti-HHA dilué au millième, après une incubation de 60 minutes à 37 degrés Celsius. Aspirer le milieu puis ajouter deux millilitres de fixateur à chaque puits. Incuber la plaque à température ambiante pendant 20 minutes après avoir aspiré le fixateur.

Lavez les cellules trois fois avec du tampon salin au tris. Ajoutez 100 microlitres de solution sanguine au-dessus de chaque lamelle et incubez à température ambiante pendant 30 minutes. Aspirez ensuite la solution de blocage existante des puits et ajoutez 100 microlitres de cocktail d'anticorps secondaires frais sur chaque lamelle, suivi d'une incubation de 45 minutes à température ambiante à l'abri de la lumière. Lavez quatre fois avec du TBSC en ajoutant et en retirant délicatement la solution à partir de la paroi latérale du puits, tout en maintenant la solution de lavage final.

Prendre chaque lame à l’aide d’une aiguille et de pinces courbes. Placer la lame, les cellules orientées vers le bas, sur une lamelle contenant une goutte de milieu de montage vector shield avec dappy fix, fixer avec du vernis à ongles et laisser sécher de 15 à 20 minutes. Un anticorps secondaire marqué Alexa 488 nanomètre est utilisé pour visualiser CFR deux et la DAPI sert à visualiser les noyaux et les stades mitotiques. Ensuite, monter les cellules fixées sur un microscope à fluorescence. Pour limiter le biais expérimental, garder les conditions expérimentales inconnues jusqu’à ce que les images soient acquises et analysées.

Un objectif à immersion huile plan acro, équipé de contraste interférentiel différentiel (DIC), avec un grossissement de 63 x et une ouverture numérique de 1,4, a été utilisé en combinaison avec le microscope confocal Zeiss LSM 510 Meta relié à un système laser intégré à deux photons Coherent. Pendant le processus d'acquisition des données, compartimentalisez les cellules à la fois par multicanal et par partitionnement c pour inclure les données allant de la membrane nucléaire jusqu'aux extrémités des récepteurs extracellulaires. Traitez les données de fluorescence à l'aide d'Amaris, ce qui permet la visualisation et la segmentation d'un jeu de données microscopiques en 3D. Suivant l'algorithme conçu par Amaris, utilisez d'abord le rendu de surface pour représenter la membrane nucléaire NU.

Amaris déterminera s'il existe plus d'un noyau dans la région d'intérêt, ou ROI. Ensuite, utilisez l'algorithme de création de points pour localiser les deux points d'extension CFR. Pour compenser le bruit de fond et l'intensité irrégulière du réseau complexe de cellules à forme amorphe afin de maximiser l'inclusion de chaque unité de détection de fluorescence de CFR deux, réglez le diamètre des points à 0,2 micromètre, qui est l'unité la plus petite au sein de l'image.

Cela permet d'extrapoler des informations distinctes sous la forme d'une intensité mesurée. À l'aide d'un filtre gaussien, intégrez un filtrage des taches lors du processus automatisé de création des taches. Pour éviter la saturation des données, convertissez le jeu de données d'un format à virgule fixe de huit bits à un format à virgule flottante 32 bits.

Sélectionnez la surface créée et déterminez la position spatiale exacte de chaque point en dehors de la surface nucléaire en effectuant une transformation de distance en utilisant la membrane nucléaire comme point de référence. Échangez les données d'intensité des voxels contre des données de coordonnées de points à l'aide du module ameris XT interfacé avec MATLAB. Sélectionnez les points et sélectionnez le type statistique codé.

Choisissez le centre d'intensité indiqué dans le nouveau canal créé. Chargez la couleur souhaitée pour l'affichage et définissez la plage de la carte de couleurs pour l'analyse. Les données numériques peuvent être visualisées dans l'onglet statistique et exportées vers Excel à l'aide de GraphPad Prism.

Quantifiez les données obtenues et présentez-les sous forme graphique pour l'analyse statistique. Effectuez des comparaisons entre les groupes à l'aide d'une analyse de variance à deux facteurs (two-way Inova) et d'un test post-hoc de Bonferroni, en exprimant les données comme la moyenne ± l'écart type. Pour illustrer la puissance de cette approche, examinez les modifications cellulaires résultant de l'interaction entre les récepteurs couplés aux protéines G et le récepteur 2 de la corticolibérine (CRF receptor two) avec son ligand endogène CRF.

Dans les cellules HT K 2 93 transfectées, les images fusionnées ont été quantifiées et visualisées à l'aide d'un anticorps secondaire marqué à l’Alexa 4 88 anti-souris et du DPI pour visualiser les noyaux. Les résultats révèlent que les récepteurs CRF R deux se situent dans la membrane plasmique et s'étendent à partir de régions précises de la membrane des cellules. À l’aide d’une analyse conventionnelle en 2D, il est possible de détecter ce sous-ensemble de récepteurs CRF R deux extracellulaires uniquement si les points d’adhérence des récepteurs sur les lamelles de verre sont analysés.

Par conséquent, toute autre information dérivée des données MULTISPECTRALES empilées de ZS est perdue. Le résultat ne montre aucune différence entre l'absence de traitement et l'agoniste. Bien que les points d'adhérence des récepteurs soient nettement différents lorsque les cellules sont traitées avec le CRF, les récepteurs extracellulaires sont fortement réduits, comme en témoigne la diminution de la distance des taches par rapport à la membrane plasmique.

Ils sont également redistribués à partir d'emplacements principalement finis vers un certain nombre de sites distincts. L'effet du CRF sur la distribution membranaire des récepteurs est empêché par un prétraitement avec les antagonistes spécifiques du CR2. 30 30.

Dans ces conditions, les deux extensions de CRFR ne changent pas avec le traitement au CRF. La distribution distale des points tracés à des intervalles codés par couleur de cinq micromètres est utilisée pour visualiser la distance des voxels par rapport à la membrane nucléaire. Aucun traitement et un prétraitement par antagoniste avant le traitement par agoniste n'ont montré aucune différence significative dans la contraction des RCPG.

Le traitement des cellules avec l'agoniste CRF réduit progressivement le nombre de voxels contenant le CFR deux par rapport à l'absence de traitement ou par rapport aux cellules. Prétraitées avec l'antagoniste As après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des techniques d'imagerie de quantification pour explorer et caractériser de nombreux changements phénotypiques au niveau de la cellule unique, faisant de ce dosage cellulaire un outil complémentaire d'analyse à l'échelle de la cellule unique dans le processus de découverte de médicaments.