Un outil analytique qui quantifie les changements de morphologie cellulaire en trois dimensions des images de fluorescence

L’objectif global de cette procédure est de fournir une méthode automatisée pour analyser et quantifier les changements de morphologie d’une cellule de forme indéfinie à partir d’images confocales de fluorescence tridimensionnelles. Ceci est accompli en effectuant d’abord l’expérience de stimulation chimique pour inclure des cellules traitées avec des cellules agonistes, traitées avec un antagoniste, suivies d’agonistes et de cellules sans traitement. Les cellules sont ensuite préparées pour l’analyse par immunofluorescence.

La deuxième étape consiste à acquérir des images de fluorescence tridimensionnelles multispectrales. Ensuite, l’analyse morphométrique tridimensionnelle est réalisée à l’aide d’ameris neuroscience, d’ameris XT et du logiciel informatique MATLAB. Les changements phénotypiques unicellulaires visualisés par l’analyse morphométrique tridimensionnelle sont ensuite analysés et quantifiés comme étape finale.

En fin de compte, cette plate-forme logicielle est utilisée pour quantifier les changements de forme cellulaire suite à l’activation des récepteurs, fournissant ainsi un outil supplémentaire pour la découverte de médicaments. En général, les chercheurs ont une expertise standard en système biologique, peuvent ne pas être familiers avec les applications informatiques. Dans ce protocole du module I 60, comblez le fossé entre la visualisation et le langage informatique avant le début de cette procédure.

Transfect de cellules rénales embryonnaires humaines avec de l’hémagglutinine marquée au récepteur deux du facteur de libération de la corticotrophine ou CRF R deux, comme indiqué dans le protocole écrit. CFR 2 est un récepteur couplé aux protéines G ou RCPG. Le lendemain de la transfection, le couvercle de la flamme glisse et placez-les dans une plaque à six puits.

Ajoutez 10 millilitres de PBS dans un flacon de cinq milligrammes de polylysine lyophilisée et mélangez. Diluez ensuite cinq millilitres de polylysine dissoute dans 500 millilitres de PBS et ajoutez deux millilitres du mélange sur chacun des lamelles. Laissez la plaque avec les lamelles à température ambiante pendant 20 minutes Après 20 minutes, lavez les lamelles en ajoutant deux millilitres de PBS, puis en retirant, répétez ce processus deux fois.

Après l’édition de deux millilitres de DMEM avec un média 10 %FBS, ajoutez deux à cinq gouttes de cellules sur les bordereaux de protection. Les cellules doivent être à la concentration nécessaire pour atteindre une fluidité de 60 %. Le lendemain.

Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius le lendemain. Vérifiez que les cellules sont confluentes à 60 % pour le traitement par agonistes. Stimulez les cellules désignées en remplaçant les milieux par deux millilitres de milieux complétés par le facteur de libération de la corticotrophine à deux ligands endogènes CRF R à une concentration d’une micromolaire.

Incuber les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour que les cellules soient prétraitées avec un antagoniste. Remplacer le milieu par deux millilitres de milieu complété par le l’antagoniste sélectif CFR deux anti-salvation 30 à une concentration d’une micromolaire. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Après un traitement antagoniste. Stimulez les cellules avec l’agoniste CRF et incubez-le à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour les cellules non traitées. Remplacer le substrat par deux millilitres de substrat frais après le traitement.

Remplacez le milieu de chaque puits par deux millilitres de milieu frais et ajoutez de l’anti-HHA dilué de un à mille, après une incubation de 60 minutes à 37 degrés Celsius. Aspirez le support et ajoutez deux millilitres de fixateur à chacun. Bien incuber la plaque à température ambiante pendant 20 minutes après avoir aspiré le fixateur.

Lavez les cellules trois fois avec une solution saline tris-gonflée. Caïn. Ajoutez 100 microlitres de solution sanguine sur chaque couvercle, glissez et incubez à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, aspirez la solution de blotto existante des puits et ajoutez 100 microlitres de cocktail d’anticorps secondaires frais sur chaque lamelle après une incubation de 45 minutes à température ambiante dans l’obscurité, lavez-vous quatre fois avec du TBSC en ajoutant et en retirant doucement la solution de la paroi latérale du puits pendant qu’elle est encore dans la solution de lavage finale.

Ramassez chaque lamelle à l’aide d’une aiguille et d’une pince incurvée. Placez les cellules de la lamelle vers le bas sur une lame avec une goutte de support de montage Vector Shield avec un vernis à ongles et laissez-le sécher pendant 15 à 20 minutes. Alexa, 4 88 nanomètres conjugué muse l’anticorps est utilisé pour visualiser CFR deux et DAPI est utilisé pour visualiser les noyaux de l’étape mitotique pour commencer à monter les cellules fixes sur un microscope fluorescent afin de limiter la subjectivité expérimentale, garder les conditions expérimentales inconnues jusqu’à ce que les images soient acquises et analysées pour acquérir des images.

Un objectif DIC avec un grossissement de 63 x et une ouverture numérique de 1,4 a été utilisé en combinaison avec le microscope confocal zeis LSM de cinq 10 méta-caméras connecté à un système laser intégré cohérent à deux photons. Traitez les données de fluorescence à l’aide d’amris, qui permet la visualisation et la segmentation d’un ensemble de données de microscopie 3D. En suivant l’algorithme conçu par Amaris, utilisez d’abord le rendu de surface pour représenter la membrane nucléaire NU.

Amaris déterminera s’il y a plus d’un noyau dans la région d’intérêt, ou ROI. Ensuite, utilisez l’algorithme de création de spots pour localiser les deux spots d’extension CFR. Compense le bruit de fond et l’intensité irrégulière du réseau complexe de cellules de forme amorphe pour maximiser l’inclusion de chaque unité de détection de fluorescence de CFR deux, réglez le diamètre des spots à 0,2 micromètre, qui est la plus petite unité de l’image.

Cela permet d’extrapoler des informations distinctes sous la forme d’une intensité mesurée. À l’aide d’un filtre gaussien, intégrez le filtrage ponctuel dans le processus de création automatisé du spot. Pour éviter les cations de données, convertissez l’ensemble de données de huit bits à virgule fixe en 32 bits à virgule flottante.

Sélectionnez la surface créée et déterminez l’emplacement spatial exact de chaque point à l’extérieur de la surface nucléaire en effectuant une transformation de distance en utilisant la membrane nucléaire comme point de référence. Échangez les données d’intensité des voxels en données de coordonnées ponctuelles à l’aide du module ameris XT interfacé avec MATLAB. Sélectionnez les points et sélectionnez les statistiques codées dans le type statistique.

Choisissez le centre d’intensité indiqué dans le nouveau canal créé. Chargez la couleur souhaitée pour l’affichage et définissez la plage de couleurs pour l’analyse. Les données numériques peuvent être visualisées dans l’onglet statistique et exportées vers Excel à l’aide du prisme GraphPad.

Quantifier les données résultantes et les présenter sous forme graphique pour l’analyse statistique. Effectuez des comparaisons entre les groupes à l’aide des données post-test bidirectionnelles d’Inova et de Bonferroni sous forme de moyenne, plus ou moins l’écart-type. Pour démontrer la puissance de cette approche, les changements cellulaires qui résultent de l’interaction des récepteurs couplés aux protéines G et du récepteur deux du facteur de libération de la corticotrophine avec son ligand endogène CRF.

Dans les cellules transfectées HT K 2 93 ont été quantifiées, des images fusionnées sont visualisées à l’aide d’Alexa 4 88 conjugué, anti-souris, anticorps secondaire et DPI pour visualiser les noyaux. Les résultats révèlent que les récepteurs CRF R deux sont situés dans la membrane plasmique et projettent à partir de régions finies de la membrane des cellules. En utilisant l’analyse 2D conventionnelle, il n’est possible de détecter ce sous-ensemble de récepteurs extracellulaires CRF R deux que si les points d’adhésion des récepteurs sur les couvercles en verre sont analysés.

Par conséquent, toute autre information dérivée des données MULTISPECTRALES empilées ZS est perdue. Le résultat n’a choisi aucune différence entre l’absence de traitement et l’agoniste. Alors que les points d’adhésion des récepteurs sont radicalement différents lorsque les cellules sont traitées avec CRF, les récepteurs extracellulaires sont considérablement réduits, comme le montre la diminution de la distance entre les taches et la membrane plasmique.

Ils sont également redistribués d’emplacements principalement finis à un certain nombre d’endroits discrets. L’effet de la CRF sur la distribution de la membrane réceptrice est empêché par un prétraitement avec les deux antagonistes spécifiques de la CR. 30 30.

Dans ces conditions, les deux extensions du CRFR ne changent pas avec le traitement du CRF. La distribution distale des taches tracée dans des intervalles de cinq micromètres à code couleur est utilisée pour visualiser la distance des voxels par rapport à la membrane nucléaire. Aucun traitement et prétraitement par antagoniste avant le traitement par agoniste n’a montré de différence significative dans la contraction du RCPG.

Le traitement des cellules avec l’agoniste CRF réduit progressivement le nombre de CFR deux contenant des voxels par rapport à l’absence de traitement ou par rapport aux cellules. Prétraité avec antagoniste A après son développement. Cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine de la technique d’imagerie de quantification d’explorer et de caractériser de nombreux changements phénotypiques de cellules uniques, faisant de ce test basé sur la cellule un outil supplémentaire de profilage de cellules uniques pour le processus de découverte de médicaments.